זיהוי של התורם שיורית Erythroid ובתאים לאחר השתלת תא גזע Hematopoietic עבור חולים עם פתולוגיות של המוגלובין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר כימריזם בהקשר של השתלת תאי גזע. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום ההשתלות, כגון השתרשות של השתלת תאי גזע המטופויטיים עבור מטופלים עם המוגלובינופתיות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא משלבת מיון תאים המבוסס על ציטומטריית זרימה, בדיקת מידע בעמודות וניתוח עוקב של רצפי חזרות קצרים (STR) כדי להעריך את השגשוג וההתמיינות של תאי פרוגניטור במדור האריתרואידי.

השלכותיה של טכניקה זו משתרעות מעבר לטיפול בדחיית שתלים, כיוון שהיא עשויה לסייע בזיהוי מטופלים הרגישים לחזרת המחלה ולהוביל להטמעת אסטרטגיות של אימונומודולציה בהמשך. יתרה מכך, ניתן ליישמה במחקרי קליניים עתידיים, במחקר תאי גזע ובתכנון ניסויי טיפולים בעור. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן התהליך קשה ללמידה ויש לבצעו על ידי כוח אדם מיומן.

את הפרוצדורה תדגים אליזבת הופלנר, טכנאית במעבדתי. כדי להתחיל, הכינו תרחיף של תאים בודדים מדגימת מח המוגם לצורך צביעת שומן. לשם כך, הניחו מסנן תאים המכיל את מח המוגם והבריגו אותו על גבי מבחנה לצנטריפוגה.

השתמש בבוכנה של המזרק כדי לדחוף חתיכות רקמה דרך הרשת. כדי לאסוף את כל החומר, שטוף עם מספר מיליליטרים של בופר תליה (suspension buffer). הוסף שלושה מיליליטרים של תווך גרדיאנט (gradient medium) לשפופרת צנטריפוגה והנח בזהירות את תליה התאים הבודדים מעליו.

סבבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-550 G בטמפרטורה של 20 degree celsius למשך 30 דקות, כאשר ההאצה מוגדרת על תשע והבלימה על אפס. הסירו באמצעות פיפט את השכבה העליונה המכילה פלזמה וטבליות, תוך הקפדה על השארת שכבת התאים החד-גרעיניים ללא הפרעה בממשק. העבירו שכבה זו של תאים חד-גרעיניים למבחנה לצנטריפוגה.

בשלב הבא, שטפו את התאים עם 10 milliliters של suspension buffer. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-250 G בטמפרטורה של four degree celsius, למשך חמש דקות. השליכו את supernatant והחזירו את התאים לסספנסיה ב-two milliliters של complete isokov's modified dulbecco's medium, באמצעות פיפוט.

כדי לקבוע את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר, העברו 95 µL של צבע trypan blue בריכוז 2% לפלטת 96 בארות. הוסיפו 5 µL של תרחיף תאים, ערבבו היטב והדגירו בטמפרטורת החדר למשך זמן קצר. מלאו את ההמוציטומטר ובחנו אותו תחת מיקרוסקופ.

ספרו רק תאים חיוניים שנצבעו. לאחר מכן, סבבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה במהירות 250 G בטמפרטורה של 25 degree celsius למשך 10 דקות. כדי לחסום את קולטן ה-FC, השתמשו ב-2.5 micrograms של חומר חסימה לכל 100 microliters.

דגרו על קרח למשך 10 עד 15 דקות. הוסיפו את השילוב של נוגדנים מונוקלונליים שעברו טיטרציה מראש, בהתאם לנפח ששימש לצביעת התאים. דגרו בטמפרטורה של 4 °C בחושך למשך 20 דקות.

שטפו את התאים עם שלושה מיליליטר של תמיפת צביעה ולאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה. לאחר התאמת ריכוז התאים, העבירו את תגלה התאים למבחנה סטנדרטית לציטומטריית זרימה, באמצעות פפיטציה דרך מסנני תאים של 70 µl להסרת צברים.

הגדירו תבנית הכוללת תרשים דו-משתני להצגת פיזור קדמי (FSC) ופיזור צדי (SSC). כדי למקם את אוכלוסיית התאים הרלוונטית על הסקאלה, העבירו את התאים בממיין והתאימו את ה-FSC וה-SSC. התחילו בהקלטת הנתונים עבור מבחנת הביקורת השלילית, ולאחר מכן הקליטו את הנתונים עבור כל מבחנת ביקורת לפיצוי של צבע בודד וחשבו את הפיצוי.

לאחר מכן, הציגו את הדגימות הניסיוניות בתרשים פיזור דו-משתני של FSC ו-SSC כדי לכלול תאים לימפואידיים ומילואידיים כאחד. על ידי השוואת האותות השונים של ה-FSC, הסירו דאבלטים (doublets) וצבירים. לאחר מכן, הציגו את התאים הבודדים (singlets) המבטאים CD45 ו-CD36 בתרשים פיזור דו-משתני.

אירועים חיוביים ל-CD45 מייצגים לוקוציטים ואת תאי הפרוגניטור שלהם. אירועים שליליים ל-CD45 וחיוביים ל-CD36 מייצגים פרוגניטורים אריתרואידיים. כדי להגדיר תאים חיוביים ל-CD36 וחיוביים ל-CD45, השתמשו בכלי הגדרה (gating tools) ולאחר מכן הציגו את האירועים החיוביים ל-CD45 ותרשים פיזור (dot plot) נוסף המציג את הפרמטרים CD34 ו-SSC.

בשלב הבא, השתמש בכלי הגבייה (gating tools) כדי להגדיר את התאים החיוביים ל-CD34 או פרוגניטורים של לוקוציטים, ואת התאים בעלי SSC גבוה או תאי מיאלואיד בשלבים שונים של התמיינות. לאחר מכן, בחר את השערים (gates) למיון אל תוך מבחנות איסוף חיצוניות. לבסוף, המשך במיון התאים בטמפרטורה של 4 °C עד להשגת מספר התאים הרצוי.

דללו את התאים על ידי הוספת מצע IMDM מלא המועשר באריתרופויטין רקומביננטי אנושי או EPO. העבירו 300 microliters של התאים המדוללים לשלושה milliliters של מצע H4434 והדגירו תוך כדי ניעור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, זרעו שלוש צלחות בקוטר 35 millimeter עם מיליליטר אחד של תרחיף תאים בכל צלחת.

הניחו שתיים מצלוחות התרבית יחד עם צלחת שלישית מלאה במים בתוך פלטה של 100 מילימטר. גדלו תאים אלו באינקובטור עם לחות בטמפרטורה של 37 degree celsius, עם 5%carbon dioxide למשך 14 ימים. השתמשו במיקרוסקופ הפוך בהגדלה של 40x ובצלחת התרבית המסומנת בסריג לדירוג, כדי לדרג את המושבות על פי המורפולוגיה שלהן.

סווג את היחידות יוצרות המושבות או ה-CFU לתאי אב רב-פוטנציאליים, תאי אב של גרנולוציטים ומונוציטים, יחידות יוצרות התפרצות אריתרואידיות ותאים של יחידות יוצרות מושבות אריתרואידיות. ראשית, השב את התאים מה-fax או מלוחית בדיקת ה-CFU בהתאם לפרוטוקול הכתוב והמשך במיצוי DNA. לאחר סבוב התאים בצנטריפוגה, השתמש במכשיר אוטומטי לבידוד DNA מדם כדי לבודד חומצות גרעין מהמשקע.

מדדו את ריכוז ה-DNA באמצעות פלואורומטר. הכינו את הדגימות בהתאם להוראות היצרן ולאחר מכן הניחו את הדגימה בתא הדגימה של הפלואורומטר. הוסיפו DNA מדולל לתערובת של DNA polymerase, סט הפריימרים ותערובת התגובה להקמת תגובת PCR בהתאם למדריך.

כללו DNA של התורם והמקבל מלפני השתלה, וכן מים נטולי נוקליאז (nuclease free water) כביקורת שלילית, ו-9947A כביקורת חיובית. כדי לנתח את תוצאות ה-PCR, הוסיפו 10 µL של דגימות DNA דנטורליים לבארות של פלטת תגובה בעלת 96 בארות. אטמו את הפלטה, צנטריפוגו לזמן קצר והניחו את הפלטה על קרח.

פרוגניטורים של מגקריוציטים ואריתרוציטים מוינו כאוכלוסייה חיובית ל-CD36 ושלילית לאנטיגן CD45. בנוסף, תאים חיוביים ל-CD45 וחיוביים ל-CD34 זוהו כקודמים לימפואידיים-מיאלואידיים, ותאים חיוביים ל-CD45 עם אות SSC גבוה זוהו כתאים מיאלואידיים בוגרים. רמת הטוהר של תאי הפרוגניטור האריתרואידיים לאחר המיון הייתה מעל 85%, ורמת הטוהר של התאים המיאלואידיים הייתה מעל 95%. תאי מח עצם שהופרדו באמצעות חרוזי מגנט ספציפיים ל-CD34 תורבדו למשך 14 ימים.

חלק מתאים אלו נראים כמי ששוכפלים, מבדילים ועוברים קולוניזציה. גירוי בריכוזים שונים של EPO הגביר את היווצרותן של קולוניות אריתרואידיות אדומות בולטות. ניתוח PCR של רצפים קצרים חוזרים, או STRs, הספציפיים ל-DNA של המקבל והתורם, יכול לזהות כימריזם בתאים.

שיטה זו קבעה בהצלחה את כמות ה-DNA של המקבל לעומת התורם בתאים שהושגו ממיון של תאי מח עצם, כמו גם בתאים שהושגו מבדיקה קלונוגנית. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור כי טכניקה זו דורשת סטנדרטיזציה וביצוע על ידי כוח אדם שהוכשר בהתאם.

בעקבות הליך זה, ניתן לנתח עוד יותר תאי אב אריתרואידיים שרידיים מהתורם כדי לענות על שאלות נוספות, כגון היתרון הסלקטיבי של תאי גזע אריתרואידיים שתוקנו גנטית. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום השתלת תאי גזע לחקור את השגשוג וההתמיינות של תאי אב במדור האריתרואידי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הניטור של השתרשות לאחר השתלת תאי גזע במטופלים עם המוגלובינופתיות.