התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיק ביעילות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי משני סוגים שונים של תאי גזע עובריים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מקור לתאי גזע פלוריפוטנטיים להנדסת רקמות, מידול מחלות, מחקר בסיסי או מחקרי אורך. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתכנות מחדש וההבשלה של iPSCs מתרחשים בתנאים מוגדרים כימית תוך שהם זמינים מוקדם לטיפולים מבוססי תאי ילדים פוטנציאליים.

שידגים את ההליך הזה יהיו סטיבן מקללן, החוקר הראשי, ואני. השג שליה בהקדם האפשרי לאחר הלידה. חותכים קטע של תשעה סנטימטרים רבועים של מי השפיר, ושוטפים אותו בצינור צנטריפוגה של 50 מילימטר עם 30 מיליליטר PBS בתוספת תמיסה אנטיביוטית ואנטי-פטריית.

הסר קרישי דם מהממברנות, ולאחר מכן השתמש בזוג אזמלים עדינים כדי לטחון את הממברנות לחתיכות עדינות בצלחת תרבית רקמה סטרילית בגודל 10 סנטימטרים. השתמש בלהבי האזמל כדי להעביר את מסת רקמת הממברנה הטחונה לצינור דיסוציאציה רקמתי אחד המכיל 4.7 מיליליטר של מדיום RPMI-1640. מערבבים פנימה את אנזימי הדיסוציאציה.

הרכיבו את הצינור על מפרק הרקמות, והפעילו את h_tumor_01 התוכנית. לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על משטח נדנדה למשך 30 דקות. יש לדלל עוד יותר את המתלים עם 35 מיליליטר RPMI-1640, ולמרוח על מסננת 70 מיקרון המונחת על צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה למשך חמש דקות ב -200 פעמים גרם בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של RPMI-1640, וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. זרעו את התאים באשכולות תאים בצפיפות של כ-10,000 תאים לסנטימטר רבוע לתוך צלוחיות תרבית רקמה עם מדיום AFMC טרי שהוכן בתוספת תמיסה אנטיביוטית ואנטי-מיקוטית.

קצור תאי גזע מי שפיר ותאי גזע ממברנה עם מספר מעבר נמוך לתכנות מחדש מבקבוק T75 אחד על ידי הוספת שני מיליליטר של אנזים ניתוק תאים ליריעת התא. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שמונה דקות. לאחר צנטריפוגה ב -200 פעמים גרם למשך 45 דקות, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS, וערבבו היטב כדי לשטוף את רכיבי הסרום.

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן התאם את צפיפות התאים ל-100,000 תאים למיליליטר של PBS, וכעת מרובע לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הנח את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בצינורות פוליסטירן של חמישה מיליליטר כדי לאפשר צנטריפוגה בהגה נדנדה רגיל, וצנטריפוגה ב-200 פעמים גרם למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסיבוב, הפוך את הצינורות, והשליך את הסופרנטנט למיכל פסולת, ולאחר מכן בצע שלב צנטריפוגה נוסף ב-200 פעמים גרם למשך שלוש דקות. לאחר הסיבוב, השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שנותר מהצינורות. הנח קצות טרנספקציה, צינור, מאגר השעיה מחדש ומאגר אלקטרוליטי בארון תרבית הרקמות.

הזז את מכשיר הטרנספקציה קרוב כך שניתן יהיה למקם את תחנת הצינור שלו ישירות לתוך הארון. מלאו צינור טרנספקציה אחד בשלושה מיליליטר של מאגר אלקטרוליטי והרכיבו את הצינור לתוך התחנה על ידי דחיפתו עד הסוף בתוך החריץ. קח כמויות שהוכנו בעבר של תמיסת פלסמיד תכנות מחדש מתוך האחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס, ואפשר להם להפשיר בטמפרטורת החדר בארון התרבות.

הגדר את פרמטרי הטרנספקציה בהתקן כדי לספק פולס אחד של 40 מילישניות ב-950 וולט. השעו מחדש את הגלולה המכילה 100,000 תאים ב-10 מיקרוליטר של מאגר השעיה מחדש. בעבודה מהירה, הוסף 1/10 מתמיסת הפלסמיד המתכנת מחדש לתאים המושעים.

התקן את קצה הטרנספקציה על פיפטת הטרנספקציה. לאחר מכן שאפו את תרחיף התא לקצה הטרנספקציה בזהירות הימנעו מהיווצרות בועות אוויר. הכנס את פיפטת הטרנספקציה לתוך צינור הטרנספקציה.

ולחץ על כפתור ההתחלה על המסך במכשיר הטרנספקציה. המתן להודעת המסך לגבי הצלחת הטרנספקציה. ואז הסר את הפיפטה מהצינור מיד.

הוצא את המתלה לבאר אחת מלוחות שש בארות היעד. מערבבים את המדיום מבאר שכנה, ומחלקים את המתלה באופן שווה לשתי הבארות. חזור על הטרנספקציה עבור כל צינור מיקרו-צנטריפוגה עם תאים.

התחל בהוספת 30 מיקרוליטר של 0.5 מילי-מולרי EDTA, ו-PBS לחמישה צינורות PCR. לאחר מכן טען קצה על פיפטה של 10 מיקרוליטר המוגדרת לשני מיקרוליטר. החזיקו את קצה הפיפטה בזווית בקצה המושבה, וגרדו בזהירות ובהדרגה את כל המושבה מעל פני השטח.

שאפו מיד את כל המושבה לקצה הפיפטה, והעבירו אותה לאחד מצינורות ה-PCR המוכנים עם EDTA. לאחר חזרה על התהליך עם ארבע מושבות אחרות, דגרו בטמפרטורת החדר למשך ארבע עד שש דקות. השתמש בקצה פיפטה גדול יותר כדי להעביר כל תרחיף תא למעלה ולמטה בעדינות כדי לפרק את המושבה לגושים קטנים יותר.

הימנע מיצירת מתלה חד-תאי. לאחר מכן צלחת את המתלה ישירות לבאר המטרה של צלחת 24 בארות מצופה ויטרונקטין רקומביננטי. לאחר חזרה על התהליך עבור המושבות הנותרות, יש לדגור במשך שלושה עד שישה ימים.

לאחר ארבעה עד שישה ימים, כאשר המושבות גדלו והפכו קומפקטיות, שטפו את יריעות התאים עם 300 מיקרוליטר של 0.5 מילי-מולרי EDTA, ושאבו מיד. לאחר מכן מוסיפים עוד 300 מיקרוליטר, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר שאיבת ה-EDTA, הגדר פיפטה של מיליליטר אחד לקיבולת, הרכיב לקצה קדח רחב של מיליליטר אחד ושאב מדיום E8 מבאר המטרה של צלחת שש בארות מצופה ויטרונקטין

יש להשפריץ זרם של המדיום בבאר אחת של לוחית המקור כדי לשטוף את תרבית ה-iPSC. לאחר מכן העבירו את התרחיף לבאר המטרה, ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק את המושבות לגושים של 20 עד 40 תאים. לאחר ציפוי כל התאים, ודא שהגושים מפוזרים באופן שווה על ידי נדנוד עדין וניעור הצלחת.

לאחר מכן החזירו את הצלחת לחממה לצורך הידבקות גוש וצמיחת מושבה. מי השפיר ותאי הגזע של הממברנה, המייצגים תאי מקור לתכנות מחדש, מציגים מורפולוגיה מזנכימלית טיפוסית מוארכת ובהירה פאזה. התאים רוכשים תכונות אפיתל לאחר שהם עוברים את המעבר המזנכימלי לאפיתל, מה שמוביל להיווצרות מושבות עם תאים דמויי אבן.

מושבות אלו מתפשטות ויוצרות מסות תאיות לא סדירות של תאי MET. בשלבים מאוחרים יותר של תכנות מחדש, מופיעות מושבות של תאים מתוכנתים מחדש לחלוטין, תאים הניתנים להבחנה בנפרד עם גבולות מוגדרים היטב. תאים מתוכנתים מחדש לחלוטין אלה נמצאים לצד מושבות MET רבות יותר.

שיבוט בוגר מבודד מתוכנת מחדש מוצג כאן. לאחר גזירה והתבגרות של iPSC, הם יכולים להיות נתונים לאפיון מפורט, ולכוון את ההתמיינות למגוון סוגי תאים. אל תשכח שעבודה עם רקמות אנושיות שלא נבדקו לנוכחות פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי ועבודה בארון הבטיחות הביולוגית בעת ביצוע הליך זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לפלוריפוטנטיות בתאי גזע עובריים, באילו ריאגנטים וציוד להשתמש, וכיצד לתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים באופן שגרתי.