התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק ביעילות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs) באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי משני סוגים שונים של תאי גזע עובריים. שיטה זו יכולה לספק מקור של תאי גזע פלוריפוטנטיים עבור הנדסת רקמות, מודלים של מחלות, מחקר בסיסי או מחקרים אורכיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהתכנות מחדש והבשלת ה-iPSCs מתרחשים בתנאים מוגדרים כימית, תוך שהם זמינים בשלב מוקדם לטיפולים פוטנציאליים מבוססי תאים עבור ילדים.

את הפרוצדורה הזו ידגמימו סטיבן מקללן, החוקר הראשי, ואני. השגו שליות בהקדם האפשרי לאחר הלידה. גזרו מקטע של תשעה סנטימטרים רבועים מהאמניון, ושטפו אותו במיכל צנטריפוגה של 50 מיליליטר עם 30 מיליליטר של PBS בתוספת תמיסת אנטיביוטיקה ואנטימיקוטית.

הסיר קרישי דם מהקרומים, ולאחר מכן השתמש בזוג סכילי ניתוח עדינים כדי לקצוץ את הקרומים לחתיכות קטנות בתוך צלחת תרבית רקמה סטרילית בקוטר 10 סנטימטרים. השתמש בלהבי הסכין כדי להעביר את מסת רקמת הקרומים הקצוצה לתוך מבחנה אחת לפירוק רקמות המכילה 4.7 milliliters של מצע RPMI-1640. ערבב פנימה את אנזימי הפירוק.

הרכב את המבחנה על המכשיר לפירוק רקמות (tissue dissociator), והפעל את תוכנית h_tumor_01. לאחר מכן, דגור את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C על פלטפורמה נדנדת למשך 30 דקות. דלל את התושה באופן נוסף עם 35 milliliters של RPMI-1640, והעבר אותה דרך מסננת של 70 מיקרון המונחת מעל מבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר.

סובבו במערך צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 ×g בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את המשקע (pellet) בחמישה מיליליטר של RPMI-1640, וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. זרעו את התאים בצבירים (clusters) בצפיפות של כ-10,000 תאים לסנטימטר רבוע לתוך בקבוקרי תרבית רקמה עם מצע AFMC שהוכן טרי ותומחר בתמיסות אנטיביוטיקה ואנטימיקוטית.

קצרו תאי גזע מנוזל מי שפיר ומקרומים בעלי מספר מעבר נמוך לצורך תכנות מחדש מבקבוק T75 אחד, על ידי הוספת שני מיליליטרים של אנזים לניתוק תאים לשכבת התאים. הדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש עד שמונה דקות. לאחר סנטריפוגציה ב-200 ×g למשך 45 דקות, השעיקו מחדש את המשקע במיליליטר אחד של PBS, וערבבו היטב כדי לשטוף את מרכיבי הסרום.

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, התאימו את צפיפות התאים ל-100,000 תאים למיליליטר של PBS, וחלקו אותם לארבעה מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הניחו את מבחנות המיקרו-צנטריפוגה בתוך מבחנות פוליסטירן בנפח חמישה מיליליטר כדי לאפשר סבוב בצנטריפוגה עם רחף (swing rudder), וסובבו במהירות של 200 ×g למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסבב, הפכו את המבחנות, השליכו את הנוזל העליון למכל פסולת, ובצעו שלב צנטריפוגה נוסף ב-200 $\times$g למשך שלוש דקות. לאחר הסבב, השתמשו בפיפט של 200 $\mu$L כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שנותר במבחנות. הכניסו את טיפי התעתוק, את המבחנה, את בופר השספנסיה ואת הבופר האלקטרוליטי לקבוב תרביות הרקמה.

הזיזו את מכשיר הטרנספקציה קרוב כך שניתן יהיה להציב את תחנת המבחנות שלו ישירות בתוך תא המטבע. מלאו מבחנה אחת לטרנספקציה בשלושה מיליליטרים של בופר אלקטרוליטי, והחליקו את המבחנה לתוך התחנה על ידי דחיפתה עד הסוף לתוך החריץ. הוציאו מנשמרת של מינוס 80 מעלות צלזיוס מנות מוכנות מראש של תמיסת פלסמיד לתכנות מחדש, והניחו להן להפשיר בטמפרטורת החדר בתוך תא המטבע.

הגדירו במכשיר את פרמטרי התעתוק (טרנספקציה) למתן פולס אחד של 40 milliseconds במתח של 950 volts. השעיקו מחדש את המשקע המכיל 100,000 תאים ב-10 microliters של בופר השעייה מחדש. תוך כדי עבודה מהירה, הוסיפו 1/10 מתמיסת הפלסמיד לתכנות מחדש (reprogramming plasmid) לתאים שהושעו מחדש.

הרכב את טיפ הטרנספקציה על פיפטת הטרנספקציה. לאחר מכן, שאב את תרחיף התאים אל תוך טיפ הטרנספקציה תוך הימנעות זהירה מיצירת בועות אוויר. הכנס את פיפטת הטרנספקציה אל תוך מבחורת הטרנספקציה.

לחצו על כפתור ההפעלה (start) במסך של מכשיר הטרנספקציה. המתינו להודעה על המסך המאשרת את הצלחת הטרנספקציה. לאחר מכן, הוציאו מיד את הפ pipette מהמבחנה.

העבירו את התססוף לבאר אחת בלוחות היעד בעלי שש בארות. ערבבו עם המצע מבאר סמוכה, וחלקו את התססוף באופן שווה בין שתי הבארות. חזרו על פעולת הטרנספקציה עבור כל מבחנה עם תאים.

התחילו בהוספה של 30 µL של 0.5 mM EDTA ו-PBS לחמישה מבחנות PCR. לאחר מכן, העמיסו טיפ על פיפט של 10 µL המכוון לשני µL. החזיקו את טיפ הפיפט בזווית בקצה המושבה, וגרדו בזהירות ובהדרגה את כל המושבה מהמשטח.

שאבו מיד את כל המושבה לתוך טיפ הפ pipette, והעבירו אותה לאחד משפופרות ה-PCR שהוכנו עם EDTA. לאחר חזרה על התהליך עם ארבע מושבות נוספות, דגרו בטמפרטורת החדר למשך ארבע עד שש דקות. השתמשו בטיפ pipette גדול יותר כדי לשאוב כל תרחיף תאים מעלה ומטה בעדינות, במטרה לפרק את המושבה לגושים קטנים יותר.

הימנעו מיצירת סספנזיה של תאים בודדים. לאחר מכן, זרעו את הסספנזיה ישירות אל הבאר המיועדת בלוח 24 בארות המצופה ב-vitronectin רקומביננטי. לאחר חזרה על התהליך עבור שאר המושבות, דגרו למשך שלושה עד שישה ימים.

לאחר ארבעה עד שישה ימים, כאשר המושבות גדלו והפכו לדחוסות, שטפו את שכבות התאים ב-300 µL של 0.5 mM EDTA, ושאבו את הנוזל מיד. לאחר מכן, הוסיפו 300 µL נוספים, והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר שאיבת ה-EDTA, כווןו פיפט של 1 mL לקיבולת המקסימלית, התקינו קצה רחב (wide bore tip) של 1 mL, ושאבו מzיוון E8 מהבאר המטרה בלוח שש בארות מצופה בויטרונקטין (vitronectin).

התיזו זרם של מצע לתוך באר אחת בלוחית המקור כדי לשטוף את תרבית ה-iPSC. לאחר מכן, העבירו את התהויה לבאר היעד, ובצעו פיפטינג (שאיבה ושחרור) מספר פעמים כדי לפרק את המושבות לצברים של 20 עד 40 תאים. לאחר זריעת כל התאים, ודאו שהצברים מפוזרים באופן אחיד על ידי ניעור עדין של הלוחית.

לאחר מכן, החזירו את הפלטה לאינקובטור לצורך היצמדות הגושים וצמיחת מושבות. תאי הגזע של מי השפיר והקרומים, המהווים את תאי המקור לתכנות מחדש, מציגים מורפולוגיה מזנכימלית טיפוסית, מוארכת ובהירה תחת מיקרוסקופ פאזה. התאים רוכשים תכונות אפיתליאליות לאחר שהם עוברים מעבר ממזנכימלי לאפיתליאלי (mesenchymal-to-epithelial transition), המוביל להיווצרות של מושבות המורכבות מתאים דמויי ריצוף.

מושבות אלו מתרבות ויוצרות מסות תאיריות לא סדירות של תאי MET. בשלבים מאוחרים יותר של התכנות מחדש, מופיעות מושבות של תאים שעברו תכנות מחדש מלא, שהם תאים הניתנים להבחנה באופן פרטני עם גבולות מוגדרים היטב. תאים אלו, שעברו תכנות מחדש מלא, נמצאים לצד מושבות MET שהן רבות יותר.

כאן מוצג שיבוב בוגר מבודד שעבר תכנות מחדש מלא. בעקבות גזירה של iPSC והבשלתם, ניתן להעבידם לאפיון מפורט, ולהכווין את התמיינותם למגוון סוגי תאים. אין לשכוח כי עבודה עם רקמות אנושיות שלא נבדקו לנוכחות פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון ציוד מיגון אישי ועבודה במabilis בתוך קבבית בטיחות ביולוגית בעת ביצוע הליך זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן להשרות פלוריפוטנטיות בתאי גזע עובריים, באילו ריאגנטים וציוד יש להשתמש, וכיצד לתרבת תאי גזע פלוריפוטנטיים באופן שגרתי.