יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

המטרה הכללית של טכנולוגיה זו היא להשתמש בראייה ממוחשבת כדי לזהות באופן אוטומטי תאים פלואורסצנטיים ולבצע patch clamp אוטומטי של תאים אלו בחתכים מוחיים חריפים. שיטה זו יכולה לסייע בהתגברות על קשיים מרכזיים בתחום האלקטרופיזיולוגיה של patch clamp, כגון זיהוי, תחקור ו-patch clamp של תאים המסומנים פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לזהות באופן אוטומטי פיפטות patch ותאים פלואורסצנטיים, ולשלב את השלבים הללו עם patch clamp אוטומטי.

חידוש זה מגדיל משמעותית את התפוקה הניסונית. ההשלכות של טכניקה זו הן לכיוון טיפול או אבחון של הפרעות נוירולוגיות, מכיוון שניתן להשתמש ב-patch clamp אוטומטי מונחה-תמונה בעל תפוקה גבוהה לסריקות פרמקולוגיות בהכנות נוירונליות פיזיולוגיות יותר. ניתן להחיל שיטה זו גם על הכנות in vitro אחרות, כגון תרביות של אורגנלות נוירונליות טיפוסיות או תרביות פרוסות, נוירונים מופרדים וכן כל תא שאינו נוירונלי.

כדי להתחיל בהליך זה, הפעילו את המגבר, את בקר המיקרוסקופ ואת בקר המניפולטור. לאחר מכן, הריצו את Autopatcher IG באמצעות python מטרמינל של שורת הפקודה, ראשית על ידי שינוי הסבייה (directory) שבה מותקן Autopatcher IG. לאחר מכן, הקלידו Python Autopatcher_IG.

הקלידו PYW במסוף שורת הפקודות ולחצו על מקש ה-Enter. לאחר מכן, מלאו את כל הפיפטה מזכוכית בתמיסה פנימית והניחו אותה על ראש המיקרוסקופ. העבירו את קצה הפיפטה לשדה הראייה של המיקרוסקופ והביאו אותו לפוקוס.

אם נעשה שימוש بلوח החייג כדי להזיז את המניפולטורים בבמה של המיקרוסקופ, יש לעדכן את הקואורדינטות על ידי לחיצה על Z במקלדת. הכיול הראשוני ממיר את הזווית ומרחק התנועה של המניפולטור למערכת הקואורדינטות של המיקרוסקופ. המניפולטור נע בשלושה כיוונים במרחקים שנקבעו מראש, והתוכנה מזהה את הקואורדינטות של קצה הפיפט בתוך שדה הראייה של המיקרוסקופ.

לחצו על כפתור התחלת הכיול (start calibration) בממשק הגרפי הראשי עבור היחידה המתאימה שעליה טעונה הפפטה. לאחר מכן, שמרו את הכיול על ידי לחיצה על שמירת כיול (save calibration) בתחתית הממשק הגרפי הראשי. כיול ראשוני זה נדרש לביצוע פעם אחת בלבד, אלא אם כן חל שינוי בארגון הפיזי של המערך.

בשלב זה, הניחו פרוסה אחת של המוח במרכז תא ההקלטה. ייצבו את פרוסת המוח באמצעות תפס ייצוב או נבל (harp). כדי לזהות את התא הפלואורסצנטי, אתרו את האזור המבוקש תחת הגדלה של פי ארבעה.

לאחר מכן, הזו את במת המיקרוסקופ על ידי הפעלת מצב "לחץ כדי להזיז" (click to move) ולחיצה על מרכז האזור המעניין. לחלופין, ניתן להשתמש במקלדת כדי להזיז את במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, עברו לעדשה בעלת הגדלה גבוהה וכוונו את הפוקוס על ידי הזזת המיקרוסקופ בציר Z באמצעות מקשי RF במקלדת.

התוכנה מנחה את המיקרוסקופ ואת המצלמה ללכוד סדרה של תמונות בעומקים שונים. לאחר מכן, תמונות אלו עוברות עיבוד באמצעות ראייה ממוחשבת כדי לאתר תאים המסומנים פלואורסצנטית. הפלט הסופי הוא רשימה של קואורדינטות התאים שזוהו.

לחצו על כפתור detect cell בעמודת ממשק המשתמש הראשית unit zero. אם לא ניתן לשלוט במקור האור מסוג LED או בלייזר של המערכת באמצעות אות ה-TTL, הדליקו את ה-LED או את הלייזר באופן ידני. כבו את ה-LED או את הלייזר במידת הצורך.

רשימה של קואורדינטות תאים תופיע בממשק הגרפי (GUI) של מיקומי הזיכרון. הסר תאים שאינם רצויים מהרשימה על ידי לחיצה על כפתור ה-X לצד הקואורדינטות. לחלופין, אם תאי המטרה אינם מסומנים פלואורסצנטית, לחץ על מצב עכבר בממשק הגרפי הראשי.

לאחר מכן, לחצו על התא הרלוונטי; נקודה צהובה עם מספר תופיע על התא, וקואורדינטות התא יופיעו בממשק הגרפי (GUI) של מיקומי הזיכרון. כדי לבצע כיול משני לצורך זיהוי קואורדינטות ההיסט (offset) של הפיפט, מלאו 1/3 מפיפט זכוכית בתמיסה פנימית. לאחר מכן, התקינו את הפיפט על תושבת הפיפט המחוברת לבמה של הראש.

בהגדלה נמוכה, השתמשו במקשים אחת ושתיים במקלדת כדי לעבור בין יחידה אחת ליחידה שתיים. לאחר מכן, הכניסו את הפיפט לשדה הראייה וכוונו את המיקוד באמצעות המקלדת. בשלב הבא, טענו את הכיול הראשוני על ידי לחיצה על load calibration.

העבירו את עדשת המיקרוסקופ להגדלה גבוהה ולחצו 40 פעמים בממשק המשתמש הראשי (GUI). הביאו את קצה הפפית למרכז. לאחר מכן, לחצו על כפתור הכיול המשני בממשק המשתמש הראשי, תחת היחידה שבשימוש.

כדי לבצע patch לתא מטרה, לחצו על כפתור בקרת ה-patch כדי לפתוח את ממשק המשתמש (GUI) של בקרת ה-patch. לחצו על כפתור go to ליד התא הרלוונטי ברשימת הקואורדינטות בממשק המשתמש של מיקומי הזיכרון. לאחר מכן, לחצו על כפתור ה-CTM של היחידה בממשק המשתמש הראשי כדי לאפשר תנועה.

לחצו על התא הרצוי כדי להזיז את קצה הפ pipette אל התא. בשל מגבלה מכנית של המניפולטור, בעת תנועה למרחק העולה על 500 micrometer, עלולה להתרחש שגיאת מיקום קלה. כדי למנוע שגיאת מיקום מכנית משמעותית, יש לבצע כיול משני בקרבת תא המטרה.

לאחר מכן, השתמש בכפתור בחירת היחידה (unit one selected) כדי להחליף את אות הקלט בין שתי היחידות. לחץ על כפתור ה-patch בממשק הגרפי (GUI) של בקרת ה-patch. תהליך ה-patch האוטומטי יתחיל, וניתן יהיה לנטר את הלחץ וההתנגדות בממשק הגרפי של בקרת ה-patch.

אלגוריתם הטלאי (patching) האוטומטי מנטר את ההתנגדות ושולט בלחץ באמצעות סדרה של לולאות לוגיות, כדי ליצור gigaseal. חלון קופץ מודיע על היווצרויות של gigaseal. המערכת מנצלת שינוי בהתנגדות כדי לזהות מגע עם פני התא.

במקרה שבו מגע עם פני התא לא מזוהה בזמן, השתמש בכפתור next כדי להתקדם לשלב ה-patching תוך התמדה באותו ניסוי patching אוטומטי. ניתן לשלוט בתהליך האוטומטי בכל נקודה על ידי לחיצה על הכפתורים המתאימים בממשק הגרפי (GUI) של בקר ה-patch. לאחר מכן, בחר yes כדי לבצע פריצה (break-in) באמצעות שילוב של Zap ושאיבה.

לחלופין, בחרו ב-"no" כדי לבצע פריצה באמצעות שאיבה בלבד. לאחר מכן, שמרו את לוג פאץ' הניסוי. דמות זו מציגה את המיקומים שנבחרו כשהם טעונים בממשק הגרפי (GUI) של רצף הפקודות.

העמודה השמאלית מציגה את רשימת הקואורדינטות והעמודה הימנית מציגה את רשימת הפקודות בצורה של אותות TTL עבור כל מיקום. להלן צילומי מסך במהלך ניסוי יישום התרופה, המתאימים לשלושת המיקומים שנבחרו. תמיסת KCL ערבבה עם צבע פלואורסצנטי אדום למטרת ויזואליזציה.

יחידה אחת הייתה הפייט (pipet) המכילה KCl ויחידה שתיים הייתה פייט ה patched. באיור זה, הזרקות זרם מדורגות מראות נוירון בעל פריקה מחזורית (spiking). מוצגים כאן רישומי מתח (voltage clamp) מהבקיעה המקומית של תמיסת פוטסיום כלוריד בריכוז 500 millimolar בשלושה מיקומים.

העקבה האדומה עם זרם פנימה נרשמה מהניסוי שבו יישום ה-potassium chloride היה קרוב לתא ה-patch. החץ האדום מצביע על עיתוי יישום ה-potassium chloride. באמצעות שיטה זו, ניתן לבצע ניסוי patch clamp תוך ארבע דקות ללא הכשרה נרחבת בהשוואה ל-patching ידני.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אופטוגנטיקה, כימוגנטיקה ומניפולציות פרמקולוגיות, כדי לענות על שאלות הקשורות לפרויקט המחקר שלכם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לבצע מחקרי תפוקה גבוהה של רצפטורים סינפטיים ותעלות יונים בהכנות in vitro שונות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע ניסויי patch clamp אוטומטיים בהנחיית תמונה.