Name: יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למדו שיטת תיקון מהדק אוטומטי מודרך תמונה לחקר נוירונים בפרוסות מוח חריפות באמצעות טכנולוגיית ראייה ממוחשבת. שיטה זו מגבירה משמעותית את תפוקת הניסויים האלקטרופיזיולוגיים ומאפשרת סינון תרופתי יעיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה על התמיכה הכספית של קרן וייטהול. ברצוננו להודות לסמואל ט &#39;קיסינג&#39;ר על ההערות החשובות.

<ol><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li>
<li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li>
<li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630(2013).</li>
<li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACQ4%3A+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li>
<li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
</ol>

בקשה לפטנט לא זמני &quot;מערכות ושיטות לאוטומציה ממוחשבת של תיקון אלקטרומגנטי אוטומטי ב- VITRO,&quot; מס &#39;קטלוגי: 15 / 353,719 בארה&quot;ב, הוגש ב -16 בנובמבר 2016, Ref. לא. PRF 67270-02.

כאן, אנו מתארים שיטה אוטומטית התמונה מונחה תיקון קלימפ הקלטות במבחנה . השלבים העיקריים בתהליך זה מסוכמים כדלקמן. ראשית, ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות את קצה פיפטה באמצעות סדרה של תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ. מידע זה משמש לאחר מכן לחשב את הפונקציה שינוי הקואורדינטות בין המיקרוסקופ לבין מערכות לתאם מניפולטור. ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות תאים שכותרתו fluorescently כדי לזהות את הקואורדינטות שלהם. שלבים אלה משולבים עם מיקוד פיפטה ואלגוריתם תיקון אוטומטי באמצע...

הטכניקה מהדק תיקון פותחה לראשונה על ידי Neher ו Sakmann בשנות ה -70 ללמוד את הערוצים היוניים של ממברנות נרגש 1 . מאז, תיקון clamping הוחל על המחקר של נושאים שונים רבים ברמה התאית, הסינפטית והמעגלית - הן במבחנה והן ב- vivo - בסוגי תאים שונים, כולל נוירונים, קרדיומיוציטים, ביציות Xenopus וליפוזומים מלאכותיים 2 . תהליך זה כרוך זיהוי נכון ומיקוד של תא של עניין, שליטה micromanipulator מורכבים להעביר את פיפטה תיקון בקרבה לתא, היישום של לחץ חיובי ושלילי פיפטה בזמן הנכון להקים תיקון gigaseal הדוק, ואת הפריצה להקים תצורה שלמה תיקון התאים. תיקון clamping מתבצעת בדרך כלל ידני דורש הכשרה מקיפה כדי לשלוט. אפילו עבור חוקר מנוסה עם התיקוןמהדק, שיעור ההצלחה נמוך יחסית. לאחרונה, כמה ניסיונות נעשו כדי להפוך את הניסויים תיקון clamp. שתי אסטרטגיות עיקריות התפתחו כדי להשיג אוטומציה: הגדלת תקן מתקן מהדק תיקון לספק בקרה אוטומטית של תהליך התיקון ואת העיצוב של ציוד וטכניקות חדשות מהיסוד. האסטרטגיה לשעבר היא הסתגלות החומרה הקיימת ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים מהדק תיקון, כולל vivo עיוור תיקון מהדק 3 , 4 , 5 , מהדק תיקון במבחנה של פרוסות מוח חריפה, תרבויות פרוסה organotypic, נוירונים מנותקים תרבותית 6 . זה מאפשר חקירה של מעגלים מקומיים מורכבים באמצעות micromanipulators מרובים בו זמנית 7 . שיטת התיקון המישורית היא דוגמה לאסטרטגיית הפיתוח החדשה, אשר יכולה להשיג את התפוקה הגבוהה בו-זמניתאטך מהדק של תאים ההשעיה למטרות הסריקה תרופה 8 . עם זאת, שיטת תיקון מישורי אינו מתאים לכל סוגי התאים, במיוחד נוירונים עם תהליכים ארוכים או מעגלים שלמים המכילים חיבורים נרחבים. זה מגביל את היישום שלה כדי מיפוי מעגלים מורכבים של מערכת העצבים, המהווה יתרון מרכזי של הטכנולוגיה המסורתית תיקון מהדק. פיתחנו מערכת אשר ממכן את תהליך הידוק תיקון הידן במבחנה על- ידי הגדלת חומרה סטנדרטי תיקון מהדק. המערכת שלנו, Autopatcher IG, מספק כיול פיפטה אוטומטי, זיהוי תא פלואורסצנטי זיהוי, שליטה אוטומטית של תנועת פיפטה, תיקון אוטומטי כל התא, ואת נתוני רישום. המערכת יכולה באופן אוטומטי לרכוש תמונות מרובות של פרוסות המוח בעומקים שונים; לנתח אותם באמצעות ראיית מחשב; ו לחלץ מידע, כולל את הקואורדינטות של תאים שכותרתו fluorescently. מידע זה יכול להיותהמשמש לכוון תאים תיקון אוטומטי של עניין. התוכנה נכתבת בפייתון - שפת תכנות חופשית וקוד פתוח - באמצעות מספר ספריות קוד פתוח. זה מבטיח נגישות שלה חוקרים אחרים ומשפר את reproducibility וקשיחות של ניסויים electrophysiology. המערכת יש עיצוב מודולרי, כך חומרה נוספת יכולה בקלות להיות interfaced עם המערכת הנוכחית הפגינו כאן.

<table><tbody><tr><td>מצלמת CCD</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology Rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>כולל מיקרוסקופ ומניפולטורים. תוכנת בקרת המניפולטור שסיפק היצרן המודגמת בכתב יד זה היא " לינלאב 2".</td></tr><tr><td>מגבר</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>MultiClamp 700B</td><td>מגבר מיקרואלקטרודה מבוקר מחשב</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור LED</td><td>מגניב</td><td>pE-100</td><td>אורך גל 488 ננומטר</td></tr><tr><td>לוח רכישת נתונים</td><td>מחשוב מדידה</td><td>USB1208-FS</td><td>משני DAQ. ראה מדריך בכתובת: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>שסתומי סולנואיד</td><td>The Lee Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LHDA0531115H משאבת אוויר</td><td>תעשייה וירטואלית</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>חיישן לחץ אוויר</td><td>מוליכים למחצה בקנה מידה חופשי</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>החזקת</td><td>פרוסה מכשירי וורנר</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td> <td>ערכת עוגן פרוסה, שטוחה לתא RC-40, 2.0 מ"מ, 19.7 מ"מ</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>גרסה 2.7 (32 סיביות לחלונות)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>מסופי בורג</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>מסופי בורג 3.5 מ"מ פסיעה (2 פינים</td></tr><tr><td>) (2 פינים)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>תעלת N MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>שקעי DIP זנב הלחמה - 8 פינים</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - אדום בסיסי 5 מ"מ</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - ירוק בסיסי 5 מ"מ</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>שקע חשמל/מחבר חבית DC (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח מתאם קיר - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>חוט חיבור - מבחר (ליבה מוצקה, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>נעילת זכר x נקבה x נקבה Stopcock</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 צינורות גמישים</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>קוטר חיצוני: 1/8 אינץ' קוטר פנימי: 1/16 אינץ'.</td></tr><tr><td>BNC זכר ל BNC זכר כבל קואקסיאלי</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ohm נגד (5% סובלנות)</td> <td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

מהדק תיקון של כל התא הוא שיטה סטנדרטית זהב למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים בודדים. עם זאת, במבחנה תיקון מהדק נשאר מאתגר נמוך התפוקה הטכניקה בשל המורכבות שלה ואת ההסתמכות הגבוהה על פעולת המשתמש ושליטה. כתב יד זה מדגים תמונה מודרכת אוטומטית תיקון מערכת מהדק עבור במבחנה כולו תא תיקון ניסויים מהדק פרוסות המוח חריפה. המערכת שלנו מיישמת מחשב מבוסס חזון אלגוריתם כדי לזהות תאים שכותרתו fluorescently ו למקד אותם עבור תיקון אוטומטי מלא באמצעות micromanipulator ואת השליטה הפנימית פיפטה הלחץ. התהליך כולו הוא אוטומטי מאוד, עם דרישות מינימליות להתערבות אנושית. מידע ניסיוני בזמן אמת, כולל התנגדות חשמלית ולחץ פיפטה פנימי, מתועדים בצורה אלקטרונית לניתוח עתידי ולאופטימיזציה לסוגים שונים של תאים. למרות שהמערכת שלנו מתוארת בהקשר של בריאה חריפהN הקלטות פרוסה, זה יכול גם להיות מיושם על התמונה אוטומטית מודרך תיקון מהדק של נוירונים מנותקים, תרבויות פרוסות organotypic, וסוגים אחרים של תאים שאינם נוירונים.

<html> המערכת שלנו נבדקה על היכולת שלה תיקון תאים פרוסות מוח חריפה, עכבר המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) מובחנת לנוירונים, ו HEK 293 תאים באופן מלאכותי להביע ערוצים של עניין. איור 3 מראה ניסוי באמצעות Thy1-ChR2-YFP עכברים מהונדסים (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) מיקוד fluorescently שכותרתו שכבת 5 נוירונים פירמידליים בקליפה החזותית. תא המטרה היה אחד זיהו אוטומטית תאים ירוקים חיובי ניאון ( <strong class="xfig"...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

המטרה הכללית של טכנולוגיה זו היא להשתמש בראייה ממוחשבת כדי לזהות באופן אוטומטי תאים פלואורסצנטיים ולבצע patch clamp אוטומטי של תאים אלו בחתכים מוחיים חריפים. שיטה זו יכולה לסייע בהתגברות על קשיים מרכזיים בתחום האלקטרופיזיולוגיה של patch clamp, כגון זיהוי, תחקור ו-patch clamp של תאים המסומנים פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לזהות באופן אוטומטי פיפטות patch ותאים פלואורסצנטיים, ולשלב את השלבים הללו עם patch clamp אוטומטי.חידוש זה מגדיל משמעותית את התפוקה הניסונית. ההשלכות של טכניקה זו הן לכיוון טיפול או אבחון של הפרעות נוירולוגיות, מכיוון שניתן להשתמש ב-patch clamp אוטומטי מונחה-תמונה בעל תפוקה גבוהה לסריקות פרמקולוגיות בהכנות נוירונליות פיזיולוגיות יותר. ניתן להחיל שיטה זו גם על הכנות in vitro אחרות, כגון תרביות של אורגנלות נוירונליות טיפוסיות או תרביות פרוסות, נוירונים מופרדים וכן כל תא שאינו נוירונלי.כדי להתחיל בהליך זה, הפעילו את המגבר, את בקר המיקרוסקופ ואת בקר המניפולטור. לאחר מכן, הריצו את Autopatcher IG באמצעות python מטרמינל של שורת הפקודה, ראשית על ידי שינוי הסבייה (directory) שבה מותקן Autopatcher IG. לאחר מכן, הקלידו Python Autopatcher_IG.הקלידו PYW במסוף שורת הפקודות ולחצו על מקש ה-Enter. לאחר מכן, מלאו את כל הפיפטה מזכוכית בתמיסה פנימית והניחו אותה על ראש המיקרוסקופ. העבירו את קצה הפיפטה לשדה הראייה של המיקרוסקופ והביאו אותו לפוקוס.אם נעשה שימוש بلوח החייג כדי להזיז את המניפולטורים בבמה של המיקרוסקופ, יש לעדכן את הקואורדינטות על ידי לחיצה על Z במקלדת. הכיול הראשוני ממיר את הזווית ומרחק התנועה של המניפולטור למערכת הקואורדינטות של המיקרוסקופ. המניפולטור נע בשלושה כיוונים במרחקים שנקבעו מראש, והתוכנה מזהה את הקואורדינטות של קצה הפיפט בתוך שדה הראייה של המיקרוסקופ.לחצו על כפתור התחלת הכיול (start calibration) בממשק הגרפי הראשי עבור היחידה המתאימה שעליה טעונה הפפטה. לאחר מכן, שמרו את הכיול על ידי לחיצה על שמירת כיול (save calibration) בתחתית הממשק הגרפי הראשי. כיול ראשוני זה נדרש לביצוע פעם אחת בלבד, אלא אם כן חל שינוי בארגון הפיזי של המערך.בשלב זה, הניחו פרוסה אחת של המוח במרכז תא ההקלטה. ייצבו את פרוסת המוח באמצעות תפס ייצוב או נבל (harp). כדי לזהות את התא הפלואורסצנטי, אתרו את האזור המבוקש תחת הגדלה של פי ארבעה.לאחר מכן, הזו את במת המיקרוסקופ על ידי הפעלת מצב "לחץ כדי להזיז" (click to move) ולחיצה על מרכז האזור המעניין. לחלופין, ניתן להשתמש במקלדת כדי להזיז את במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, עברו לעדשה בעלת הגדלה גבוהה וכוונו את הפוקוס על ידי הזזת המיקרוסקופ בציר Z באמצעות מקשי RF במקלדת.התוכנה מנחה את המיקרוסקופ ואת המצלמה ללכוד סדרה של תמונות בעומקים שונים. לאחר מכן, תמונות אלו עוברות עיבוד באמצעות ראייה ממוחשבת כדי לאתר תאים המסומנים פלואורסצנטית. הפלט הסופי הוא רשימה של קואורדינטות התאים שזוהו.לחצו על כפתור detect cell בעמודת ממשק המשתמש הראשית unit zero. אם לא ניתן לשלוט במקור האור מסוג LED או בלייזר של המערכת באמצעות אות ה-TTL, הדליקו את ה-LED או את הלייזר באופן ידני. כבו את ה-LED או את הלייזר במידת הצורך.רשימה של קואורדינטות תאים תופיע בממשק הגרפי (GUI) של מיקומי הזיכרון. הסר תאים שאינם רצויים מהרשימה על ידי לחיצה על כפתור ה-X לצד הקואורדינטות. לחלופין, אם תאי המטרה אינם מסומנים פלואורסצנטית, לחץ על מצב עכבר בממשק הגרפי הראשי.לאחר מכן, לחצו על התא הרלוונטי; נקודה צהובה עם מספר תופיע על התא, וקואורדינטות התא יופיעו בממשק הגרפי (GUI) של מיקומי הזיכרון. כדי לבצע כיול משני לצורך זיהוי קואורדינטות ההיסט (offset) של הפיפט, מלאו 1/3 מפיפט זכוכית בתמיסה פנימית. לאחר מכן, התקינו את הפיפט על תושבת הפיפט המחוברת לבמה של הראש.בהגדלה נמוכה, השתמשו במקשים אחת ושתיים במקלדת כדי לעבור בין יחידה אחת ליחידה שתיים. לאחר מכן, הכניסו את הפיפט לשדה הראייה וכוונו את המיקוד באמצעות המקלדת. בשלב הבא, טענו את הכיול הראשוני על ידי לחיצה על load calibration.העבירו את עדשת המיקרוסקופ להגדלה גבוהה ולחצו 40 פעמים בממשק המשתמש הראשי (GUI). הביאו את קצה הפפית למרכז. לאחר מכן, לחצו על כפתור הכיול המשני בממשק המשתמש הראשי, תחת היחידה שבשימוש.כדי לבצע patch לתא מטרה, לחצו על כפתור בקרת ה-patch כדי לפתוח את ממשק המשתמש (GUI) של בקרת ה-patch. לחצו על כפתור go to ליד התא הרלוונטי ברשימת הקואורדינטות בממשק המשתמש של מיקומי הזיכרון. לאחר מכן, לחצו על כפתור ה-CTM של היחידה בממשק המשתמש הראשי כדי לאפשר תנועה.לחצו על התא הרצוי כדי להזיז את קצה הפ pipette אל התא. בשל מגבלה מכנית של המניפולטור, בעת תנועה למרחק העולה על 500 micrometer, עלולה להתרחש שגיאת מיקום קלה. כדי למנוע שגיאת מיקום מכנית משמעותית, יש לבצע כיול משני בקרבת תא המטרה.לאחר מכן, השתמש בכפתור בחירת היחידה (unit one selected) כדי להחליף את אות הקלט בין שתי היחידות. לחץ על כפתור ה-patch בממשק הגרפי (GUI) של בקרת ה-patch. תהליך ה-patch האוטומטי יתחיל, וניתן יהיה לנטר את הלחץ וההתנגדות בממשק הגרפי של בקרת ה-patch.אלגוריתם הטלאי (patching) האוטומטי מנטר את ההתנגדות ושולט בלחץ באמצעות סדרה של לולאות לוגיות, כדי ליצור gigaseal. חלון קופץ מודיע על היווצרויות של gigaseal. המערכת מנצלת שינוי בהתנגדות כדי לזהות מגע עם פני התא.במקרה שבו מגע עם פני התא לא מזוהה בזמן, השתמש בכפתור next כדי להתקדם לשלב ה-patching תוך התמדה באותו ניסוי patching אוטומטי. ניתן לשלוט בתהליך האוטומטי בכל נקודה על ידי לחיצה על הכפתורים המתאימים בממשק הגרפי (GUI) של בקר ה-patch. לאחר מכן, בחר yes כדי לבצע פריצה (break-in) באמצעות שילוב של Zap ושאיבה.לחלופין, בחרו ב-"no" כדי לבצע פריצה באמצעות שאיבה בלבד. לאחר מכן, שמרו את לוג פאץ' הניסוי. דמות זו מציגה את המיקומים שנבחרו כשהם טעונים בממשק הגרפי (GUI) של רצף הפקודות.העמודה השמאלית מציגה את רשימת הקואורדינטות והעמודה הימנית מציגה את רשימת הפקודות בצורה של אותות TTL עבור כל מיקום. להלן צילומי מסך במהלך ניסוי יישום התרופה, המתאימים לשלושת המיקומים שנבחרו. תמיסת KCL ערבבה עם צבע פלואורסצנטי אדום למטרת ויזואליזציה.יחידה אחת הייתה הפייט (pipet) המכילה KCl ויחידה שתיים הייתה פייט ה patched. באיור זה, הזרקות זרם מדורגות מראות נוירון בעל פריקה מחזורית (spiking). מוצגים כאן רישומי מתח (voltage clamp) מהבקיעה המקומית של תמיסת פוטסיום כלוריד בריכוז 500 millimolar בשלושה מיקומים.העקבה האדומה עם זרם פנימה נרשמה מהניסוי שבו יישום ה-potassium chloride היה קרוב לתא ה-patch. החץ האדום מצביע על עיתוי יישום ה-potassium chloride. באמצעות שיטה זו, ניתן לבצע ניסוי patch clamp תוך ארבע דקות ללא הכשרה נרחבת בהשוואה ל-patching ידני.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אופטוגנטיקה, כימוגנטיקה ומניפולציות פרמקולוגיות, כדי לענות על שאלות הקשורות לפרויקט המחקר שלכם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לבצע מחקרי תפוקה גבוהה של רצפטורים סינפטיים ותעלות יונים בהכנות in vitro שונות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע ניסויי patch clamp אוטומטיים בהנחיית תמונה.

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים טכניקה להקלטת מהדק טלאי מפני השטח של הממברנה הדנדריטית. זה עוזר לבחון ישירות את התכונות החשמליות של דנדריטים ותעלות יונים מגודרות מתח בסיסיות בנוירונים דופמינרגיים.

הקלטות מהדק טלאי מהדנדריט של נוירון דופמינרגי בפרוסת מוח

סרטון זה מדגים מיקום פיפטה מחודדת דקה ליד פרוסות מוח, ויוצר חותם עם תא עצבי. היניקה שוברת את קרום התא, ובכך יוצרת מהדק טלאי של התא כולו המאפשר מדידות נוכחיות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

קביעת תצורת מהדק-מתח של תא שלם לרישומים אלקטרופיזיולוגיים בפרוסות מוח

סרטון זה מתאר שיטה לדימות ורישום בו זמנית של פעילות חשמלית מפרוסות מוח טרנסגניות המכילות חלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים לנוירונים. ההליך כולל שמירה על פרוסת המוח בתא זילוח עם נוזל מוחי מלאכותי משודר, שימוש במקור אור כדי לעורר תאים המסומנים בפלואורסצנט, ורישום האותות החשמליים באמצעות בדיקה רב-ערוצית ומהדק טלאי.

ניטור אופטי ואלקטרופיזיולוגי סימולטני של תאי עצב בפרוסות מוח

בסרטון זה, פרוסות מוח משותקות בתא הקלטה, ותאים מעניינים מאותרים וממוקדים באמצעות מיקרוסקופ נשלט מחשב. לאחר מכן, מערכת עיבוד התמונה האוטומטית ממקמת במדויק פיפטה טלאי כדי לאטום את קרום התא ולנטר אותות חשמליים.

טכניקת מהדק טלאי מונחה תמונה אוטומטית לחקר תאי עצב בפרוסות מוח

סרטון זה מדגים את ההליך למיפוי קשרים סינפטיים על ידי אבטחת פרוסת מוח, מיקום פיפטות להשגת תצורות של תאים שלמים, וגירוי נוירונים קדם-סינפטיים להקליט תגובות פוסט-סינפטיות, ובכך להבהיר קישוריות עצבית.

רישום מהדק טלאי זוגי של הקשרים העצביים בפרוסות מוח חריפות

במאמר זה, אנו מתארים שיטה יעילה ללמוד לתפקד ערוץ יון יגנד מגודר בנוירונים של פרוסות מוח מבודד בחריפות. שיטה זו כרוכה בשימוש בתרופה micropipette מלא ליישום מקומי של תרופות לתאי עצב שנרשמו באמצעות טכניקות מהדקות תיקון סטנדרטיות.

יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

הקלטות מהדק טלאי ומילוי ביוציטין תוך-תאי בו זמנית של נוירונים מצומדים סינפטית בפרוסות מוח חריפות מאפשרים ניתוח מתואם של תכונותיהם המבניות והתפקודיות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השלבים הטכניים החיוניים של רישום אלקטרופיזיולוגי ממיקרו-מעגלים עצביים והניתוח המורפולוגי שלהם לאחר מכן.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

פרוטוקול זה מדגים יישום אופטימיזציה N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. ניסוח מדיה בודד משמש להשיג באופן אמין פרוסות המוח בריא של בעלי חיים בכל גיל, וגם עבור יישומים שונים ומגוונים ניסיוני.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

טכניקת מלחציים תיקון פרוסה היא שיטה יעילה עבור ניתוח השינויים הנוצרות על-ידי למידה מאפיינים פנימיים, הפלסטיות של הסינפסות סינאפסות או מעכבות.

פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

ניתן להשתמש בפרוסות מוח Ex vivo כדי לחקור את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות לתשומות אפרינטיות. אופטוגנטיקה משמשת להפעלה עצמאית של אפרנטים תלמוקורטיים וקורטיקוקורטיקליים לניאוקורטקס שאינו ראשוני, ותגובות סינפטיות ורשתיות מווסתות עם איזופלורן.

הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

למדו שיטת תיקון מהדק אוטומטי מודרך תמונה לחקר נוירונים בפרוסות מוח חריפות באמצעות טכנולוגיית ראייה ממוחשבת. שיטה זו מגבירה משמעותית את תפוקת הניסויים האלקטרופיזיולוגיים ומאפשרת סינון תרופתי יעיל.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

גלה סרטונים נוספים