יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

המטרה הכוללת של טכנולוגיה זו היא להשתמש בראייה ממוחשבת כדי לזהות באופן אוטומטי תאים פלואורסצנטיים ולבצע מהדק טלאי אוטומטי של תאים אלה בפרוסות מוח חדות. שיטה זו יכולה לעזור להתגבר על קשיים מרכזיים בתחום האלקטרופיזיולוגיה של מהדק התיקון, כגון זיהוי, מיקוד ומהדק טלאי של תאים המסומנים בפלואורסצנט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לזהות אוטומטית צנרת תיקון, תאים פלואורסצנטיים ולשלב את השלבים עם מהדק תיקון אוטומטי.

חידוש זה מגדיל משמעותית את תפוקת הניסוי. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של הפרעות נוירולוגיות, מכיוון שניתן להשתמש במהדק תיקון אוטומטי מונחה תמונה בתפוקה גבוהה להקרנות פרמקולוגיות בתכשירים עצביים פיזיולוגיים יותר. ניתן ליישם שיטה זו גם על תכשירים אחרים במבחנה, כגון אברונים עצביים טיפיים, או תרביות פרוסות, נוירונים מפרידים כמו גם כל תאים שאינם עצביים.

כדי להתחיל בהליך זה, הפעל את המגבר, בקר המיקרוסקופ ובקר המניפולטור. לאחר מכן, הפעל את Autopatcher IG עם python ממסוף שורת פקודה על ידי שינוי התיקייה שבה מותקן Autopatcher IG. לאחר מכן, הקלד Python Autopatcher_IG.

PYW במסוף שורת הפקודה ולחץ על מקש Enter. לאחר מכן, מלאו את כל צינור הזכוכית בתמיסה פנימית והעמיסו אותו על שלב הראש. העבר את קצה הפיפט לשדה הראייה של המיקרוסקופ והביא אותו למיקוד.

אם לוח החיוג משמש להזזת המניפולטורים בשלב המיקרוסקופ, עדכן את הקואורדינטות על ידי לחיצה על Z במקלדת. הכיול הראשוני ממיר את זווית ומרחק התנועה של המניפולטור למערכת הקואורדינטות של המיקרוסקופ. המניפולטור נע בשלושה כיוונים עם מרחק מוגדר מראש והתוכנה מזהה את הקואורדינטות של קצה הפיפט בתוך שדה הראייה של המיקרוסקופ.

לחץ על כפתור התחל כיול בממשק המשתמש הראשי של היחידה המתאימה עליה נטען הפיפט. לאחר מכן, שמור את הכיול על ידי לחיצה על שמור כיול בתחתית ממשק המשתמש הראשי. כיול ראשוני זה הכרחי להתבצע פעם אחת בלבד אלא אם כן הארגון הפיזי של האסדה משתנה.

בשלב זה, הניחו פרוסת מוח אחת במרכז תא ההקלטה. ייצב את פרוסת המוח בעזרת אחיזת פרוסה או נבל. כדי לזהות את התא הפלואורסצנטי, מצא את אזור העניין בהגדלה פי ארבע.

לאחר מכן, הזז את שלב המיקרוסקופ על ידי הפעלת מצב לחיצה לתנועה ולחץ על מרכז אזור העניין. לחלופין, השתמש בלוח המקשים כדי להזיז את שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן, עבור לעדשת ההגדלה הגבוהה והתאם את המיקוד על ידי הזזת המיקרוסקופ בציר Z באמצעות RF על לוח המקשים.

התוכנה מכוונת את המיקרוסקופ והמצלמה לצלם סדרה של תמונות בעומקים שונים. לאחר מכן, התמונות האלה עוברות עיבוד ראייה ממוחשבת כדי למצוא תאים עם תוויות פלואורסצנטיות. הפלט הסופי הוא רשימה של קואורדינטות תאים שזוהו.

לחץ על כפתור זיהוי התא ביחידת העמודה הראשית של ממשק המשתמש הגרפי אפס. אם לא ניתן לשלוט במקור אור ה-LED או הלייזר של ההתקנה באמצעות אות ה-TTL, הפעל ידנית את ה-LED או הלייזר. כבה את הנורית או הלייזר במידת הצורך.

רשימה של קואורדינטות תאים תופיע בממשק המשתמש של מיקומי הזיכרון. הסר תאים לא רצויים מהרשימה על ידי לחיצה על כפתור X לצד הקואורדינטות. לחלופין, אם תאי היעד אינם מסומנים באופן פלואורסצנטי, לחץ על מצב עכבר בממשק המשתמש הראשי.

לאחר מכן, לחץ על התא המעניין, נקודה צהובה עם מספר תופיע על התא והקואורדינטות של התא יופיעו בממשק המשתמש של מיקומי הזיכרון. כדי לבצע כיול משני על מנת לזהות קואורדינטות היסט של פיפט, מלא 1/3 של פיפט זכוכית בתמיסה פנימית. לאחר מכן, טען את הפיפט על מחזיק הפיפט המחובר לראש stage.

בהגדלה נמוכה, השתמש באחד ובשניים בלוח המקשים כדי לעבור בין יחידה אחת ליחידה שתיים. לאחר מכן, הכניסו את הפיפט לשדה הראייה והתאימו את המיקוד באמצעות לוח המקשים. לאחר מכן, טען את הכיול הראשי על ידי לחיצה על כיול עומס.

העבר את עדשת המיקרוסקופ להגדלה גבוהה ולחץ 40 פעמים על ממשק המשתמש הראשי. הביאו את קצה הפיפט למרכז. לאחר מכן, לחץ על כפתור הכיול המשני בממשק המשתמש הראשי, מתחת ליחידה הנמצאת בשימוש.

כדי לתקן תא יעד, לחץ על לחצן בקרת התיקון כדי לפתוח את ממשק המשתמש הגרפי של בקרת התיקון. לחץ על לחצן עבור אל לצד התא המעניין ברשימת הקואורדינטות בממשק המשתמש הגרפי של מיקום הזיכרון. לאחר מכן, לחץ על כפתור CTM של היחידה בממשק המשתמש הראשי כדי לאפשר תנועה.

לחץ על התא המעניין כדי להעביר את קצה הפיפט לתא. בשל מגבלה מכנית של המניפולטור, כאשר נוסעים מרחק של יותר מ-500 מיקרומטר, עלולה להיות שגיאת מיקום קלה. כדי למנוע שגיאת מיקום מכנית גדולה, יש לבצע כיול משני ליד תא המטרה.

לאחר מכן, השתמש בכפתור היחידה שנבחר כדי להחליף את אות הקלט בין שתי היחידות. לחץ על כפתור התיקון בממשק המשתמש של בקרת התיקון. תיקון אוטומטי יתחיל וניתן לנטר את הלחץ וההתנגדות בממשק המשתמש הגרפי של בקרת התיקון.

אלגוריתם התיקון האוטומטי מנטר את ההתנגדות ושולט בלחץ באמצעות סדרה של לולאות לוגיות, ליצירת ג'יגה-סיל. חלון קופץ מודיע על היווצרות ג'יגה-סיל. המערכת משתמשת בשינוי התנגדות כדי לזהות מגע בין פני התא.

במצב שהמגע עם פני התא לא מזוהה בזמן, השתמש בכפתור הבא כדי להתקדם בשלב התיקון תוך הישארות באותו ניסוי תיקון אוטומטי. תפעל את התהליך האוטומטי בכל נקודה על ידי לחיצה על הלחצנים המתאימים בממשק המשתמש הגרפי של בקרת התיקון. לאחר מכן, בחר כן כדי לפרוץ עם Zap ויניקה משולבים.

לחלופין, בחר לא כדי לפרוץ באמצעות שאיבה בלבד. לאחר מכן, שמור את יומן תיקון הניסוי. איור זה מציג את המיקומים שנבחרו שנטענו לממשק המשתמש הגרפי של רצף הפקודות.

העמודה השמאלית מציגה את רשימת הקואורדינטות והעמודה הימנית מציגה את רשימת הפקודות בצורה של אותות TTL עבור כל מיקום. להלן צילומי המסך במהלך ניסוי יישום התרופות, המתאימים לשלושת המיקומים שנבחרו. תמיסת KCL עורבבה עם צבע פלואורסצנטי אדום לצורך הדמיה.

יחידה אחת הייתה פיפט המכיל KCL ויחידה שנייה הייתה פיפט התיקון. באיור הזה, זריקות זרם הצעד מראות תא עצב רגיל. מוצגים כאן מהדק המתח רושם עקבות מהיישום המקומי של תמיסת אשלגן כלורי 500 מילי-מולרית בשלושה מקומות.

העקבות האדומות עם הזרם הפנימי נרשמו מהניסוי כאשר יישום אשלגן כלורי היה קרוב לתא המדבקה. החץ האדום מציין את העיתוי של יישום אשלגן כלורי. באמצעות שיטה זו, ניתן לבצע ניסוי מהדק תיקון תוך ארבע דקות ללא הכשרה מקיפה בהשוואה לתיקון ידני.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אופטוגנטיקה, כימוגנטיקה ומניפולציות פרמקולוגיות, על מנת לענות על שאלות הקשורות לפרויקט המחקר שלך. לאחר פיתוחה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור מחקרים בתפוקה גבוהה של קולטנים סינפטיים ותעלות יונים בתכשירים שונים במבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויי מהדק תיקון אוטומטיים מונחי תמונה.