Name: MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: למד לבודד ולזהות חלבונים הקושרים mRNA מפרוטופלסטים של Arabidopsis thaliana באמצעות צלב UV in vivo. שיטה זו מאפשרת חקר רגולציה גנטית לאחר תמילה בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים במעבדה של פרופ &#39;יוריס וינדריקס, שסיפק את המנגנון crosslinking UV מצויד מנורת UV קונבנציונאלי. KG נתמך על ידי קרן מחקר KU Leuven ומכיר תמיכה של FWO להעניק G065713N.

למחברים אין מה לחשוף.

אנו בהצלחה להחיל mRNA אינטראקציה ללכוד, שפותח עבור שמרים ותאי אדם, לשתול protoplasts mesophyll עלה. תאים עלה mesophyll הם הסוג העיקרי של רקמת הקרקע עלים צמח. היתרון העיקרי של שיטה זו היא כי היא משתמשת vivo crosslinking לגלות את החלבונים מסביבה פיזיולוגית. בפרוטוקול זה, אנו מציגים בעיקר מספר תנאים ניסיוניים אופטימיזציה ( למשל, מספר protoplasts להשתמש כחומר המוצא ומשך קרינה UV) 5...

Eukaryotes להשתמש RNA מספר ביוגנזה מסלולים רגולטוריים כדי לשמור על תהליכים ביולוגיים תאיים. בין סוגים ידועים של רנ&quot;א, mRNA הוא מגוון מאוד ונושא קיבולת קידוד של חלבונים ואת האיזופורמים שלהם 1. מסלול PTGR מכוון את גורלם של pre-mRNAs 2 , 3 . RBPs ממשפחות גנים שונים לשלוט על הרגולציה של RNA, ב PTGR, mRNAs ספציפיים mRNAs מדריך דרך אינטראקציות פיזיות ישירות, יצירת mRNPs תפקודית. לכן, זיהוי ואפיון mRBPs ו mRNPs שלהם הוא קריטי להבנת הרגולציה של חילוף החומרים mRNA נייד 2. מעל שלושת העשורים האחרונים, שונים בשיטות חוץ גופית - כולל מבחני ניידות RNASA ניידות (REMSA) מבחנים, אבולוציה שיטתית של ligands ידי מבחני העשרה מעריכי (SELEX) מבוסס על ספריות הנגזרות בונה, RNA Bind-N-Seq (RBNS), radiolabeled או כמותיפלואורסצנטי RNA מחייב מבחני, קריסטלוגרפיה רנטגן, ו ספקטרוסקופיה תמ&quot;ג 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - יושמו באופן נרחב על מחקרים של RBPs, בעיקר תאים יונקים. התוצאות של מחקרים אלה של RBPs יונקים ניתן לחפש באמצעות RNA מחייב DataBase חלבון (RBPDB), אשר אוספת את התצפיות שפורסמו 10 . למרות אלה בגישות חוץ גופית הם כלים רבי עוצמה, הם קובעים את מוטיבים RNA קשורות מתוך מאגר RNA נתון רצפים ולכן מוגבלים ביכולתם לגלות RNAs היעד החדש. הדבר נכון גם לגבי אסטרטגיות חישוביות לחזות RBPs גנום רחב, אשר מבוססים על שימור רצף מבנה חלבון 15 . כדי להתגבר על זה, שיטה ניסיונית חדשה חהS שהוקם המאפשר זיהוי של מוטיבים RNA כי RBP של עניין אינטראקציה עם, כמו גם על קביעת המיקום המדויק של מחייב. שיטה זו, המכונה &quot;crosslinking ו immunoprecipitation&quot; (CLIP), מורכב ב crosslinking UV vivo ואחריו immunoprecipitation 11 . מחקרים מוקדמים הראו כי photactivation של DNA ו RNA נוקליאוטידים יכול להתרחש אורכי גל UV גדול מ 245 ננומטר. התגובה באמצעות thymidine נראה מועדף (דרגה של photoreactivity ירד: dT ≥ dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . באמצעות אור UV עם אורך גל של 254 ננומטר (UV-C), נצפתה כי קשרים קוולנטיים בין נוקליאוטידים RNA ו שאריות חלבון נוצרות כאשר בטווח של רק כמה אנגסטרומים (Å). התופעה נקראת אפוא &quot;crosslinking&quot; באורך אפס של RNA ו- RBP. זה יכול להיות ואחריו פרוטה טיהור מחמירים<html> Dure עם רקע קטן 13 , 14 . אסטרטגיה משלימה CLIP היא לשלב ב vivo UV crosslinking עם זיהוי חלבון כדי לתאר את הנוף של RBPs. מספר פרוטוקולים כאלה של גנום- mRNA, היו מבודדים מתאי שמרים, תאי גזע עובריים (ESCs) וקווים של תאים אנושיים ( כלומר, HEK293 ו- HeLa) תוך שימוש בגישה הניסויית החדשה, הנקראת &quot;mRNA אינטראקציה ללכוד&quot; 18 , 19 , 20 , 21 . השיטה מורכבת של vivo UV crosslinking ואחריו טיהור mRNP ו- MS מבוסס proteomics. על ידי יישום אסטרטגיה זו, רבים חדשים &quot;moonlighting&quot; RBPs המכילים RBDs שאינם קנוניים התגלו, וזה הפך ברור כי יותר חלבונים יש RNA מחייב קיבולת מאשר בעבר היה אמור להיות&quot;15 , 16 , 17. השימוש בשיטה זו מאפשר ליישומים חדשים וליכולת לענות על שאלות ביולוגיות חדשות בעת חקר RBPs לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה בחן את שימור של פרוטאומה ה- mRNA קשור (הליבה RBP פרוטאומה) בין שמרים לתאים אנושיים 22 . RBPs צמחים כבר נמצא להיות מעורב בצמיחה ופיתוח ( למשל , בתקנה שלאחר תעתיק של זמן הפריחה, השעון היממה, ביטוי גנים במיטוכונדריה ו chloroplasts) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . יתר על כן, הם חשבו לבצע פונקציות בתהליכים הסלולר להגיב על מדגיש abiotic ( למשל, קר, בצורת, saLines, וחומצה אבסיסית (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . ישנם יותר מ 200 גנים RBP החזוי בגנום ארבידופסיס thaliana , המבוססת על מוטיב הכרה RNA (RRM) ו K הומולוגיה (KH) מוטיבים רצף מושלם; באורז, כ -250 כבר ציינו 35 , 36 . יש לציין כי רבים חזו כי RBPs נראים ייחודיים לצמחים ( למשל, לא מטאזואנים אורתולוגים לכ 50% של ארבידופסיס RBPs החזוי המכיל תחום RRM) 35 , מה שמרמז כי רבים עשויים לשרת פונקציות חדשות. הפונקציות של רוב RBPs החזוי להישאר uncharacterized 23 . בידוד של proteomes mRNA קשורה מן שתילים ארבידופסיס etiolated, רקמת עלה, תאים שורש תרבותי, ו protoplasts mesophyll עלה באמצעות שימושלכידת mRNA אינטראקציה לאחרונה דווח 38 , 39 . מחקרים אלה מדגימים את הפוטנציאל החזק של קיטלוג שיטתי של RBPs פונקציונליים בצמחים בעתיד הקרוב. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכידת mRNA אינטראקציה מן protoplasts צמח ( כלומר, תאים ללא קירות התא). ארבידופסיס thaliana עלה prooplasts mesophyll הם הסוג העיקרי של תא עלה. Protoplasts מבודד לאפשר גישה אופטימלית של אור UV לתאים. סוג תא זה יכול לשמש מבחני כי transiently להביע חלבונים אפיון פונקציונלי 40 , 41 . יתר על כן, Protoplasting הוחל על סוגים אחרים של תאים צמחיים ומינים 42 , 43 , 44 ( למשל, Petersson et al ., 2009; Bargmann and Birnbaum, 2010, ו- Hong et al , 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; השיטה כוללת סך של 11 צעדים ( איור 1 א ). ארבידופסיס protoplasts mesophyll עלה מבודדים הראשון (שלב 1) והם לאחר מכן UV מוקרן ליצירת mRNPs crosslinked (שלב 2). כאשר protoplasts lysed תחת תנאי denaturing (שלב 3), mRNPs crosslinked משתחררים במאגר תמוגה / מחייב ומשוך למטה על ידי אוליגו d (T) 25 חרוזים (שלב 4). לאחר מספר סיבובים של שוטף מחמירים, mRNPs הם מטוהרים עוד ניתח. פפטידים denatured של mRBPs מתעכלים על ידי K proteinase לפני mRNAs crosslinked הם מטוהרים ואת איכות ה- RNA מאומת על ידי qRT-PCR (שלבים 5 ו -6). לאחר טיפול RNase וריכוז חלבון (שלב 7), איכות החלבון נשלטת על ידי SDS polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ואת מכתים כסף (שלב 8). ההבדל בין דפוסי הלהקה חלבון יכול בקלות להיות דמיינו בין מדגם crosslinked (CL) ומדגם לא crosslinked (לא CL;מדגם השליטה השלילי מ protoplasts כי אינו חשוף קרינה UV). זיהוי החלבונים מושגת באמצעות proteomics MS מבוססי. החלבונים מן המדגם CL מופרדים על ידי חד מימדי polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (1D-PAGE) כדי להסיר זיהום רקע אפשרי, הם &quot;בתוך ג &#39;ל מתעכל&quot; לתוך פפטידים קצרים באמצעות טריפסין, והם מטוהרים (שלב 9). ננו בשלב ההפוך כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים ספקטרומטריית מסה (ננו LC-MS) מאפשר קביעת כמות של חלבונים סופי של פרוטאומה כבול mRNA (שלב 10). לבסוף, mRBPs מזוהים מאופיינים וקטלג באמצעות ניתוח ביואינפורמאטי (שלב 11).

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.8 M מניטול</td><td>סיגמא</td><td>M1902-500G</td><td>תמיסת אנזים איזוטונית ראשונית & תמיסת MMg</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>MERCK</td><td>Art. 4935</td><td>תמיסת אנזים איזוטונית ראשונית & W5 buffer</td></tr><tr><td>0.2 M MES (pH 5.7) (4-morpholineethanesulfonic acid)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2933</td><td>תמיסת אנזים איזוטונית ראשונית, W5 buffer & MMg תמיסה, עיקור סינון</td></tr><tr><td>צלולאז R10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>צלולאז " אונוזוקה" R-10, 10 גרם</td><td>תמיסת אנזים איזוטונית סופית</td></tr><tr><td>Macerozyme R10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>MACEROZYME R-10, 10 גרם</td><td>תמיסת אנזים איזוטונית סופית</td></tr><tr><td>10% (w/v) BSA (אלבומין סרום בקר)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>תמיסת אנזים איזוטונית סופית & עיקור סינון</td></tr><tr><td>1 M CaCl2</td><td>Chem-Lab NV</td><td>CL00.0317.1000</td><td>תמיסת אנזים איזוטונית סופית, W5 buffer & מאגר עיכול</td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td>W5 buffer</td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td>תמיסת MMg</td></tr><tr><td>1 M LiCl (ליתיום כלוריד)</td><td>Acros</td><td>199885000</td><td>מאגר ליזה/מחייב, מאגר כביסה 1, מאגר כביסה 2 & מאגר מלח נמוך</td></tr><tr><td>5% (w/v) LiDS (ליתיום דודציל סולפט)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4632-25G</td><td>מאגר ליזה/מחייב, מאגר כביסה 1 & עיקור סינון</td></tr><tr><td>1 M DTT (Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific מאגר כביסה 1 & מאגר כביסה 2</td><td>307866</td><td>מאגר ליזה/קשירה,</td></tr> <tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, חומצה הידרוכלורית S.G. (HCl)))</td><td>אקרוס & פישר כימיקלים</td><td>167620010 & H/1200/PB15</td><td>מאגר ליזה/כריכה, מאגר כביסה 1, מאגר כביסה 2, מאגר מלח נמוך & מאגר אלוטיון</td></tr><tr><td>0.5 מ' EDTA (pH 8.0) (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)</td> <td>מאגר</td><td></td><td>ליזה/מחייב מאגר כביסה 1, מאגר כביסה 2, מאגר מלח נמוך & מאגר אלוטיון</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>8.22184.0500</td><td>התחדשות של oligo-d(T)25 חרוזים</td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td>VWR PROLABO CHEMICALS</td><td>28244.295</td><td>התחדשות חרוזי oligo-d(T)25</td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.4) (מי מלח חוצץ פוספט) המכילים (NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td><td>Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC</td><td>S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230</td><td>התחדשות של חרוזי oligo-d(T)25</td></tr><tr><td>תמיסת Proteinase K (2 &mu; g/&mu; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>עיכול חלבון</td></tr><tr><td>טעינת צבע</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>qPCR מאסטר מיקס</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>qRT-PCR מבחן</td></tr><tr><td>RNase קוקטייל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>AM2286</td><td>RNA עיכול</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>322415</td><td>קיבוע ג'ל ומניעת ג'ל</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Sigma-aldrich</td><td>537020</td><td>קיבוע ג'ל ומניעת ג'ל</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20278</td><td>צביעת ג'ל</td></tr><tr><td>1 M NH4HCO3 (אמוניום ביקרבונט) &nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>09830-500G</td><td>ג'ל לחות & בופר עיכול</td></tr><tr><td>CH3CN (אצטוניטריל)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>34851-100ML</td><td>ג'ל התייבשות & תמיסת פפטיד</td></tr><tr><td>IAA (חומצה יודואצטית)</td><td>סיגמא-אולדריך</td><td>I4386-10G</td><td>חומר אלקילציה</td></tr><tr><td>TFA (חומצה טריפלואורואצטית)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>302031-10X1ML</td><td>תמיסת פפטיד</td></tr><tr><td>FA (חומצה פורמית)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>06554-5G</td><td>מיצוי פפטיד</td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין (6 ng/&mu; L)</td> <td>Promega</td><td>V5280</td><td>מאגר עיכול</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אדמה</td><td>פלטרקום</td><td>LP2D</td><td>גידול צמחים</td></tr><tr><td>ורמיקוליט 3</td><td>סיבלי AS</td><td>05VERMICULIET</td> צלחת <td>פטרי לצמיחת צמחים</td></tr><tr><td>(150 x 20 מ"מ)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>מנשא לתרחיף פרוטופלסט</td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filter</td><td>Millipore</td><td>SE2M229104</td><td>הומוגניזציה של תמיסת אנזים איזוטונית סופית</td></tr><tr><td>Razorblade</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>רצועות עלי רוזטה</td></tr><tr><td>35-75 &mu; m רשת ניילון</td><td>SEFAR NITEX</td><td>74010</td><td>סינון מתלה פרוטופלסט</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות תחתונים עגולים</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1918-10EA</td><td>מנשא למתלה פרוטופלסט</td></tr><tr><td>Hemocytometer (B&uuml; </td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td>מנגנון הצלבת UV לספירת תאים פרוטופלסט</td></tr><tr><td> (HL-2000 HybriLinker)</td><td>UVP, LLC</td><td>UVP95003101</td><td>in vivo מנורת UV צולבת</td></tr><tr><td>UV (Sankyo-Denki G8T5)</td><td>SANKYO DENKI</td><td>SD G8T5</td><td>in vivo מזרק זכוכית צולב UV</td></tr><tr><td>50 מ"ל</td><td>FORTUNA Optima</td><td>Z314560</td><td>הומוגניזציה של ליזאט פרוטופלסט</td></tr><tr><td>מחט צרה (0.9 x 25 מ"מ)</td><td>מיקרולנס בקטון דיקינסון 3</td><td>2021-04</td><td>הומוגניזציה של מסובב ליזאט פרוטופלסט</td></tr><tr><td>דגם L26</td><td>Labinco BV</td><td>26110912</td><td>דגירה של דגימה על ידי סיבוב</td></tr><tr><td>Oligo-d(T)25 חרוזים מגנטיים (5 מ"ג/מ"ל)</td><td>New England BioLabs</td><td>S1419S</td><td>mRNPs ו-mRNAs קשירה ו </td></tr><tr><td>מתלה מגנטי</td> נפתח <td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td>mRNPs ו-mRNAs יחידות</td></tr><tr><td>סינון צנטריפוגליות מחייבות ונשלפות (יחידות סינון צנטריפוגליות Amicon Ultra-4)</td> <td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>ריכוז mRBP</td></tr><tr><td>ערכת כתמי כסף</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24612</td> ערכת טיהור RNA <td>לבדיקת מכתים בכסף</td></tr><tr><td> (InviTrap Spin Plant RNA מיני קיט)</td> <td>STRATEC מולקולרי</td><td></td><td>1064100300 RNA טיהור</td></tr><tr><td>מכשיר ספקטרופוטומטר (NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>RNA איכות וכמות</td></tr> בזמן <tr><td>אמת PCR מחזור (StepOne בזמן אמת PCR מחזור)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td>cDNA כימות</td></tr> <tr><td>ומיקרו;-C18 עמודות (Millipore Zip Tip &micro;-C18 עמודות)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>720046-960EA</td><td>טיהור פפטידים</td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה (Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td> מכשיר <td>כרומטוגרפיה נוזלית מבוססת ספקטרומטריית מסה</td></tr><tr><td>(מכשיר כרומטוגרפיה נוזלית אולטימטיבי 3000 בעל ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td>פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה</td></tr><tr><td>C18 column (עמודה קלה של ריסוס Pepmap RSLC C18)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ES800</td><td>פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה</td></tr><tr><td>C18 precolumn (שבחים Pepmap 100 C18 precolumn)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>160321</td><td>פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה</td></tr> <tr><td>שם</td><td> Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primers for qRT-PCR assay</td><td>Sequences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UBQ10 mRNA (Li et al., 2014)</td><td>Fw: AACTTTGGTGGTGTGTGTTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA (Durut et al., 2014)</td><td>Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mrna interactome ללכוד מן protoplasts הצמח

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA מחייב חלבונים (RBPs) לקבוע את גורלם של RNAs. הם משתתפים בכל המסלולים ביוגנזה רנ&quot;א ובמיוחד לתרום שלאחר תקנת גנים תקנה (PTGR) של RNAs השליח (mRNAs). בשנים האחרונות, מספר mRNA-proteomes כבול מן השמרים שורות תאים יונקים היו מבודדים בהצלחה באמצעות שיטה חדשנית בשם &quot;mRNA אינטראקציה ללכוד&quot;, המאפשר זיהוי של mRNA מחייב חלבונים (mRBPs) ישירות מתוך סביבה פיזיולוגית. השיטה מורכבת מ - vivo אולטרה סגול (UV) crosslinking, משוך מטה וטיהור של מסנג &#39;ר ribonucleoprotein קומפלקסים (mRNPs) על ידי חרוזים אוליגו (DT), ואת זיהוי שלאחר מכן של חלבונים crosslinked על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). לאחרונה, על ידי יישום שיטה זהה, כמה צמחים mRNA כבול חלבונים דווחו בו זמנית ממקורות רקמה שונים ארבידופסיס : שתילים etiolated, רקמת עלה,עלה prooplasts mesophyll, ותאי שורש תרבותי. כאן, אנו מציגים את אופטימיזציה mRNA אינטראקציה ללכוד שיטת ארבידופסיס thaliana protoplasts mesophyll עלה, סוג התא המשמש כלי רב תכליתי עבור ניסויים הכוללים מבחני הסלולר השונים. התנאים התשואה חלבון אופטימלי כוללים את כמות הרקמות החל ואת משך קרינה UV. ב- mRNA-proteome שהתקבל בניסוי בקנה מידה בינוני (10 7 תאים), RBPs ציינו כי קיבולת ה- RNA מחייב נמצאו לייצג יתר על המידה, ורבים RBPs מזוהים זוהו. הניסוי יכול להיות scaled up (10 9 תאים), ואת השיטה אופטימיזציה ניתן להחיל על סוגי תאים צמחיים אחרים מינים כדי לבודד באופן רחב, קטלוג, ולהשוות proteomes mRNA- קשורה בצמחים.

ראינו הילה אופיינית, המקיפה את גלולה חרוז במדגם CL, לשטוף שלב 4.3 עם חיץ לשטוף 2 ( איור 1 ב ). למרות שזה לא נחקר, התופעה הזאת כנראה ניתן להסביר על ידי הפרעה של מתחמי mRNP crosslinked עם צבירה חרוז במהלך לכידת מגנטי, גרימת צבירה מפוזר יותר להיווצר. זה מציין כי אוליגו d (T) 25 חרוז ללכוד היה יעיל 14 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

המטרה הכוללת של לכידת האינטראקטום (interactome) המעובדת של mRNA זו היא לבודד ולזהות פרוטאום הקשור ל-mRNA מתאי צמחים. שיטה זו יושמה על פרוטופלסטים של מזופיל מעלי *Arabidopsis thaliana*, סוג תאים המשמש ככלי רב-תכליתי במגוון בדיקות תאיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הבקרה הגנטית הפוסט-טרנסקריפציונית, כגון גילוי והבנת תפקידם של חלבונים קושרי RNA בשליח בצמחים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לבודד ולזהות שליח צמחי בתוך פרוטאום קשור ישירות מהסביבה הפיזיולוגית. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חלבונים הקשורים ל-mRNA מפרוטופלסטים של מזופיל מעלה של Arabidopsis. ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון פרוטופלסטים או רקמות של צמחים אחרים.הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר הבחנו כי היא יושמה בהצלחה בשמרים ובקווי תאי יונקים. בודדו פרוטופלסטים ממזופילי עלי של arabidopsis עבור שתי דגימות שונות, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. שמרו את דגימת הביקורת שלא תעבור קישור צולב ב-UV, או דגימת ה-non-CL, על קרח.העבירו את תרחיף הפרוטופלסטים המיועד לקשירה צולבת, או את דגימת ה-CL, לצלחת פטרי גדולה. הוסיפו לצלחת 30 milliliters של תמיסת MMG קרה (מקררי קרח) כדי לכסות את הפנימיות, ופזרו את התאים באמצעות פיפטור עדין. כסו את צלחת הפטרי בנייר אלומיניום בעת ההעברה למכשיר הקשירה הצולבת ב-UV.הנח את צלחת הפטרי הפתוחה במכשיר לקשירה צולבת ב-UV באופן מיידי. וודא שהמרחק בין הצלחת לנורת ה-UV הוא שמונה סנטימטרים, ולאחר מכן הקרן את הדגימה למשך דקה אחת. לאחר מכן, העבר במהירות מנות מהסספנסיות של הפרוטופלסטים מצלחת הפטרי לשתי מבחנות חדשות בעלות תחתית עגולה בנפח 50 מיליליטר.שטפו את תחתית הצלחת עם חמישה מיליליטרים נוספים של תמיסת MMG קרה במיוחד כדי לאסוף את שארית הפרוטופלסטים. חלקו את התמיה בין שתי המבחנות. לאחר מכן, סובבו במרכז פוגה (centrifuge) את מבחנת הדגימה שאינה CL ושתי מבחנות הדגימה של CL ב-100 ×g בטמפרטורה של 4°C למשך חמש דקות.לאחר השלכת הנוזל העליון, החזירו את המבחנה עם המשקע שאינו CL לקירור על קרח. הוסיפו 10 milliliters של תמיסת MMG קרה לכל מבחנה של דגימת CL ונערה בעדינות את המבחנות כדי להחזיר את המשקעים לתליה. לאחר איחוד שתי הדגימות למבחנה אחת בעלת תחתית עגולה בנפח 50 milliliter, סבבו בצנטריפוגה ב-100 times g בטמפרטורה של ארבע degrees celsius למשך חמש דקות.לאחר השלכת הנוזל העליון, שמרו את המשקע על קרח. לאחר מכן, הוסיפו תשעה מיליליטרים של בופר קישור לליזיס קר לכל משקע תאים של הדגימות. בצעו ליזיס לפרוטופלסטים על ידי פיפוט מעלה ומטה כעשרים פעמים, עד שהתמיסה תהיה בצבע ירוק בהיר הומוגני.עבור הומוגניזציה, העבירו את הליזט של הפרוטופלסטים פעמיים דרך מזרק זכוכית של 50 milliliter עם מחט צרה, ולאחר מכן הדגירו את הליזט על קרח למשך עשר דקות. הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי ואחסנו במינוס 80 degrees celsius למשך עד שלושה שבועות. לאחר הפשרת המבחנה עם הליזט הקפוא של הפרוטופלסטים בטמפרטורת החדר, שמרו את המבחנה על קרח.העבירו מנה של 1.8 milliliters של חרוזי מגנט oligo-d(T) לשש פרוטות מיקרו-צנטריפוגה חדשות עם תחתית עגולה בנפח שני מיליליטר המונחות על קרח. שטפו את תגלי הירוצים בכל פרוטה באמצעות 600 microliters של lysis binding buffer על ידי פיפטור קצר למעלה ולמטה, וסובבו את החרוזים בעדינות על רוטטור למשך שתי דקות. השאירו את החרוזים על קרח.בשלב הבא, העבירו את כל שש המבחנות המכילות את החרוזים למסרק מגנטי למשך שלוש דקות לפחות, כדי לאפשר זמן מספיק ללכידה מגנטית מלאה. כאשר החרוזים נלכדים לחלוטין, התמיה תהפוך לצלילה. לאחר מכן, השליכו את העל-מיסל מכל שש המבחנות והעבירו אליהן מיד מנות של תשעה מיליליטר של ליזט פרוטופלסטים.ערבב את החרוזיים עם הלייזט באמצעות פיפוט עד שהתמיה נראית חומה והומוגנית. דגור את המבחנות בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת בסיבוב עדין. לאחר הדגירה, החזר את המבחנות למגנט למשך שלוש דקות.כאשר כל החרו지를 נלכדים בדופן המבחנות, אספו את הנוזל העליון המכיל את תמצית הפרוטופלסטים לשש מבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות בעלות תחתית עגולה בנפח 2 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 מיליליטר של wash buffer one קר מהקרח לכל מבחנה המכילה חרו지를, והשביו את החרו지를 למצב של סספנזיה באמצעות פיפטור. לאחר סיבוב עדין למשך דקה אחת, החזירו את המבחנות למעמד המגנטי למשך שלוש דקות.שפכו את הנוזל העליון וחזרו על שלב שטיפה זה פעם אחת. בעזרת 1.5 milliliters של באפר שטיפה שני קר מאוד, חזרו על אותו הליך שטיפה פעמיים. אם ה-mRNP's בודדו ביעילות מליזאט הפרוטופלסט, צריכה להיות הילה נראית סביב משקע החרוגים בדגימת ה-CL.לבסוף, חזרו על הליך השטיפה פעם אחת עם 1.5 milliliters של בופר מלח נמוך קרקיר. לאחר השטיפה, הוסיפו 500 microliters של בופר אלוציה לכל מבחנה, ושחזרו בעדינות את החרו지를 באמצעות פיפטינג. דגרו בטמפרטורה של 50 degrees celsius למשך שלוש דקות כדי לשחרר את ה-RNA בעלי זנב poly-A.שחזר בעדינות את סספנסיון החריזים על ידי פיפטינג חד-פעמי והחזר את המבחנות למסרק המגנטי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. העבר ואחד את האלואנטים מכל שש המבחנות למבחנה בעלת תחתית קונית בנפח 15 מיליליטר המונחת על קרח. פעולה זו תניב כ-3 מילימטרים של האלואנט.ניתן לקבוע באופן מיידי את האיכות והכמות של ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. הכינו את חרוזי ה-oligo-d(T) לשימוש חוזר על ידי שטיפתם פעמיים עם 1 ml של תמיסת אלות (elution buffer) קרה מאוד. לאחר מכן, שטפו אותם עם 1 ml של תמיסת קשירה לליזיס (lysis binding buffer) קרה מאוד כדי להחזיר את ריכוז המלח ל-500 millimolar.השתמשו בחרוזי oligo-d(T) שוטפים אלו כדי לחזור על הליכי הקישור, השטיפה והאלוציה עבור שני סבבים נוספים. פעולה זו תדלל את ה-RNA בעל זנב poly-A מתוך הליזט של הפרוטופלסטים ותניב סה"כ תשעה מיליליטרים של אלואנט עבור כל דגימה. ניתן לאחסן את החרוזים ולהשתמש בהם לניסוי נוסף עד שלוש פעמים לכל היותר.כדי לבדוק את איכות ה-RNA, יש לעכל את החלבונים שעברו קישור צולב ב-UV באמצעות תמיסת proteinase K בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, יש לטהר את ה-RNA באמצעות ערכה לטיהור RNA כדי להסיר מזהמים שנותרו. לאחר הטיהור, הדגימות מוכנות לבדיקת איכות ה-RNA באמצעות qRT-PCR.התחילו בטיפול של שמונה מיליליטרים מכל דגימה עם 100 units של תערובת RNAse המכילה RNAse A ו-RNAse T1. לאחר ערבוב קצר ב-vortex, דגרו את הדגימות ב-37 °C למשך שעה אחת. כדי לרכז חלבונים קושרים של mRNA, או mRBPs, סננו את הדגימות באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות. כל דגימה תניב 75 µL עם שני µg של חלבון.לאחסון לטווח ארוך, הקפיאו את הדגימות בטמפרטורה של 80- °C. להרצת ג'ל SDS-PAGE, ערבבו 25 µL מכל דגימה מרוכזת עם 15 µL של צבע טעינה (loading dye) בריכוז 2X וחממו את הדגימות בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. טענו את הדגימות יחד עם סמן חלבון (protein marker) על ג'ל SDS-PAGE בעל ג'ל ריכוז (stacking gel) של 5% וג'ל הפרדה (resolving gel) של 12%.בשלב הבא, שטפו את הג'ל פעמיים במים אולטרה-טהורים למשך חמש דקות לכל שטיפה. השתמשו בערכה מסחרית לצביעה בכסף כדי לצבוע את הג'ל. אם נעשה שימוש במספר מספיק של פרוטופלסטים התחלתיים, פסי החלבון יופיעו בתוך חמש דקות.כדי לבחון את ה-mRBP's באופן מעמיק יותר, טהרו את הפפטידים מג'ל 1D שני כפי שהוסבר בפרוטוקול הטקסט. פפטידים מטהרים אלו ניתנים כעת לניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית עם פאזה הפוכה בננו-קנה מידה (nano reverse-phased liquid chromatography), ספקטרומטריית מסות, ופרוטאומיקה איכותית וכמותית. לאחר לכידה באמצעות חרוזי oligo-d(T), הראה qRT-PCR רמות גבוהות באופן משמעותי של mRNA של poly ubiquitin 10 לעומת 18S rRNA.מכיוון שחרוזי oligo-d(T) נקשרים רק ל-RNA בעל זנב poly-A, הדבר מעיד על כך שה-mRNA מועשר בתמיסת השטיפה (eluent). לכידת mRBP's באמצעות חרוזי oligo-d(T) מוערכת בהמשך באמצעות ג'ל SDS-page שנצבע בכסף. הג'ל מראה כמות חלבון גבוהה משמעותית בדגימת ה-CL שעברה קשירה צולבת ב-UV בהשוואה לדגימת ה-non-CL שלא עברה קשירה צולבת.משך הקרינה ב-UV עשוי להשפיע על יעילות הצלוב (crosslinking). ג'ל SDS-page שנצבע בכסף מאשר כי קרינת UV למשך דקה אחת או שלוש דקות היא התנאי האופטימלי, עם עצימות הפסים החזקה ביותר. סך של 325 חלבונים זוהו באמצעות ניתוח פרוטאומיקה כמותית.225 מחלבונים אלה היו מתחת לרמת המובהקות בשל שכיחות נמוכה של פפטידים עבור כל חלבון, לצד שונות גבוהה בעוצמות הפפטידים. עם זאת, מכיוון שכל אחד מהם זוהה איכותית רק בדגימות CL, כולם נחשבו לתוצאות חיוביות. 325 חלבונים אלו סווגו לאחר מכן לשלוש קטגוריות: חלבונים ריבוסומליים, RBPs עיקריים, ו-RBPs מועמדים.לחלבונים המועמדים לתפקיד RBP חסרים דומיינים קשורי-RNA קונבנציונליים ורוב תפקידיהם טרם תוקפו, דבר המצביע על פונקציות חדשות אפשריות בוויסות RNA. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שבוע במידה ותבוצע כראוי. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מסלולי הוויסות המולקולרי בצמחים לחקור את הפרוטאומה הקשור ל-messenger RNA ברמה גנומית בתאים ורקמות של דו-פסיים וחד-פסיים.

mrna-interactome-capture-from-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

immunoprecipitation הכרומטין הוא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי DNA מחייבת אתרים של חלבוני ארבידופסיס in vivo. הליך זה כולל הכרומטין המקשר בין-ופיצול, immunoprecipitation עם נוגדנים נגד סלקטיבית החלבון של עניין, וניתוח qPCR של DNA הקשור. אנו מתארים assay שבב פשוט מותאם לצמחי ארבידופסיס.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.

מבוסס TurboID הסמיכות תיוג עבור בזיהוי Planta של חלבון-חלבון רשתות אינטראקציה

מתרגם הריבוכמה אהדה (מלכודת) מציעה את האפשרות לנתח תוכניות התפתחותיות עם עיבוד מינימלי של איברים ורקמות. הפרוטוקול מניב RNA באיכות גבוהה מתאים המיועדים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-יחידת משנה ריבוזומבית. כלים לניתוח במורד הזרם, כגון רביעיית-PCR או RNA-seq, חושפים פרופילי ביטויים ספציפיים לסוג תאים.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

למד לבודד ולזהות חלבונים הקושרים mRNA מפרוטופלסטים של Arabidopsis thaliana באמצעות צלב UV in vivo. שיטה זו מאפשרת חקר רגולציה גנטית לאחר תמילה בצמחים.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

גלה סרטונים נוספים