MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

המטרה הכוללת של לכידת אינטראקטום mRNA אופטימלית זו היא לבודד ולזהות פרוטאום הקשור ל-mRNA מתאי צמחים. שיטה זו מיושמת על פרוטופלסטים מזופילים של עלי arabidopsis thaliana, סוג תא המשמש ככלי רב-תכליתי במבחנים תאיים שונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שתלים לוויסות גנים לאחר שעתוק כגון גילוי והבנת תפקידם של חלבונים קושרי RNA של שליחים צמחיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לבודד ולזהות שליח צמחי על פרוטאום קשור ישירות מהסביבה הפיזיולוגית. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי החלבון הקשור ל-RNA שליח מפרוטופלסטים מזופילים של עלי אריבידופסיס. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כמו פרוטופלסטים או רקמות של צמחים אחרים.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כששמנו לב שהיא יושמה בהצלחה על שורות תאי שמרים ויונקים. בודד פרוטופלסטים מזופילים של עלי ארבידופסיס עבור שתי דגימות שונות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שמור את דגימת הבקרה שלא תהיה צולבת UV, או דגימה שאינה CL על קרח.

העבירו את מתלה הפרוטופלסט לקישור צולב, או CL-sample לצלחת פטרי גדולה. הוסף 30 מיליליטר תמיסת MMG קרה כקרח לכלי כדי לכסות את פני השטח ולפזר את התאים על ידי פיפטינג עדין. מכסים את צלחת הפטרי בנייר אלומיניום כאשר היא מועברת למנגנון הצלבת UV.

הנח מיד את צלחת הפטרי הפתוחה במנגנון הצלבה UV. וודאו שהמרחק בין המנה למנורת ה- UV הוא שמונה סנטימטרים ואז הקרינו את הדגימה למשך דקה. לאחר מכן, העבר במהירות את מתלה הפרוטופלסט מצלחת הפטרי לשני צינורות תחתונים עגולים חדשים של 50 מיליליטר.

שוטפים את תחתית המנה בחמישה מיליליטר נוספים של תמיסת ה- MMG הקרה כקרח כדי לאסוף את שארית הפרוטופלסטים. חלקו את המתלה בין שני הצינורות. לאחר מכן, צנטריפוגה את צינורות הדגימה שאינם CL ושני צינורות דגימת CL ב-100 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר השלכת הסופרנטנט, הניחו את הצינור עם הכדור שאינו CL בחזרה על קרח. הוסף 10 מיליליטר תמיסת MMG קרה כקרח לכל צינור דגימת CL ונער בעדינות את הצינורות כדי להשעות מחדש את הכדורים. לאחר שילוב שתי הדגימות לצינור תחתון עגול אחד של 50 מיליליטר, צנטריפוגה ב-100 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר השלכת הסופרנטנט, שמור את הכדור על קרח. לאחר מכן הוסף תשעה מיליליטר של מאגר קשירת ליזה קר כקרח לגלולת התא של כל דגימה. ליז את הפרוטופלסטים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כעשרים פעמים, עד שהתמיסה תהיה בצבע ירוק בהיר הומוגני.

לצורך הומוגניזציה, העבירו את הליזאט של הפרוטופלסט פעמיים דרך מזרק זכוכית של 50 מיליליטר בעזרת מחט צרה, ואז דגרו את הליזאט על קרח למשך עשר דקות. הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שלושה שבועות. לאחר הפשרת הצינור עם ליזאט פרוטופלסט קפוא בטמפרטורת החדר, שמור את הצינור על קרח.

Aliquot 1.8 מיליליטר של חרוזים מגנטיים אוליגו-d(T) לשישה צינורות מיקרו צנטריפוגות חדשים של שני מיליליטר תחתונים עגולים המונחים על קרח. שטפו את מתלה החרוזים בכל צינור עם 600 מיקרוליטר של מאגר קשירת ליזה על ידי פיפטינג קצר למעלה ולמטה וסובב בעדינות את החרוזים על מסובב למשך שתי דקות. שמור את החרוזים על קרח.

לאחר מכן, הנח את כל ששת הצינורות המכילים את החרוזים לתוך מתלה מגנטי למשך שלוש דקות לפחות כדי לאפשר מספיק זמן ללכידה המגנטית המלאה. כאשר החרוזים נלכדים לחלוטין, המתלה יתבהר. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט מכל ששת הצינורות ומיד הכניסו לתוכם תשעה מיליליטר של ליזאט פרוטופלסט.

מערבבים את החרוזים עם ליזאט על ידי פיפטינג עד שהמתלה נראה חום והומוגני. דגרו את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עם סיבוב עדין. לאחר הדגירה, החזר את הצינורות למתלה המגנטי למשך שלוש דקות.

כאשר כל החרוזים נלכדים בצד הצינורות, אסוף את הסופרנטנט המכיל את ליזט הפרוטופלסט לשישה צינורות מיקרו צנטריפוגה חדשים של שני מיליליטר עם תחתית עגולה. לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר של מאגר כביסה קר כקרח אחד לכל צינור המכיל חרוזים, והשהה מחדש את החרוזים על ידי פיפטינג. לאחר סיבוב עדין של דקה אחת, החזר את הצינורות למתלה המגנטי למשך שלוש דקות.

השליכו את הסופרנטנט וחזרו על שלב הכביסה הזה פעם אחת. בעזרת 1.5 מיליליטר מאגר כביסה קר כקרח שניים, חזור על אותו הליך כביסה פעמיים. אם ה-mRNP בודדו ביעילות מהליזאט של הפרוטופלסט, צריכה להיות הילה גלויה סביב גלולת החרוז בדגימת ה-CL.

לבסוף, חזור על הליך הכביסה פעם אחת עם 1.5 מיליליטר של מאגר מלח נמוך קר כקרח. לאחר הכביסה, הוסיפו 500 מיקרוליטר של מאגר פליטה לכל צינור, והשעו מחדש בעדינות את החרוזים על ידי פיפטינג. דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות כדי לשחרר את ה-RNA בעל זנב הפולי-A.

השעו מחדש בעדינות את החרוזים על ידי פיפטינג פעם אחת והניחו את הצינורות בחזרה למתלה המגנטי בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מעבירים ומשלבים חומרים מכל ששת הצינורות לתוך צינור תחתון חרוטי של 15 מיליליטר המונח על קרח. זה יניב כשלושה מילימטרים מהנוזל.

ניתן לקבוע את איכות וכמות ה-RNA באופן מיידי באמצעות ספקטרופוטומטר. הכן את חרוזי האוליגו-ד(T) לשימוש חוזר על ידי שטיפתם פעמיים עם מיליליטר אחד של מאגר פליטה קר כקרח. לאחר מכן, שטפו אותם עם מיליליטר אחד של מאגר קשירת ליזה קר כקרח כדי להתאים את ריכוז המלח בחזרה ל-500 מילימולר.

השתמש בחרוזי oligo-d(T) שטופים אלה כדי לחזור על הליכי הכריכה, הכביסה והפליטה למשך שני סבבים נוספים. זה ידלדל את ה-RNA בעל זנב הפולי-A מהליזאט של הפרוטופלסט ויניב בסך הכל תשעה מילימטרים של חומר נוזל לכל דגימה. ניתן לאחסן חרוזים ולהשתמש בהם לניסוי נוסף למשך שלוש פעמים לכל היותר.

כדי לבדוק את איכות ה-RNA, עכל את החלבונים המקושרים ל-UV עם תמיסת חלבון K בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, טהר את ה-RNA באמצעות ערכת טיהור ה-RNA כדי להסיר את כל המזהמים הנותרים. לאחר הטיהור, הדגימות מוכנות לבדיקת איכות ה-RNA באמצעות qRT-PCR.

התחל בטיפול בשמונה מיליליטר מכל דגימה עם 100 יחידות של קוקטייל RNAse המכיל RNAse A ו-RNAse T1. לאחר מערבולת קצרה, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי לרכז חלבונים קושרים mRNA, או mRBP, סנן את הדגימות באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות. כל דגימה תניב 75 מיקרוליטר עם שני מיקרוגרם חלבון.

לאחסון לטווח הארוך, הקפיאו את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להפעיל ג'ל של דף SDS, ערבבו 25 מיקרוליטר מכל דגימה מרוכזת עם 15 מיקרוליטר של צבע טעינה פי 2 וחממו את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. טען את הדגימות בטוש חלבון על ג'ל SDS-page עם ג'ל ערימה של חמישה אחוזים וג'ל ממיס שנים עשר אחוז.

לאחר מכן, שטפו את הג'ל פעמיים במים טהורים במיוחד למשך חמש דקות בכל שטיפה. השתמש בערכת צביעת כסף מסחרית כדי להכתים את הג'ל. אם נעשה שימוש במספר מספיק של פרוטופלסטים התחלתיים, רצועות החלבון יופיעו תוך חמש דקות.

כדי לבדוק עוד יותר את ה-mRBP, טהר את הפפטידים מג'ל שני של עמוד 1D כפי שמוסבר בפרוטוקול הטקסט. כעת ניתן לנתח את הפפטידים המטוהרים הללו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ננו-הפוכה, ספקטרומטריית מסה ופרוטאומיקה איכותית וכמותית. לאחר לכידת חרוזי oligo-d(T), qRT-PCR הראה רמות גבוהות משמעותית של mRNA ייחוס פולי יוביקוויטין 10 לעומת 18S rRNA.

מכיוון שחרוזי oligo-d(T) נקשרים רק ל-RNA זנב פולי-A, זה מצביע על כך ש-mRNA מועשר בנוזל. לכידת mRBP על ידי חרוזי oligo-d(T) מוערכת עוד יותר על ידי ג'ל SDS-page מוכתם בכסף. הג'ל מראה כמות חלבון גבוהה משמעותית בדגימת CL צולבת UV לעומת דגימת שאינה CL שאינה מקושרת.

משך הקרנת ה-UV יכול להשפיע על יעילות הקישור הצולב. ג'ל SDS-page מוכתם בכסף מאשר שדקה או שלוש של קרינת UV היא המצב האופטימלי, עם עוצמות הרצועה החזקות ביותר. בסך הכל זוהו 325 חלבונים על ידי ניתוח פרוטאומיקה כמותית.

225 מהחלבונים הללו היו מתחת לרמת המובהקות בשל שפע נמוך של פפטידים הקיימים עבור כל חלבון, עם שונות גבוהה של עוצמות הפפטיד. עם זאת, מכיוון שכולן זוהו באופן איכותי רק בדגימות CL, כולן נחשבו לתוצאות חיוביות. 325 החלבונים הללו סווגו עוד יותר לשלוש קטגוריות, חלבונים ריבוזומליים, RBP ראשי ו-RBP מועמדים.

ל-RBP המועמד חסרים תחומי קשירת RNA קונבנציונליים ורוב תפקידיהם לא אומתו, מה שמרמז על פונקציות חדשות אפשריות בוויסות RNA. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מסלולי הוויסות המולקולרי בצמחים לחקור פרוטאום הקשור ל-RNA שליח ברחבי הגנום בתאים ורקמות של דיקוטים וחד-קוטיים.