ברזולוציה גבוהה ההיתוך PCR עבור המשלים קולטן 1 אורך פולימורפיזם גנוטיפינג: כלי חדשני למחלת אלצהיימר הערכת רגישות גנים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשלים גנוטיפ פולימורפיזמים באורך קולטן 1 לשימוש בהערכת רגישות למחלות, כגון מחלת אלצהיימר, כדי להבין טוב יותר את תפקידם של איזופורמים CR1 בפתוגנזה של מחלות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כמו הפתוגנזה של מחלת אלצהיימר. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא אינה דורשת דגימות דם טריות והיא קלה יותר, זולה יותר, מהירה יותר ולכן ישימה לאוכלוסיות גדולות יותר.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר אנו מזהים את האתגרים בביצוע כתמים מערביים מבחינת הזמן הדרוש והצורך בדגימות דם טריות. פיפטה 20 מיקרוליטר של פרוטאינאז K לתחתית צינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר דגימה לצינור.

הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה לדגימה. מערבבים במערבולת דופק למשך 15 שניות. לאחר הערבוב יש לדגור בחום של 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמבט מים.

צנטריפוגה קצרה את צינור ה-1.5 מיליליטר כדי להסיר את הטיפות מבפנים של המכסה. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר אתנול לדגימה. מערבבים שוב על ידי מערבולת דופק למשך 15 שניות לפני צנטריפוגה קצרה של הצינור כמו קודם.

לאחר מכן, מרחו בזהירות את התערובת על עמוד הממברנה בצינור איסוף של שני מיליליטר. מבלי להרטיב את השפה, סגור את המכסה והצנטריפוגה ב 6, 000 פעמים G למשך דקה אחת. הנח את עמוד הממברנה בצינור איסוף נקי של שני מיליליטר והשליך את הצינור המכיל את המסנן.

פתח בזהירות את עמוד הממברנה והוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה מבלי להרטיב את השפה. סגור את המכסה והצנטריפוגה ב 6, 000 פעמים G למשך דקה אחת. לאחר מכן, הנח את עמוד הממברנה בצינור איסוף נקי של שני מיליליטר והשליך את הצינור המכיל את המסנן.

לאחר פתיחת עמוד הממברנה בזהירות, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה שניים מבלי להרטיב את השפה. סגור את המכסה והצנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הנח את עמוד הממברנה בצינור איסוף חדש של שני מיליליטר וצנטריפוגה שוב.

לאחר צנטריפוגה, הנח את עמוד הממברנה בצינור נקי של 1.5 מיליליטר והשליך את צינור האיסוף המכיל את המסנן. פתח בזהירות את עמוד הממברנה והוסף 200 מיקרוליטר מים מזוקקים. דגרו את העמוד בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפני צנטריפוגה בטמפרטורה של 6, 000 פעמים G למשך דקה אחת.

כדי לבצע את פרוטוקול HRM-PCR, תחילה יש לדלל את דגימות ה-DNA בצינורות של 1.5 מיליליטר במים לריכוז של 10 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, יש לדלל את תמיסות הפריימר המופשרות בצינורות של 1.5 מיליליטר במים לאותו ריכוז של שש מיקרומולר. הפשירו את פתרונות ערכת HRM-PCR וערבבו בזהירות על ידי מערבולת כדי להבטיח שחזור של כל התכולה.

סובב בקצרה את שלושת הבקבוקונים המכילים תערובת אנזימטית עם צבע קושר DNA, מגנזיום כלוריד ומים במיקרו-צנטריפוגה לפני פתיחתם. בשפופרת של 1.5 מיליליטר בטמפרטורת החדר, השתמש ברכיבים כדי להכין את תערובת ה-PCR לתגובה של 120 מיקרוליטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מערבבים בזהירות על ידי מערבולת.

זה קריטי שתעבוד עם תשומת לב ויישום על פי פרקטיקה טובה בביולוגיה מולקולרית. פיפטה 19 מיקרוליטר של ה-PCR מתערבבים בכל באר של צלחת לבנה מרובת בארות. הוסף מיקרוליטר אחד מתבנית ה-DNA המותאמת לריכוז, ולאחר מכן אטום את צלחת הבאר הלבנה בנייר כסף

צנטריפוגה את הצלחת הלבנה מרובת הבארות למשך דקה אחת ב -1, 500 פעמים G בצנטריפוגה רגילה של דלי נדנדה המכילה רוטור לצלחות מרובות בארות עם מתאמים מתאימים. טען את הצלחת הלבנה מרובת הבארות למכשיר HRM-PCR. הפעל את תוכנית HRM-PCR עם תנאי ה-PCR הנמצאים בפרוטוקול הטקסט.

בעקבות תגובת HRM-PCR, בצע ניתוח HRM כדי לקבוע את הפולימורפיזם באורך CR1 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עקומות היתוך נותחו באמצעות התוכנה לאחר התכה ברזולוציה גבוהה של האמפליקונים שמקורם ב-PCR מה-DNA הגנומי של נבדקים עם איזופורמים שונים של CR1. התוצאות הן עקומות המפלות נבדקים על פי פנוטיפים של ביטוי CR1 האלוטיפי שלהם.

כפי שמוצג על ידי שני מצבי ההצגה, עקומות התכה מנורמלות ומוסטות ועלילה הפרש מנורמל ומוסט טמפ', פרופילי העקומה מחולקים לפי כוכב CR1 שלוש, כוכב CR1 קבוצה אחת, כוכב CR1 קבוצה שתיים, כוכב CR1 קבוצה אחת, כוכב CR1 קבוצה שנייה וכוכב CR1 שתיים, CR1 כוכב ארבע קבוצה. עקומות אלה תואמות את אללי הפולימורפיזם באורך CR1. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגנוטיפ בקלות את הפולימורפיזם באורך CR1 על פי עקומות מושלמות המתקבלות על ידי HRM-PCR.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הצורך בדגימות ייחוס של גנוטיפים באורך CR1 שכבר ידועים. כאשר שולטים בטכניקה זו, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באותו ריכוז עבור כל דגימת DNA.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף DNA חרוטי על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מציאת SNP פרטי ידוע חדש. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הגנטיקה של אוכלוסיות לחקור את הלחץ הסלקטיבי של פתוגנים בפולימורפיזם באורך CR1. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי רגישות לפתוגנזה של מחלת אלצהיימר, ניתן ליישם אותה גם במחקרים אחרים של מחלות כגון זאבת אדמנתית מערכתית ומלריה.