שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

המטרה הכללית של פרוצדורה ניסויית זו היא לאפשר הכנה של גרעינים באיכות גבוהה משריר שלד מקושר (cross-linked), אשר ניתן להשתמש בהם לאחר מכן למחקרי שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי השריר והשעון הביולוגי, כגון מחקרים גנומיים המשתמשים ברקמות ותאי שריר בהקשר של השעון הביולוגי או הקשרים רגישים אחרים לזמן. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת קישור מיידי של דגימות, והפרוצדורה המבוססת על סינון יכולה להתבצע באופן מהימן כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה עם זיהום מינימלי של סיבי שריר (myofibrils).

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שריר שלד, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות כגון שרירי לב ושרירים חלקים. שקלו וקצצו שריר שלד מהגפיים האחוריות שבודד מעכברים זכרים מסוג C57 black six בני כ-20 שבועות, בתוך תמיסת פוספט מאוזנת (PBS) קרה בקרח, כפי שתיאור בעבר. העבירו את רקמת שריר השלד הקצוצה לשפופרת קונית של 50 milliliters המכילה 10 milliliters של PBS על קרח.

לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסירו בזהירות את עליית ה-PBS באמצעות שאיבה. העריכו את נפח המשקע בכל מבחנה של 50 מיליליטר באמצעות מבחנות ייחוס המכילות אחת, שתיים, שלוש וארבעה מיליליטר של מים.

הוסיפו שבעה נפחים של 1% formaldehyde ו-PBS קרים מאוד (בקרח) והומוגניזו את הדגימות על קרח באמצעות הומוגנייזר רקמות עם פרובה (probe tissue homogenizer). לאחר מכן, בצעו קשירה צולבת (cross-link) לדגימה על ידי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. עצרו את תגובת הקשירה הצולבת על ידי הוספת glycine בריכוז של one molar עד לריכוז סופי של 0.125 molar, ולאחר מכן דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר סבב צנטריפוגה של הדגימה ב-3,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות שאיבה. שטפו את המשקע על ידי ריסוספנזיה ב-10 milliliters של בופר בסיס קר מאוד המכיל מעכבי פרוטאזה שהוספו באופן טרי. סובבו את הדגימה פעם נוספת בצנטריפוגה והסירו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות שאיבה.

לאחר מכן, השעו את המשקע בשישה מיליליטר של lysis buffer המכיל מעכבי פרוטאז שהתווספו הअभी. העבירו את הדגימה ל-Dounce homogenizer בנפח 15 מיליליטר שקולל מראש, והדגירו למשך 10 דקות על קרח. בצעו הומוגניזציה באמצעות Dounce לכל דגימה על קרח, באמצעות 15 תנועות איטיות עם פסטל רפוי, ולאחריהן 15 תנועות עם פסטל הדוק לשחרור הגרעינים.

שלבי הסינון הבאים הם המפתח לבידוד גרעינים באיכות גבוהה. סננו את ההומוגנאט דרך מסננת תאים ושטפו עם ארבעה מיליליטר של תמיסת ליזיס. לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-1,000 times g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

שחזר את המשקע בחמישה מיליליטר של בופר בסיס (base buffer) קר בקרח, ובצע דאנס (Dounce) 10 פעמים באמצעות פסטל הדוק כדי לשחרר את הגרעינים. לאחר מכן, סנן את התוך-סביבה דרך מסנן תאים, שטוף את המבחנה עם שני מיליליטר של בופר בסיס וסנן שוב. חזור על הסינון עם מסנני תאים בעלי גודל נקבים קטן יותר באופן הדרגתי.

לבסוף, סובבו בצנטריפוגה ב-1,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ושסעו מחדש את המשקע ב-500 µL של בופר בסיס לפני סבב צנטריפוגה נוסף. השליכו את הנוזל העליון ואחסנו את המשקע במינוס 80 מעלות צלזיוס.

הפשיתו את הדגימות ב-500 microliters של SDS lysis buffer והחזירו למצב תהמי (resuspend) באמצעות פיפטינג עדין. העבירו את ת сусפנסיית ה-DNA הגרעינית למבחנה מזכוכית על קרח. בחירת פלטפורמת הסוניקציה והתנאים המתאימים היא קריטית להכנת כרומטין מגרעינים מבודדים.

בצע את הסוניקציה באמצעות פולסים מרוכזים של אנרגיה אקוסטית אולטרסונית ממיתר בצורת דיסק, בהתאם להגדרות המפורטות בפרוטוקול הכתוב. העבר את הכרומטין שעבר סוניקציה לשפופרת של 1.5 milliliters. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה ב-12,000 $\times g$ למשך 15 דקות והעבר את העילאי לנפח שפופרת חדשה.

לאחר מכן, העבירו 50 µL מהדגימה שעברה סוניקציה למבחנה חדשה בנפח 1.5 mL לצורך ביטול קשירה (reverse cross-linking) במהלך הלילה בטמפרטורה של 65 °C. איסוף דגימות ה-DNA מתואר בסעיף הבא. לאחר הערכת הסוניקציה והכמות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, חלקו את הכרומטין שהופשר לאליקוטיים של כ-100 עד 120 µg למבחנה.

לאחר מכן, דללו את הכרומטין ביחס של 1:10 עם באפר immunoprecipitation. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של סלרי (slurry) בריכוז 50% של BSA pre-blocked protein HE agarose או של חרוזי IgY, והדגירו ברוטטור למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר סבב צנטריפוגה של הדגימה ב-1,000 ×g למשך 10 דקות, העבירו בזהירות את העילוי למבחנות חדשות.

לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים בריכוז של 1 µg נוגדן לכל 25 עד 100 µg של DNA של כרומטין. סובבו בעדינות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C ובמהירות של כ-15 rpm. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של חרוזי agarose מסוג HE Protein שחסומו מראש ב-BSA או חרוזי IgY וערבבו.

סובב את תגלי השמיגות בחדר הקירור למשך שעתיים. לאחר מכן, שטוף את השמיגות בעזרת RIPA buffer, ולאחר מכן ב-high salt buffer, lithium chloride buffer ו-Tris EDTA כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר השטיפה, בצע אלוציה של ה-DNA מהשמיגות על ידי צנטריפוגציה ראשונית ב-1,000 ×g למשך דקה אחת והסרה זהירה של העל-נוזל (supernatant).

שחזר את החרוזים ב-50 µL של תמיסת אלואציה. לאחר מכן, דגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 65 °C. לאחר הדגירה, סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 12,000 ×g למשך חמש דקות.

הסיר את הנוזל העליון והוסף 50 µL נוספים של באפר אלוקציה (elution buffer) לפני צנטריפוגה חוזרת ב-12,000 ×g למשך חמש דקות. נפח האלוקציה הסופי יהיה 100 µL. כדי לבצע ביטול של הקשרים הצולבים (reverse cross-link) ואלוקציה של ה-DNA, דגרי תחילה את הכרומטין שאלוקציה בו בלילה במערך של 65 °C.

לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של RNase A לפני דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, דגרו עם שמונה מיקרוליטרים של protease K בריכוז 10 mg/mL למשך 30 דקות בטמפרטורה של 55 °C. נקו את ה-DNA באמצעות ערכת PCR cleanup עם נפח אלucian של 50 µL, בהתאם לפרוטוקול היצרן.

לבסוף, יש לנתח את הפרופילים באמצעות real-time QPCR כפי שתואר בעבר. סינון רצפי הסיר ביעילות שאריות רקמה. תמונות מייצגות של דגימות לאחר הסינון הראשוני ולאחר סינון סדרתי מוצגות כאן לצורך השוואה.

פירוק הדרגתי של הכרומטין באמצעות 10 מחזורי סוניקציה נחשף באמצעות הרצת ג'ל אגרוז. 10 מחזורי סוניקציה של הכרומטין שעבר עיכול הניבו DNA באורך של כ-500 זוגות בסיסים. כאן מוצגות תוצאות QPCR מייצגות עבור B זכרים one chIP עם דגימות של שריר שלד של עכבר שנאספו ב-ZT6 וב-ZT18.

ניתוח של מרכיבי מיקומי ה-Dbp בגן ה-Dbp העלה כי, בדומה לתוצאות קודמות, שיאי קישור מופיעים בסביבות ZT6. ברגע שהתהליך נשלט, ניתן לבצע הפרה של גרעינים בתוך חמש עד שש שעות, אם הדבר נעשה בצורה נכונה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בשיטות מבוססות סינון כדי לטהר גרעינים איכותיים ו-DNA של כרומטין מרקמת שריר שנקשרה (cross-linked).

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור את הדגימות על קרח או בחדר קירור, ולשמור מנות (aliquots) מהדגימה לבדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי שלבי הסינון. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי השריר והגנומיקה לחקור דינמיקה צירקדית או תלוית-זמן של אינטראקציה בין כרומטין לחלבונים ברקמות שריר שונות. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון ChIP-sequencing כדי לענות על שאלות נוספות, למשל בחינת דפוסים של קישור גורמי שעתוק ברקמות שריר.