שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא לאפשר הכנה של גרעינים איכותיים משרירי שלד צולבים אשר יוכלו לשמש לאחר מכן למחקרי משקעים חיסוניים של כרומטין. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום השרירים והשעון הביולוגי, כגון מחקרים גנומיים המשתמשים ברקמות שריר ותאים בהקשר צירקדי או רגיש אחר לזמן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת קישור צולב מיידי של דגימות וניתן לבצע את ההליך מבוסס הסינון באופן אמין כדי לבודד גרעינים איכותיים עם זיהום מינימלי של מיופיבריל.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שרירי השלד, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון שרירים לבביים וחלקים. שקלו וטחנו את שרירי השלד בגפיים האחוריות שבודדו משישה עכברים שחורים בני 20 שבועות במלח קר פוספט כפי שתואר קודם לכן. מניחים את רקמת שריר השלד הטחון בצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS על קרח.

לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-300 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסר בזהירות את ה-PBS supernatant על ידי שאיפה. העריכו את נפח הגלולה בכל צינור של 50 מיליליטר באמצעות צינורות ייחוס עם אחד, שניים, שלושה וארבעה מיליליטר מים.

הוסף שבעה נפחים של 1% פורמלדהיד קר כקרח ו-PBS והומוגניזציה של הדגימות על הקרח באמצעות הומוגנייזר רקמת בדיקה. לאחר מכן, הצליבו את הדגימה על ידי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. להרוות את תגובת הקישור הצולב באמצעות הוספת גליצין מולארי אחד לריכוז סופי של 0.125 מולארי ואחריו דגירה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר צנטריפוגה של הדגימה ב-3,000 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט באמצעות שאיפה. שטפו את הגלולה על ידי השעייתה מחדש ב-10 מיליליטר של מאגר בסיס קר כקרח המכיל מעכבי פרוטאז טריים שנוספו. צנטריפוגה שוב את הדגימה והסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיפה.

לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בשישה מיליליטר של מאגר ליזה המכיל מעכבי פרוטאז טריים שנוספו. העבירו את הדגימה להומוגניזטור Dounce 15 מיליליטר מקורר מראש ודגרו במשך 10 דקות על קרח. Dounce הומוגניזציה של כל דגימה על קרח עם 15 משיכות איטיות באמצעות עלי רופף ואחריו 15 משיכות עם עלי הדוק כדי לשחרר את הגרעינים.

שלבי הסינון הבאים הם המפתח לבידוד גרעינים איכותיים. מסננים את ההומוגנאט דרך מסננת תאים ושוטפים עם ארבעה מיליליטר של מאגר ליזה. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב -1, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של חיץ בסיס קר כקרח ודאונס 10 פעמים עם עלי הדוק כדי לשחרר את הגרעינים. לאחר מכן מסננים את המתלה דרך מסננת תאים ושוטפים את הצינור עם שני מיליליטר מאגר בסיס ומסננים שוב. חזור על הסינון עם מסננות תאים בגודל נקבוביות מופחת בהדרגה.

לבסוף, צנטריפוגה ב -1, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר בסיס לפני הצנטריפוגה שוב. השליכו את הסופרנטנט ואחסנו את הכדור במינוס 80 מעלות צלזיוס.

הפשירו את הדגימות ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה SDS והשעו מחדש עם פיפטינג עדין. העבירו את תרחיף ה-DNA של הגרעינים לבקבוקון זכוכית על קרח. בחירת פלטפורמת הסוניקציה והמצב הנכונים היא קריטית להכנת כרומטין מגרעינים מבודדים.

הפעל את הסוניקציה עם התפרצויות ממוקדות של אנרגיה אקוסטית אולטראסונית ממתמר בצורת דיסק באמצעות ההגדרות המתוארות בפרוטוקול הטקסט. העבירו את הכרומטין הסוניקטיבי לצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה ב-12,000 פעמים גרם למשך 15 דקות והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש.

לאחר מכן, העבירו 50 מיקרוליטר מהדגימה הסוניקטיבית לצינור חדש של 1.5 מיליליטר לקישור צולב הפוך למשך הלילה ב-65 מעלות צלזיוס. קצירת דגימות ה-DNA מתוארת בסעיף הבא. לאחר הערכת סוניקציה וכימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ציטט את הכרומטין המופשר לכ-100 עד 120 מיקרוגרם לשפופרת.

לאחר מכן יש לדלל את הכרומטין מ-1 עד 10 עם מאגר אימונו-משקעים. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של 50% slurry של חרוזי HE agarose או IgY חסום מראש של BSA ודגירה על מסובב למשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה של הדגימה ב -1, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות, העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינורות חדשים.

לאחר מכן הוסף נוגדנים במיקרוגרם אחד של נוגדן לכל 25 עד 100 מיקרוגרם של DNA כרומטין. יש לסובב בעדינות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ובכ-15 סל"ד. לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוליטר של חלבון BSA חסום מראש HE agarose או חרוזי IgY ומערבבים.

סובב את מתלה החרוזים בחדר הקירור למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו את החרוזים עם מאגר RIPA ואחריו מאגר מלח גבוה, מאגר ליתיום כלוריד ו-Tris EDTA כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר הכביסה, הסירו את ה-DNA מהחרוזים על ידי צנטריפוגה ראשונה ב-1,000 פעמים גרם למשך דקה אחת והסרה זהירה של הסופרנטנט.

השעו מחדש את החרוזים עם 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה. לאחר מכן יש לדגור למשך 10 דקות בחום של 65 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים גרם למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט והוסף עוד 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה לפני הצנטריפוגה שוב ב -12,000 פעמים גרם למשך חמש דקות. נפח הפליטה הסופי יהיה 100 מיקרוליטר. כדי להפוך קישור צולב ולבצע שטיפת DNA, תחילה דגרו על הכרומטין המנומק למשך הלילה ב-65 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של RNase A לפני הדגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגרו עם שמונה מיקרוליטר של 10 מיליגרם למיליליטר פרוטאז K למשך 30 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. קצור את ה-DNA באמצעות ערכת ניקוי PCR בנפח פליטה של 50 מיקרוליטר לפי פרוטוקול היצרן.

לבסוף, נתח את הפרופילים על ידי QPCR בזמן אמת כפי שתואר קודם לכן. סינון רציף הסיר ביעילות פסולת רקמות. תמונות מייצגות של דגימות לאחר הסינון הראשוני ולאחר סינון סדרתי מוצגות כאן להשוואה.

גריסת כרומטין מתקדמת דרך 10 מחזורי סוניקציה מתגלה באמצעות הפעלת ג'ל אגרוז. 10 מחזורי סוניקציה עם הכרומטין המעוכל הביאו ל-DNA של כ-500 זוגות בסיסים. כאן, מוצגות תוצאות QPCR מייצגות עבור זכרי B chIP אחד עם דגימות שרירי שלד של עכבר שנאספו ב-ZT6 ו-ZT18.

ניתוח של אלמנטים של מיקומי Dbp בגן Dbp גילה כי עקבי עם תוצאות קודמות שיאי קשירה בסביבות ZT6. לאחר השליטה, הכנת הגרעינים יכולה להיעשות תוך חמש עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשיטות המבוססות על סינון כדי לטהר גרעינים ו- DNA כרומטין באיכות גבוהה מרקמת שריר צולבת.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור דגימות על קרח או בחדר קירור ולשמור דגימות לבדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי שלבי הסינון. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום השרירים והגנומיקה לחקור דינמיקה צירקדית או רגישה לזמן של אינטראקציה בין כרומטין לחלבון ברקמות שריר שונות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף chIP על מנת לענות על שאלות נוספות כמו לחפש דפוסים של קשירת גורם שעתוק ברקמות השריר.