Name: שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: למדו שיטת סינון לבידוד גרעינים באיכות גבוהה משריר שלד צולב בעכברים לצורך ChIP. הפרוטוקול מבטל צנטריפוגה אולטרה ומפחית זיהום מיופיברילים לחקר גנומיקה ומחזוריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Karyn אסר, נובויה Koike ו Noheon פארק עצה מועילה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי NIH / NIGMS (R01GM114424) ל- S.-HY, ו- Robert A. Welch Foundation (AU-1731) ו- NIH / NIA (R01AG045828) ל- ZC

טיפול בבעלי חיים בוצע תחת טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת הוועדה (IACUC) הנחיות, והנהלים נערכו על פי פרוטוקול בעלי חיים שאושרו על ידי אוניברסיטת טקסס הבריאות המרכז ביוסטון. 1. בידוד גרעיני מן שרירי השלד הצלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולכפות את שרירי הגפיים מאחורי שריר השלד, מבודדים מן כ 20 שבועות בשבוע C57BL / 6 עכברים זכר, ב פוספט קר כקרח שנאגרו מלוחים (PBS) כמתואר בפירוט בעבר 22 . הערה: בדרך כלל אנו מקבלים 1.0 - 1.5 גרם של שריר השלד מעכבר אחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים רקמת שריר השלד ממוקש בצינור 50 מ&quot;ל חרוטי המכיל 10 מ&quot;ל PBS על הקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 300 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות PBS supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת נפח גלולה בכל צינור 50 מ&quot;ל באמצעות צינורות התייחסות עם 1, 2, 3 ו 4 מ&quot;ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 כרכים שלקרח קר 1% פורמלדהיד ב PBS ו homogenize דגימות על הקרח באמצעות homogenizer רקמות בדיקה (ראה טבלה של חומרים ). הערה: אופציונלי: הליך homogenization יכול להתבצע בחדר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות את המדגם על ידי דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הצלב מקשר התגובה על ידי תוספת של גליצין 1 M לריכוז סופי של 0.125 M ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב XG 3000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant באמצעות שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 10 מ&quot;ל של חיץ בסיס קר (10 מ&quot;מ HEPES-KOH ב pH 7.3, 10 מ&quot;מ EDTA, 10 מ&quot;מ KCl, 5 מ&quot;מ MgCl 2 , 0.5 מ&quot;מ DTT) המכילים מעכבי פרוטאז שנוספו טרי (0.2 mM phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) , ו 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​leupeptin). צנטריפוגה ב 3000 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 6 מ&quot;ל של חיץ תמוגה (10 מ&quot;מ HEPES-KOH ב pH 7.3, 10 מ&quot;מ EDTA, 10 מ&quot;מ KCl, 5 מ&quot;מ MgCl 2 , 0.5 מ&quot;מ DTT, 1% Triton X-100) המכילים מעכבי פרוטאז הוסיף (טון 0.2 PMSF, ו 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​leupeptin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המדגם למוצר preuncill 15 מ&quot;ל Dounce ו דגירה במשך 10 דקות על hom.Dounce homogenize כל מדגם על הקרח עם 15 משיכות איטיות באמצעות העלי רופף ואחריו 15 משיכות עם עלי חזק לשחרר את הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן homogenate (6 מ&quot;ל) באמצעות מסננת התא (גודל הנקבוביות: 100 מיקרומטר) ולשטוף עם 4 מ&quot;ל של חיץ תמוגה. צנטריפוגה דגימות ב 1000 xg במשך 10 דקות ב 4 ° C. Resuspend לתוך 5 מ&quot;ל של חיץ בסיס קר כקרח ו dounce 10 פעמים עם עלי חזק לשחרר גרעינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר aliquot של 20 μL למדידת ריכוז ה- DNA עם ספקטרופוטומטר (OD260 / OD280) ו תצפית מיקרוסקופית עם כחול trypan אם יש צורך (ראה להלן) ( איור 1 א ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה באמצעותמסננת התא (גודל הנקבוביות: 70 מיקרומטר), לשטוף את הצינור ואת המסנן שוב עם חיץ בסיס 2 מ&quot;ל כאמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על סינון כמו בשלב 1.13 עם מסננים התא של גודל הנקבוביות מופחת בהדרגה (40 מיקרומטר, 30 מיקרומטר, 20 מיקרומטר ו 10 מיקרומטר). הערה: בסך הכל, מסננים של 6 גודל הנקבוביות שימשו צעדים 1.12-1.14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1000 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend גלולה במאגר מאגר 500 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז DNA כאמור. הערה: כ 200 מיקרוגרם של DNA גרעיני התקבל משילוב שתי הגפיים האחוריות מחיה אחת. לחלופין, שמור 20 μL עבור תצפית מיקרוסקופית עם מכתים כחול trypan (ריכוז מלאי 0.4%, דילול 1: 5); גרעיני יהיה כתם כחול ( איור 1 ב &#39; ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1000 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולזנוח supernatant. חנות גלולה ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. Sonication &lt;Ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות להפשיר 500 μL של חיץ תמוגה SDS ו resuspend עם pipetting עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה DNA גרעינים בקבוקון זכוכית על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את sonication עם התפרצויות ממוקדות של אנרגיה אקוסטי קולי מתוך מתמר בצורת צלחת. ראה טבלת חומרים לפרטי הציוד. השתמש בהגדרה הבאה: מחזורים לכל פרץ: 200; אינטנסיביות: 5; חובה מחזור: 20; טמפרטורה 4 - 6 ° C; 30 הפעלה / כיבוי. הערה: דוגמה להערכת יעילות sonication מוצג באיור 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הכרומטין sonicated לצינור 1.5 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 15 דקות ולהעביר supernatant לצינור חדש. העברת 50 μL של דגימות sonicated (~ 7 - 10 מיקרוגרם / דגימת שריר) לתוך צינור חדש 1.5 מ&quot;ל עבור crosslinking לאחור ב 65 מעלות צלזיוס. להקפיא את הדגימות שנותרו ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. הערכה של Sonication ו quantitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.0ΜL של RNase A (500 U / מ&quot;ל ​​RNase A: 20,000 U / מ&quot;ל ​​RNase T1) ל 50 נשמר דוגמאות μL sonicated ו דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μL של פרוטאז K (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו דגירה 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את ה- DNA באמצעות ערכת מיצוי DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 כרכים של חיץ מחייב, להחיל אותו על ספין טור, צנטריפוגה ב XG 4,000, 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את המעבר על גבי אותו עמודה צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חיץ כביסה פעמיים ב 13,000 XG, 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שוב ב 13,000 XG, 1 דקות לייבש את הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של H 2 O ו צנטריפוגה ב XG 13,000, 1 דקות כדי DNA elute. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את המעבר על גבי אותו עמודה צנטריפוגות שוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את כמות ה- DNA עם ספקטרופוטומטר (OD260 / OD280). הפעל דגימות על ג &#39;ל 0.8% כדי להעריך את גודל וכמות (1 מיקרוגרם) של מוצרים sonicated ( איור 2 ). הערה: התשואה הכרומטין הממוצע הוא כ ~ 20%. </li></ol> 4. שבב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הכרומטין שנשמרו בעבר ב -80 מעלות צלזיוס aliquot הכרומטין ~ 100-120 מיקרוגרם לכל צינור. מדולל 01:10 עם חיישן (RIPA) רדיואקטיבי (20 מ&quot;מ טריס- HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1mm EDTA, 1MM NaF, 1mM Na3VO4, 1mm PMSF, קוקטייל 1x Protease inhibitor (PIC), 0.1% Na-deoxycholate W / v), 1% Triton X-100). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש מספר דגימות בכל קבוצה, לשלב כמויות שוות של DNA הכרומטין לסכום הסופי של ~ 100-120 מיקרוגרם / מדגם. שמור 10% כקלט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μL (50% V / V slurry במאגר RIPA) של BSA מראש חסומה (~ 2 שעות, 4 ° C) חלבון A / G agose (נוגדנים שאינם עוף) או חרוזים IgY (נוגדנים עוף) ו דגירה ב סיבוב עבור 3 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1000 xg, 10 דקות בזהירות להעביר את supernatant צינורות חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדנים 1 נוגדן μg לכל ~25 - 100 מיקרומטר DNA הכרומטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב בעדינות על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה בסביבות 15 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של BSA מראש חסומה (~ 2 שעות, 4 ° C) חלבון A / G agarose (נוגדנים שאינם עוף) או חרוזים IgY (נוגדנים עוף) לערבב לסובב בחדר קר במשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו חרוזים כדלקמן. לשטוף עם 1 מ&quot;ל של חיץ RIPA במשך 3 דקות פעמיים, לשטוף עם 1 מ&quot;ל של חיץ מלח גבוהה (20 מ&quot;מ Tris-HCl (pH 7.4), 500mM NaCl, 2mm EDTA, 1mm PMSF, 1% Triton X-100) במשך 3 דקות פעמיים , לשטוף עם 1 מ&quot;ל של חיץ LiCl (20mM Tris-HCl (pH 7.4), 250mm LiCl, 2mm EDTA, PMSF 1mm, 1% Na-deoxycholate, 0.5% NP40) במשך 3 דקות פעמיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 1 מ&quot;ל של טריס-EDTA (TE) חיץ (10mm Tris-HCl (pH 7.4), 1mm EDTA) במשך 3 דקות פעם אחת. ואז elute DNA עם חיץ elution (20 מ&quot;מ Tris-HCl, 5 מ&quot;מ EDTA ו 0.5% SDS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1000 גרם, 1 דקות בזהירות להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוז עם 50 μL של חיץ elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 10דקות ב 65 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 12,000 גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לצינור חדש, להוסיף עוד 50 μL ו צנטריפוגה שוב ב 12,000 גרם במשך 5 דקות. נפח elution הסופי יהיה 100 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך crosslinking ו elution DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור את הכרומטין eluted לילה ב 65 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.0 μL של RNase ו דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μL של פרוטאז K (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו דגירה 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ה- DNA באמצעות ערכת ניקוי PCR עם נפח elution ב 50 μL לפי פרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הפרופילים על ידי qPCR בזמן אמת כפי שתואר לעיל 25 , 26 . הערה: רצפים תחלתי מופיעים באיור 3 מקרא . הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM ( איור 3 ). </li></ol>

<ol><li>Bouzakri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-based+gene+silencing+reveals+specialized+roles+of+IRS-1%2FAkt2+and+IRS-2%2FAkt1+in+glucose+and+lipid+metabolism+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle.</a> Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).</li>
<li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).</li>
<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meter+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li>
<li>Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+circadian+signaling+networks+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets.</a> Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).</li>
<li>Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms%2C+the+molecular+clock%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle.</a> J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).</li>
<li>Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+circadian+and+sleep+cycles+to+protect+against+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35(2015).</li>
<li>Harfmann, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+loss+of+Bmal1+leads+to+disrupted+tissue+glucose+metabolism+and+systemic+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis.</a> Skelet Muscle. 6, 12(2016).</li>
<li>Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscles%2C+exercise+and+obesity%3A+skeletal+muscle+as+a+secretory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ.</a> Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Jackson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+histone+organization+in+the+nucleosome+using+formaldehyde+as+a+reversible+cross-linking+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent.</a> Cell. 15 (3), 945-954 (1978).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Takahashi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+RNA-seq+methods+to+study+circadian+control+of+transcription+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals.</a> Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).</li>
<li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein%3ADNA+associations+in+a+chromatin+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li>
<li>Chen, Z., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+promoter+elements+and+TAFs+contribute+to+the+diversity+of+transcriptional+activation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates.</a> Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).</li>
<li>Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+PER+repression+mechanisms+in+the+Drosophila+circadian+clock%3A+from+on-DNA+to+off-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA.</a> Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).</li>
<li>Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+regulates+Period2+expression+and+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">p53 regulates Period2 expression and the circadian clock.</a> Nat Commun. 4, 2444(2013).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Koike, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+and+chromatin+landscape+of+the+core+circadian+clock+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals.</a> Science. 338 (6105), 349-354 (2012).</li>
<li>Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPping+away+at+the+Drosophila+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">ChIPping away at the Drosophila clock.</a> Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).</li>
<li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. , (2016).</li>
<li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+skeletal+muscle+satellite+cells+and+myofibers+for+use+in+chromatin+immunoprecipitation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays.</a> Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).</li>
<li>Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nuclei+and+preparation+of+nuclear+envelopes+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle.</a> Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).</li>
<li>Hahn, C. G., Covault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+transcriptionally+active+nuclei+from+striated+muscle+using+Percoll+density+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients.</a> Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).</li>
<li>Jeong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+attenuation+of+proteasomal+and+autophagic+BMAL1+degradation+in+Clock+Delta19%2F%2B+mice+contributes+to+improved+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis.</a> Scientific reports. 5, 12801(2015).</li>
<li>Nohara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia-lowering+activities+and+carbamoyl+phosphate+synthetase+1+%28Cps1%29+induction+mechanism+of+a+natural+flavonoid%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid.</a> Nutrition & metabolism. 12, 23(2015).</li>
<li>Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+integrates+the+transcriptional+response+of+the+hepatocyte+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting.</a> Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li>
<li>Kondratov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMAL1-dependent+circadian+oscillation+of+nuclear+CLOCK%3A+posttranslational+events+induced+by+dimerization+of+transcriptional+activators+of+the+mammalian+clock+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system.</a> Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).</li>
<li>Ripperger, J. A., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+CLOCK-BMAL1+binding+to+multiple+E-box+motifs+drives+circadian+Dbp+transcription+and+chromatin+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions.</a> Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).</li>
<li>Laplante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEPTOR+cell-autonomously+promotes+adipogenesis%2C+and+its+expression+is+associated+with+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity.</a> Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).</li>
<li>Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+regulator+PGC-1alpha+directly+controls+the+expression+of+the+hypothalamic+neuropeptide+oxytocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin.</a> J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

כאן אנו מתארים שיטה חזקה שבה צולבות רקמות שריר השלד שימשו לבודד גרעינים באיכות גבוהה. סינון רציף בוצע על מנת להפריד באופן יעיל גרעינים מן פסולת, ואנרגיה אקוסטית קולי מן מתכון בצורת צלחת גזז את הכרומטין לניתוח CHIP. התוצאות הראו מחייב זמן ספציפי היממה של BMAL1 למקדמים היזמים. שבב ניתן להשתמש כדי ללכוד תפוסה חלבון בזמן אמת על DNA גנומי כאשר cross-linking מתרחש. כדי לנצל את הפוטנציאל הזה, אנו נועדו לפתח שיטה כדי לאפ...

שריר השלד משחק תפקידים חשובים בפיזיולוגיה והתנהגות. סיבי השריר רב נוקלאציה מורכבת myofibrils שבו אקטין ו מיוסין טופס יחידות פונקציונליות קרא sarcomeres לייצר כוח התכווצות. שריר השלד הוא גם האיבר המטבולי הגדול ביותר בגוף, חשבונאות עבור 80% לאחר גלוקוז הכנסה הכנסה ותגובה התגובה אינסולין הומאוסטזיס מטבולית 1 , 2 . פיזיולוגיה של שרירים ומטבוליזם מוסדרים היטב על ידי השעון היממה, שעון ביולוגי פנימי 3 , 4 , 5 , 6 . לדוגמה, המחיקה הספציפית של שריר השלד של Bmal1 , אחד מרכיבי שעון היממה המרכזיים, הביאה להתנגדות לאינסולין ולצמצום ספיגת גלוקוז בשרירי השלד, והחיות נמצאו לפתח סוכרת מסוג 2. אניבנוסף, שריר השלד הוא גם יותר ויותר להיות מוערך כמו איבר אנדוקריני 8 , מפריש myocines כדי להסדיר מטבוליזם מערכתית ופיזיולוגיה. מחקרים מכניקים נדרשים כדי להבין את הפונקציות הרגולטוריות הללו בשרירי השלד. שבב הוא גישה רבת עוצמה כדי לגבש גיוס האמרגן של חלבונים דנה מחייב. שבב פותחה לראשונה כדי לזהות ארגון nucleosome על הכרומטין DNA 9 , 10 . מגוון של שיטות מאז דווחו לחצות חלבונים ו DNA הכרומטין באמצעות פורמלדהיד, דימתיל סולפט או אולטרה סגול הקרנה (UV) 11 , 12 . פורמלדהיד cross-linking הוא הנפוץ ביותר, שמירה על מבנה הכרומטין ו- DNA חלבונים אינטראקציות 9 , 13 , 14 . כרומט צולבב הוא מגורר על ידי sonication ו immunoprecipitated עם נוגדן נגד חלבון מסוים DNA מחייב עניין 15 , 16 . בשנים האחרונות פותחה שיטת השבב (CHIP-seq), שיטה המשלבת שבב עם NGS, לחקירת גורם שעתוק בגנום רחב 17 , ובמקרים מסוימים גם לעקוב אחר שינויים דינמיים במהלך קורס 18 , 19 , 20 . לדוגמה, מחקרים שבב-שבב seq חשפו רצף מתוזמר מאוד של מחייב גנומי של רכיבי שעון היממה ואת סמנים היסטון, אשר מניע ביטוי גנטי מדויק timporally לאורך ~ 24 שעות מחזור היממה 18 . פרוטוקולי השבבים הזמינים ביותר מיועדים לרקמות רכות ( למשל , כבד, מוח וכו &#39; ), ומעט מאוד פורסמו עבור רקמות קשות כולל סקלהשריר. זה מאתגר מבחינה טכנית כדי homogenize סיבים שריר השלד עשיר לבודד גרעינים באיכות גבוהה 21 , במיוחד עבור ניסויים שבב הדורשים cross- המקשר. במחקר שבץ שריר שנערך לאחרונה, 22 הופרדו תאי לוויין מהמיוביבים, וגרעינים הוכנו משני סוגי התאים באמצעות הליך ממושך של עיכול רקמות. התהליך כולו לקח כשלוש שעות כדי להשלים לפני פורמלדהיד cross-linking בוצע על גרעינים מבודדים. בעוד פרוצדורה זו נמנעת בין סיבי השריר המקושרים, מה שהופך את רקמת השריר אפילו יותר עקשן להומוגניזציה יעילה, והיה מסוגל לייצר גרעינים באיכות גבוהה, פיגור הזמן המשמעותי מאוסף רקמות לגרעינים מקושרים את הסיכון ל- DNA שונה אינטראקציה בין פרוטאינים. לעומת זאת, רוב המחקרים ביצעו קישור צולב מיד לאחר טיפול ניסיוני או אוסף רקמות על מנת לשמר את ה- DNA בזמן אמת חלבוניםכריכה 12 . חיסרון שני של בידוד גרעיני לפני cross-linking היא כי זה מונע זמן רגיש יישומים כגון אוסף מדגם היממה אשר בדרך כלל מתרחשת במרווחים 3 - 4 שעות. בלי לחצות את הגרעינים, הבידוד צריך להתקדם מיד לאחר לנתיחה, ואילו דגימות צולבות ניתן לעבד יחד לאחר כל הקורס הזמן הושלמה, ובכך להבטיח עקביות ניסויית יותר. פרוטוקולים אחרים לבידוד גרעינים מ שריר השלד unrosslinked דווחו גם. שני מחקרים תיארו את השימוש ultracentrifugation הדרגתי לגרעינים נפרדים מן הנותרים myofibrils ופסולת 23 , 24 . בעוד סוכרת או collucal colloundal gradientugugation הדרגתי יעיל עם רקמות שריר uncrosslinked, הניסויים שלנו גילה כי לאחר crosslinking, ultracentrifugation הדרגתי נכשל להפריד בין גרעיני תא DEbris על שיפוע. לכן פיתחנו נוהל לבידוד גרעינים באיכות גבוהה תוך שימוש ברקמות שריר השלד. במקום ultcentrifugugation הדרגתי, אנו המציא שיטת סינון סדרתי ביעילות נפרד גרעינים מן פסולת. בעקבות ultrasonication, דגימות הכרומטין יושמו בהצלחה למחקרים שבב אשר הראו דפוס היממה של חלבון BMAL1 מחייב למקד מקדמי. השיטה שלנו יכולה להיות חלים באופן נרחב על מחקרים מכניסטיים שונים של רקמות השריר.

<table><tbody><tr><td><תמיסת חזק>חומרים</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F8775&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפן כחולה (0.4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאז K</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> עוף 3115887001 <td></td></tr><tr><td>נוגדן</td><td></td><td></td> <td>נגד BMAL1נוצר בעוף (Cocalico Biologicals) כנגד אנטיגן aa 318 - 579, ו-IgY טוהר בזיקה באמצעות אותו אנטיגן.&nbsp;</td></tr><tr><td>עוף IgY משקע שרף</td><td>GenScript</td><td>L00405</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KINEMATICA&nbsp; פוליטרון PT2100 הומוגנייזר ספסל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-451-178</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל מטחנת רקמות Dounce</td><td>Whearton</td><td>357544</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאי פלקון 100 ומיקרו; מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאי פלקון 70 ומיקרו; מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאי פלקון 40 ומיקרו; מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>פלורימסננת 30 ומיקרו; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 20 ומיקרו; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriמסננת 10 ומיקרו; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50010-03</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S2 Covaris ממוקד-אולטראסוניקטור</td><td></td><td>דגם S2</td><td></td></tr><tr><td>Labquake&nbsp;</td><td></td> מצלמת מיקרוסקופ CCD C415110 <td></td><td>תרמו סיינטיפיקל</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>DFC3000 G</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA ערכת מיצוי DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כל רכיבי המאגר מתוארים בפרוטוקול. כל רכיב נרכש מסיגמא אולדריץ'</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור immunoprecipitation הכרומטין

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (שבב) היא שיטה רבת עוצמה כדי לקבוע מחייב חלבון ל- DNA הכרומטין. שריר השלד עשיר, עם זאת, כבר אתגר עבור שבב עקב קושי טכני בבידוד של גרעינים באיכות גבוהה עם זיהום מינימלי של myofibrils. פרוטוקולים קודמים ניסו לטהר גרעינים לפני הצלב המקשר, אשר נוטל את הסיכון של אינטראקציה DNA- חלבון השתנה במהלך תהליך הכנת גרעינים ממושכים. בפרוטוקול הנוכחי, אנחנו הראשונים לחצות את רקמת שריר השלד שנאספו עכברים, ואת הרקמות היו minced ו sonicated. מאז מצאנו כי ultracentrifugation לא היה מסוגל להפריד בין גרעינים מ myofibrils באמצעות צולבות צלב רקמות, אנו המציא הליך סינון רציף כדי להשיג גרעינים באיכות גבוהה ללא נטילת myofibril משמעותי. לאחר מכן הכינו הכרומטין באמצעות ultrasonicator, מבחני שבב עם נוגדן אנטי BMAL1 חשף מחייב היממה חזקדפוס של BMAL1 למקדמי הגן. פרוטוקול סינון זה מהווה שיטה הניתנת להחלה בקלות על מנת לבודד גרעינים באיכות גבוהה מרקמת שריר השלד הצולבת, ומאפשר עיבוד דגימה עקבי ללימודים היומיים והרגישים לזמן. בשילוב עם הדור הבא רצף (NGS), השיטה שלנו ניתן לפרוס למחקרים מכניסטיים גנומי שונים התמקדות תפקוד שרירי השלד.

<html> כאן ביצענו פורמלדהיד cross-linking מיד לאחר איסוף רקמה כדי לשמר בזמן אמת אינטראקציה DNA חלבון. עם זאת, מצאנו כי שיפוע סוכרוז או colloidal, נפוץ לבידוד גרעיני 23 , 24 , לא היה יעיל בהפרדת גרעינים מ myofibrils (נתונים לא מוצג). הסיבה עשויה להיות כי cross-linking העניק הכבידה דומה עבור גרעינים ו myofibrils. לכן, פיתחנו תהליך סינון סדרתי כדי להסיר ביעילות myofibrils גדול ופסולת אחרת חלק ה...

אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סינון לבודד גרעינים באיכות גבוהה מן הצלב המקושרים שריר השלד העכבר שבו הסרנו את הצורך ultracentrifugation, מה שהופך אותו ישים בקלות. אנו מראים כי הכרומטין מוכן מן הגרעינים מתאים immunoprecipitation הכרומטין וסביר הכרומטין immunoprecipitation רצף מחקרים.

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

המטרה הכללית של פרוצדורה ניסויית זו היא לאפשר הכנה של גרעינים באיכות גבוהה משריר שלד מקושר (cross-linked), אשר ניתן להשתמש בהם לאחר מכן למחקרי שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי השריר והשעון הביולוגי, כגון מחקרים גנומיים המשתמשים ברקמות ותאי שריר בהקשר של השעון הביולוגי או הקשרים רגישים אחרים לזמן. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת קישור מיידי של דגימות, והפרוצדורה המבוססת על סינון יכולה להתבצע באופן מהימן כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה עם זיהום מינימלי של סיבי שריר (myofibrils).למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי שריר שלד, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות כגון שרירי לב ושרירים חלקים. שקלו וקצצו שריר שלד מהגפיים האחוריות שבודד מעכברים זכרים מסוג C57 black six בני כ-20 שבועות, בתוך תמיסת פוספט מאוזנת (PBS) קרה בקרח, כפי שתיאור בעבר. העבירו את רקמת שריר השלד הקצוצה לשפופרת קונית של 50 milliliters המכילה 10 milliliters של PBS על קרח.לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסירו בזהירות את עליית ה-PBS באמצעות שאיבה. העריכו את נפח המשקע בכל מבחנה של 50 מיליליטר באמצעות מבחנות ייחוס המכילות אחת, שתיים, שלוש וארבעה מיליליטר של מים.הוסיפו שבעה נפחים של 1% formaldehyde ו-PBS קרים מאוד (בקרח) והומוגניזו את הדגימות על קרח באמצעות הומוגנייזר רקמות עם פרובה (probe tissue homogenizer). לאחר מכן, בצעו קשירה צולבת (cross-link) לדגימה על ידי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. עצרו את תגובת הקשירה הצולבת על ידי הוספת glycine בריכוז של one molar עד לריכוז סופי של 0.125 molar, ולאחר מכן דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר סבב צנטריפוגה של הדגימה ב-3,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות שאיבה. שטפו את המשקע על ידי ריסוספנזיה ב-10 milliliters של בופר בסיס קר מאוד המכיל מעכבי פרוטאזה שהוספו באופן טרי. סובבו את הדגימה פעם נוספת בצנטריפוגה והסירו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות שאיבה.לאחר מכן, השעו את המשקע בשישה מיליליטר של lysis buffer המכיל מעכבי פרוטאז שהתווספו הअभी. העבירו את הדגימה ל-Dounce homogenizer בנפח 15 מיליליטר שקולל מראש, והדגירו למשך 10 דקות על קרח. בצעו הומוגניזציה באמצעות Dounce לכל דגימה על קרח, באמצעות 15 תנועות איטיות עם פסטל רפוי, ולאחריהן 15 תנועות עם פסטל הדוק לשחרור הגרעינים.שלבי הסינון הבאים הם המפתח לבידוד גרעינים באיכות גבוהה. סננו את ההומוגנאט דרך מסננת תאים ושטפו עם ארבעה מיליליטר של תמיסת ליזיס. לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-1,000 times g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.שחזר את המשקע בחמישה מיליליטר של בופר בסיס (base buffer) קר בקרח, ובצע דאנס (Dounce) 10 פעמים באמצעות פסטל הדוק כדי לשחרר את הגרעינים. לאחר מכן, סנן את התוך-סביבה דרך מסנן תאים, שטוף את המבחנה עם שני מיליליטר של בופר בסיס וסנן שוב. חזור על הסינון עם מסנני תאים בעלי גודל נקבים קטן יותר באופן הדרגתי.לבסוף, סובבו בצנטריפוגה ב-1,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ושסעו מחדש את המשקע ב-500 µL של בופר בסיס לפני סבב צנטריפוגה נוסף. השליכו את הנוזל העליון ואחסנו את המשקע במינוס 80 מעלות צלזיוס.הפשיתו את הדגימות ב-500 microliters של SDS lysis buffer והחזירו למצב תהמי (resuspend) באמצעות פיפטינג עדין. העבירו את ת сусפנסיית ה-DNA הגרעינית למבחנה מזכוכית על קרח. בחירת פלטפורמת הסוניקציה והתנאים המתאימים היא קריטית להכנת כרומטין מגרעינים מבודדים.בצע את הסוניקציה באמצעות פולסים מרוכזים של אנרגיה אקוסטית אולטרסונית ממיתר בצורת דיסק, בהתאם להגדרות המפורטות בפרוטוקול הכתוב. העבר את הכרומטין שעבר סוניקציה לשפופרת של 1.5 milliliters. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה ב-12,000 $\times g$ למשך 15 דקות והעבר את העילאי לנפח שפופרת חדשה.לאחר מכן, העבירו 50 µL מהדגימה שעברה סוניקציה למבחנה חדשה בנפח 1.5 mL לצורך ביטול קשירה (reverse cross-linking) במהלך הלילה בטמפרטורה של 65 °C. איסוף דגימות ה-DNA מתואר בסעיף הבא. לאחר הערכת הסוניקציה והכמות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, חלקו את הכרומטין שהופשר לאליקוטיים של כ-100 עד 120 µg למבחנה.לאחר מכן, דללו את הכרומטין ביחס של 1:10 עם באפר immunoprecipitation. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של סלרי (slurry) בריכוז 50% של BSA pre-blocked protein HE agarose או של חרוזי IgY, והדגירו ברוטטור למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר סבב צנטריפוגה של הדגימה ב-1,000 ×g למשך 10 דקות, העבירו בזהירות את העילוי למבחנות חדשות.לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים בריכוז של 1 µg נוגדן לכל 25 עד 100 µg של DNA של כרומטין. סובבו בעדינות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C ובמהירות של כ-15 rpm. לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של חרוזי agarose מסוג HE Protein שחסומו מראש ב-BSA או חרוזי IgY וערבבו.סובב את תגלי השמיגות בחדר הקירור למשך שעתיים. לאחר מכן, שטוף את השמיגות בעזרת RIPA buffer, ולאחר מכן ב-high salt buffer, lithium chloride buffer ו-Tris EDTA כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר השטיפה, בצע אלוציה של ה-DNA מהשמיגות על ידי צנטריפוגציה ראשונית ב-1,000 ×g למשך דקה אחת והסרה זהירה של העל-נוזל (supernatant).שחזר את החרוזים ב-50 µL של תמיסת אלואציה. לאחר מכן, דגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 65 °C. לאחר הדגירה, סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 12,000 ×g למשך חמש דקות.הסיר את הנוזל העליון והוסף 50 µL נוספים של באפר אלוקציה (elution buffer) לפני צנטריפוגה חוזרת ב-12,000 ×g למשך חמש דקות. נפח האלוקציה הסופי יהיה 100 µL. כדי לבצע ביטול של הקשרים הצולבים (reverse cross-link) ואלוקציה של ה-DNA, דגרי תחילה את הכרומטין שאלוקציה בו בלילה במערך של 65 °C.לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של RNase A לפני דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, דגרו עם שמונה מיקרוליטרים של protease K בריכוז 10 mg/mL למשך 30 דקות בטמפרטורה של 55 °C. נקו את ה-DNA באמצעות ערכת PCR cleanup עם נפח אלucian של 50 µL, בהתאם לפרוטוקול היצרן.לבסוף, יש לנתח את הפרופילים באמצעות real-time QPCR כפי שתואר בעבר. סינון רצפי הסיר ביעילות שאריות רקמה. תמונות מייצגות של דגימות לאחר הסינון הראשוני ולאחר סינון סדרתי מוצגות כאן לצורך השוואה.פירוק הדרגתי של הכרומטין באמצעות 10 מחזורי סוניקציה נחשף באמצעות הרצת ג'ל אגרוז. 10 מחזורי סוניקציה של הכרומטין שעבר עיכול הניבו DNA באורך של כ-500 זוגות בסיסים. כאן מוצגות תוצאות QPCR מייצגות עבור B זכרים one chIP עם דגימות של שריר שלד של עכבר שנאספו ב-ZT6 וב-ZT18.ניתוח של מרכיבי מיקומי ה-Dbp בגן ה-Dbp העלה כי, בדומה לתוצאות קודמות, שיאי קישור מופיעים בסביבות ZT6. ברגע שהתהליך נשלט, ניתן לבצע הפרה של גרעינים בתוך חמש עד שש שעות, אם הדבר נעשה בצורה נכונה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בשיטות מבוססות סינון כדי לטהר גרעינים איכותיים ו-DNA של כרומטין מרקמת שריר שנקשרה (cross-linked).בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור את הדגימות על קרח או בחדר קירור, ולשמור מנות (aliquots) מהדגימה לבדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי שלבי הסינון. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי השריר והגנומיקה לחקור דינמיקה צירקדית או תלוית-זמן של אינטראקציה בין כרומטין לחלבונים ברקמות שריר שונות. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון ChIP-sequencing כדי לענות על שאלות נוספות, למשל בחינת דפוסים של קישור גורמי שעתוק ברקמות שריר.

a-filtration-based-method-preparing-high-quality-nuclei-from-cross

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

התקדמות בספקטרומטריית מסות אפשרה ניתוח התפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ושינוי בשורה של רקמות. בשילוב עם חלוקת subcellular ומודלי מחלות, מסה כמותית ספקטרומטריית וביואינפורמטיקה יכולות לחשוף נכסים חדשים במערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת כאן מנתחת חלבוני הכרומטין הקשורים בהגדרה של מחלות לב, והוא בקלות ישימה...

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

פרוטוקול זה מתאר הליך להפקת וטיהור מסוג בר וגרסאות מוטציה של מתחם שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי. Epitope מתויג גרסאות של יחידות משנה INO80 באות לידי ביטוי ביציבות בתאי HEK293, ומתחמים שלמים ומתחמים חסרי מערכות ספציפיות של יחידות משנה הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה immunoaffinity.

דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.

הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים

הביולוגיה של רקמת השומן הבין-שרירית (IMAT) לא נחקרה במידה רבה בשל הנגישות המוגבלת של רקמת האדם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד גרעינים והכנת ספרייה של IMAT אנושי קפוא לריצוף RNA של גרעינים בודדים כדי לזהות את ההרכב התאי של מחסן שומן ייחודי זה.

בידוד גרעינים מרקמת שומן בין-שרירית אנושית וריצוף RNA חד-גרעיני במורד הזרם

למדו שיטת סינון לבידוד גרעינים באיכות גבוהה משריר שלד צולב בעכברים לצורך ChIP. הפרוטוקול מבטל צנטריפוגה אולטרה ומפחית זיהום מיופיברילים לחקר גנומיקה ומחזוריות.

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

גלה סרטונים נוספים