Name: Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: חקור הקמת מודל זנוגרפט בעכברים ללימפומת תאי המעטפת באמצעות תאים ממקור חולה. שיטה זו מאפשרת לבחון תרופות על תאי לימפומה אנושיים בתוך גוף חי ולפתח אסטרטגיות טיפול מותאמות אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי le חדר מרווח וחדיש ליגה Genevoise סרטן, ד ר Fondation דובואה Ferriere דינו-ליפאטי, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008, 2914-02-2012, שוויצרי מענק קרן המדע הלאומית 31003A_156760 ו 310030-153456.

דגימות דם אנושי שימשו על פי הנהלים אושרה על ידי האתיקה המקומית ניסויים ועדות של בית החולים של אוניברסיטת ז'נבה.
ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המוסדיים אתית הוועדה של חיה טיפול ב ז'נבה ומשרד וטרינרי הקנטונים (מספר אישור: ג ' נרל אלקטריק/26/15).
1. הכנת תאי תאי דם היקפיים הראשי (PBMCs) על-ידי הפרדת צבע צפיפות
הערה: 3-5 מ של דם היקפיים הושג מחולים עם MCL הצגת בשלב לוקמיה. האבחנה הייתה נקבע על פי קריטריונים אבחון סטנדרטי עבור cytometry זרימה (CD5 +, CD23−, CD200 +, האוכלוסייה monoclonal B cell), לאחר מכן אושר על ידי נוכחות של t(11;14) טרנסלוקציה כרומוזומלית, ביטוי של cyclin D1. בכל המקרים, היוו monoclonal תאי B כדי > 90% מן האוכלוסייה הכוללת B cell. התאים הנותרים היו בעיקר ומונוציטים ו כמה תאים T.
<ol><li>לדלל (1:1) 5 מ של דגימת דם MCL עם 5 מ של רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני 1640 (RPMI) (איור 1 א').</li>
	<li>היפוך התקשורת הדרגתיות צפיפות (טבלה של חומרים) מספר פעמים לפני השימוש כדי להבטיח ערבוב יסודי.</li>
	<li>הוסף 5 מ של מדיה הדרגתיות צפיפות לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל באמצעות של העצמות פיפטה.</li>
	<li>שכבת בעדינות את דגימת הדם מדולל על התקשורת הדרגתיות צפיפות בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל באמצעות של העצמות (הדם צפיפות מדיה הדרגתיות יחס צריך להיות 2:1, למשל, 10 מ של דם עד 5 מ"ל של צפיפות הדרגתיות מדיה). צריך לקחת כדי לא לערבב שתי השכבות (איור 1B, ג).</li>
	<li>Centrifuge הדגימה ב 400 g x 40 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלמים צנטריפוגה כבוי.</li>
	<li>בעדינות בעזרת פיפטה סטרילי של פסטר, תשאף השכבה האמצעית (לבנבן, דק טבעת המסומן בחץ (איור 1D, E)) המכילות את התאים תאי ולהעביר אותם לתוך צינור נקי.</li>
	<li>כביסה של תאי תאי<ol>
<li>להעריך את עוצמת הקול של התליה תא שהועברו ולהוסיף אליו שלושה כרכים של עקר 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עם 1% אלבומין שור (BSA).</li>
		<li>מערבבים את המתלים על-ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.</li>
		<li>Centrifuge את המתלים ב 400-500 g x למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע להשיג בגדר תא, חזור על השלב לשטוף שוב.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע, resuspend תאי האחסון הרצוי, למשל, 1 או 2 מ"ל ל- PBS.</li>
		<li>לספור את מספר התאים מונה הניתן תא אוטומטית או ידנית באמצעות של hemocytometer (נויבאואר קאמרית).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. העשרה של תאים B לפי בחירה שלילי תא B
<ol><li>לדלל את התאים ב- PBS כדי ריכוז סופי של 50 x 106 תאים/מ ל....</li>
	<li>העבר את התאים מ ל סביב צינור פוליסטירן התחתון. להוסיף 100 µL של נוגדן קוקטייל מתוך ערכת העשרה תא B 2 מ של השעיה תא ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה (איור 2-1).</li>
	<li>דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
	<li>בקצרה מערבולת החלקיקים המגנטיים המסופק בערכה תא B העשרה עבור 30 s (איור 2-2). להוסיף 150 µL של החלקיקים המגנטיים 2 מ"ל של המדגם.</li>
	<li>דגירה המדגם על עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להביא את אמצעי האחסון מדגם 2.5 מ עם PBS x 1 המכיל 2% עגל עוברית סרום (FCS) וחומצה ethylenediaminetetraacetic 1 מ מ (EDTA). הכנס את הצינור המגנט, דגירה הצינור עוד 3-5 דקות (איור 2-3).</li>
	<li>לאסוף את המגנט עם הצינור במקום, בתנועה רציפה אחת, decant את הצינור כך התליה תא מועשר נאסף בשפופרת טריים (איור 2-4). לספור את התאים על ידי מונה הניתן תא אוטומטית או ידנית באמצעות hemocytometer כדי לקבל את התשואה הכוללת תאי B. הערה: בדרך כלל, התשואה היא ~ 105 B תאים למ"ל נורמלי בתאי B ו 5-50 x 106 תאים/mL עבור MCL.</li>
	<li>המאשרת את טוהר העשרת תא B<ol>
<li>קח ~ 50,000 תאים דגירה התאים עם נוגדנים anti-CD19/CD20 (1:20 דילול) ובנוסף נוגדן anti-CD45 כדי fluorochromes שונים (1:10 דילול) בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.</li>
		<li>לשטוף עם 1 מ"ל של 1 x PBS + 1% BSA, centrifuge את התאים ב- 400-500 g x עבור 5 דקות, resuspend תאי µL ~ 200 ל- PBS.</li>
		<li>לרכוש את דגימות תאים על ידי cytometry זרימה ולנתח טוהר של תאי B. טוהר הוא ברובו > 90% בשיטה זו (איור 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. פיתוח של המודל העכבר Xenograft
<ol><li>להשעות ~ 40-60 x 106 תאים ב- 150-200 µL ל- 1 x PBS (נפח תידרש להזריק לכל העכבר).</li>
	<li>להזריק 150 µL של התליה תא לווריד (עירוי) לתוך כל וריד הזנב של שבוע 6-7 scid הנד immunodeficient גמא (NSG) עכברים בלי קשר למין (איור 4A).</li>
	<li>לאפשר העכברים לפתח לימפומה האנושית ~ 10 שבועות. הערה: תאים לימפומה אנושית ראשונית יקח עוד הרבה זמן לפתח גידול לעומת שורות תאים לימפומה אנושי (~ 3 שבועות).</li>
	<li>כאשר בעלי החיים מתחילים להראות סימפטומים של מחלות קטלניות כמו ירידה במשקל, שערה הסתור, ירידה בפעילות, שיתוק גפיים הינד, וכדומה, להקריב העכברים בעזרת2 CO ואחריו לב לב לנקב להשיג דם.</li>
	<li>לאסוף איברים שונים כמו מח העצם, הטחול, הכבד על ידי לנתח את העכברים, לאסוף דם היקפיים על ידי ציור דם מהלב בזמנו של הקרבה לניתוח engraftment הגידול (איור 4B -F).</li>
</ol>4. chimerism ניתוח של תאים סרטניים Engrafted באיברים שונים
<ol><li>לאחר איסוף איברים שונים, לעבד אותם על ידי הפרעה מכנית ליצירת תא בודד המתלים בעקבות פירוק תאי הדם האדומים (RBC) באמצעות µL 200 1 x אמוניום כלוריד האשלגן מאגר דם, מח עצם, µL 500 על הטחול, 2 מ עבור כבד .</li>
	<li>לספור, מכתים את התאים באמצעות נוגדנים ספציפיים תא B האנושי, קרי, אנטי-CD19, אנטי-CD20 אנטי-CD45. הערה: עכברים NSG חוסר בתאי B, ומכאן לניתוח, תאים מוכתמים עם סמנים תא B אנושי ספציפי.</li>
	<li>לנתח את התאים נגזר אורגן על ידי cytometry זרימה על ידי gating בתאי B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).</li>
	<li>לכמת את תאי הגידול engrafted באיברים שונים שמקורם עכברים MCL מוזרק המבוסס על תאים מגודרת כפי שמצוין בשלב 4.3 (איור 4G). הערה: ראה טבלה של חומרים לפרטים.</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th edition, (2001).</li>
<li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li>
<li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li>
<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
<li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma%3A+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li>
<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

ניסויים קליניים אפשריות לתרופות הניתנות בשלב מתקדם של פיתוח אך אינם יכולים לשמש עבור גילוי תרופות. זמן כנראה תפס המאמצים לפתח נמענים בעלי חיים עבור התא האנושי השתלת איברים מבעלי חיים כדי לבדוק תרופות בשלב מוקדם. כאן אנו מציגים במודל חיה מונע דחיית שתל האנושית, יכול להקים מודל עבור מחלות אנושיות, כגון MCL. . זה כרגע דגם xenograft משוכללת כדי לחקור את המנגנונים של גידול אנושי engraftment, הגידול. כאן נשתמש NSG עכברים, אחד המודלים העכבר לקוי ביותר החיסון עד היום על מנת להשיג הצלחה גדולה יותר של לימפומה engraftment. NSG עכבר...

לימפוציטים על ידי הטבע לשחק תפקיד מרכזי מעקב המערכת החיסונית, לימפוציט סחר היא שלב קריטי הרכבה אנטיגן ספציפי חסינות1,2. תהליך זה כולל העברה של לימפוציטים נאיביים T של בלוטת התימוס כדי להזרים את הדם, ומשם לאיברים הלימפה המשני, כולל בלוטות הלימפה, התיקונים של פייה או הטחול, הם נפגשים אנטיגנים cognate. לימפוציטים B להבדיל במח העצם, נודדים כתאי תמים אל זקיקים של איברי הלימפה משני3. חלק תאים B אלה לאגד אנטיגן עם קולטן שלהם, מופעלים על ידי תאי T ספציפי. התפשטות ובידול של תאים אלה B דוחף את התאים תמים B שאינו מופעל ע י לאזור מנטל של הזקיק. תאים מופעל יכול להבדיל ואז לזיכרון B תאים, אשר מסיירים הגוף, או לידי בנוגדנים הפרשת תאי פלזמה להגר מח העצם4.
MCL מתרחשת כאשר לימפוציטים נאיביים B באזור מנטל להפוך גידול. אלו תאים לימפומה לשכון microenvironment של איברים הלימפה, להתרבות ללא תלות שליטה לימפוציט T ספציפי. עם זאת, בשלב מסוים של צפיפות לברוח מן הנישה הזאת והם recirculate במחזור הדם לחפש נישות באיברים אחרים. בהתחשב במורכבות של מולקולות אדהזיה והפקרות של נוגדנים, קולטנים שלהם, המנגנון של הסלולר סחר זה ויוו ממעטים להבין, לכן הסלים טיפול. שיטות רומן נחוצים כדי לחסום ביעילות תהליך הגירה זה כדי למנוע את התאים לימפומה B מלהגיע microenvironments חדש.
MCL הוא אחד הקשים ביותר לטיפול תא B ממאירות. הפיתוח של הפנוטיפ אמצעים של MCL היא התוצאה של מפל רב-שלבי, המאופיינת על ידי רכישת מאפיינים ביולוגיים ייחודיים. בזמן האבחנה, רוב המטופלים (70%) שכבר קיים עם מחלה המופץ, עם רוב המקרים מפגין extranodal מעורבות הטחול, מוח עצם, ו/או מערכת העיכול5,6. בחולים שטופלו, נסיגה על ידי גידולים עמידים בתוך כמה שנים הוא נפוץ, למרות כימותרפיה קונבנציונלית מעניקה שיעורי הפוגה גבוהה לטווח קצר7,8. כאן אנו מציגים מודל המחלה חדש יכול לעזור להבין MCL הפצתו וביולוגיה הבסיסית שלה: הקמנו האנושי MCL xenograft העכבר מודל שמקורם בתאי הגידול העיקרי של חולים. אנו מקווים כי מודל זה יעזור לפתח אסטרטגיות טיפוליות נגד הפצת MCL, לספק במרכיבי קליניים אופטימלית אבחון וטיפול בחולים הישנות.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-paque media</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>להפרדת תאים חד-גרעיניים</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco-Life טכנולוגיות</td><td>61870-010</td><td>לדילול דגימת דם</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>שטיפת תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>להכנת PBS עם 1% BSA המשמש בשטיפת תאים במהלך בידוד</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>בקמן קולטר</td><td>B49212</td><td>סמן תאי פאן-B אנושי</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>בקמן קולטר</td><td>A21693</td><td>סמן תאי פאן-B אנושי</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>בקמן קולטר</td><td>IM3607</td><td>סמן תאי פאן-B אנושי</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>בקמן קולטר</td><td>PN A70203</td><td>סמן</td></tr> <tr>תאי T אנושי<td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>חלבון פני התא נעדר בדרך כלל ב-MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>סמן פאן-לויקוציטים</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>חלבון פני התא נעדר בדרך כלל בעכברי MCL</td></tr><tr><td>NOD scid gamma (NSG)</td><td>מעבדות צ'ארלס ריבר</td><td>5557</td><td>שימשו לפיתוח קסנוגרפטים MCL במחקר זה</td></tr><tr><td>ערכת העשרת תאי B אנושיים קלה</td> להעשרת טכנולוגיות <td>תאי גזע</td><td>19054</td><td>המשמשות להעשרת תאי B להשגת תאים טהורים להזרקה לעכברים</td></tr><tr><td>FACS</td><td>בקמן קולטר</td><td>נאוויוס</td><td>משמש לאפיון דגימת MCL ולחקר האיברים להשתלת MCL</td></tr><tr><td>1X אמוניום כלוריד מאגר אשלגן מאגר</td><td></td><td></td><td>ליזה בדם אדום (NH4Cl 8,024 מ"ג לליטר; KHCO3 1,001 מ"ג/ליטר; אדטה. Na2&middot; 2H2O 3.722 מ"ג/ליטר )</td></tr></tbody></table>

engraftment גידול במודל של עכברים xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B לימפוציטים הם שחקני המפתח מחזור תא החיסון והם בעיקר ביתם, שוכנים באזור איברי הלימפה. בעוד תאי B נורמלי להתרבות רק כשאתה מגורה על ידי לימפוציטים מסוג T, תאי B oncogenic לשרוד ו להרחיב באופן עצמאי בתוך נישות איברים לא מוגדר. לימפומה cell מנטל (MCL) הוא אחד כזה הפרעת תא B, שבו שיעור חציון ההישרדות של חולים היא 4-5 שנים. זה דורש את הצורך של מנגנונים יעילים באמצעותו יונת ואת engraftment של תאים אלה נחסמות על מנת להגביר את הישרדות, תוחלת החיים של המטופלים. לכן, המאמץ לפתח מודל העכבר xenograft לחקור את היעילות של הרפוי MCL על ידי חסימת ה ביות מנגנון ויוו הוא בעל חשיבות עליונה. התפתחות בעלי חיים הנמענים התא האנושי השתלת איברים מבעלי חיים לבדוק תרופות בשלב מוקדם של זמן כנראה תפס, כמו דגמים הרלוונטיים העכבר פרה יש חשיבות מכרעת מסך סוכני טיפולית חדשה. מודל זה בעל חיים מפותחת כדי למנוע דחיית שתל האנושי ולהקים מודל עבור מחלות אנושיות, והוא עשוי להיות כלי שימושי ביותר ללמוד את התקדמות המחלה סוגי לימפומה שונים, לבצע בדיקה פרה של תרופות עבור ממאירויות המטולוגיות, כמו MCL. הקמנו דגם העכבר xenograft אשר ישמש משאב מצוין ללמוד ולפתח את רומן גישות טיפוליות עבור MCL.

כתב היד מתאר פרוטוקול אופטימליים להתפתחות מוצלחת של העכבר xenograft מודל engraftment של תאים MCL. הכנה של אוכלוסיה תא טהור (בתאים הזה במקרה MCL), חיוני מאוד לפתח xenografts MCL מוצלחת. איור 1 מייצג את השלבים מפוח תא תאי בידוד מן הדם של החולה MCL על ידי הפרדת צבע צפיפות. תאי תאי מעובדים נוספים כדי להשיג טהור B תאים באמצעות ערכת העשרה תא B שלילי כדי להשיג אוכלוסיה תא טהור להזרקה xenograft לתוך עכברים. צריך לקחת כדי להשיג טוהר מקסימלית על מנת שיהיה מוצלח MCL eng...

לימפומה cell מנטל (MCL) היא קשה לטפל הפרעת תא B ולכן לא פחות קשה להקים מודל העכבר xenograft של ראשי MCL ללמוד ולפתח את הרפוי. כאן, אנו מתארים את הקמת MCL xenografts בעכברים כדי לעזור להבין את הביולוגיה כבסיס מוצלחת.

Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לבסס מודל עכבר קסנוגרפט עבור לימפומה של תאי מעטפת (mantle cell lymphoma), כדי לפתח אסטרטגיות טיפול למחלה זו. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום ההמטו-אונקולוגיה, כגון התוצאה הטיפולית של אסטרטגיות טיפול שונות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לחקור את השפעתם של תרופות על תאי לימפומה אנושיים in vivo.להשלכות של טכניקה זו יש השלכות על הטיפול בלימפומה של תאי המעטפת (mantle cell lymphoma), מכיוון שבאמצעות מודל זה, ניתן ללמוד לא רק באופן ישים אלא גם נוח את השפעת הטיפול על תאים המופקים מחולה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי היבטים טיפוליים של לימפומה של תאי המעטפת, ניתן להחיל אותה גם כדי לחקור סוגים שונים של לימפומות. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה ייתקלו בקשיים, שכן קשה להשיג קסנוגרפטים המופקים מחולים (patient derived xenografts).כאשר עלה לנו לראשונה הרעיון לשיטה זו, רצינו לחקור את נדירת תאי B in vivo ואת ההשפעות של מספר טיפולים על תהליך זה. יש לדלל 12 מיליליטר של דגימת דם מחולה עם לימפומה של תאי מעטפת (mantle cell lymphoma) בנפחים שווים של מצע RPMI 1640. לאחר מכן, יש להפוך את מצע מדרג הצפיפות מספר פעמים לפני השימוש.שאבו 15 milliliters של מדיום למדרג צפיפות לתוך מבחנה לצנטריפוגה של 50 milliliter. בעזרת שואב, הוסיפו בזהירות וברוגע את דגימת הדם המדוללת מעל המדיום למדרג צפיפות, מבלי לערבב את שתי השכבות. לאחר מכן, בטלו את פעולת הבלמים וסובבו את דגימת הדם בצנטריפוגה ב-400g למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.השתמשו בפיפט פסטור סטרילי כדי לשאוב את התאים המונוקליאריים מהשכבה האמצעית והעבירו אותם למבחנה נקייה. כדי לשטוף את התאים המונוקליאריים, הוסיפו שלושה נפחים של Phosphate Buffered Saline סטרילי בריכוז רגיל עם 1% fetal bovine serum לנפח המשוער של תגלי התאים. העבירו את תגלי התאים בפיפט מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב נאות.לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-400-500g למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבב, השליכו את העל-מסטיקה (supernatant) ושטפו את משקע התאים ב-Phosphate Buffered Saline בריכוז סטנדרטי, עם 1% bovine serum albumin. סבבו את הדגימה בצנטריפוגה.לאחר מכן, השליכו את העליון (supernatant) ותלהו מחדש את התאים ב-1 או 2 milliliters של Phosphate Buffered Saline. לאחר מכן, ספרו את מספר התאים באמצעות סופר תאים אוטומטי. דללו את התאים ב-Phosphate Buffered Saline, לאחר מכן העבירו את התאים באמצעות פיפט למבחנה פוליסטרינית של 5 milliliters והוסיפו 100 microlitres של תערובת נוגדנים לתסחיף התאים.שאי והזרק את תרחיף התאים בעזרת פיפטה בעדינות מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב נכון. לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורת החדר בתוך מCב laminar hood למשך 10 דקות. במקביל, ערבבו במכשיר vortex את החלקיקים המגנטיים מתוך ערכת העשרת תאי B למשך 30 שניות.לאחר מכן, הוסף 150 µL של החלקיקים המגנטיים לשני מיליליטר של תרחיף תאים. דגור את תערובת התאים והחלקיקים המגנטיים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. התאם את נפח הדגימה ל-2.5 מיליליטר, ולאחר מכן, הנח את המבחנה במגנט ודגור למשך שלוש עד חמש דקות נוספות.לאחר הדגירה, בתנועה אחת רציפה, העבירו את תרחיף התאים מהמבחנה המחוברת למגנט למבחנה חדשה. לאחר מכן, ספרו את התוצאה הכוללת של תאי B בתרחיף באמצעות סופר תאים אוטומטי. כדי לאשר את הטוהר של תאי ה-B המועשרים, הדגרו כ-50,000 תאים עם נוגדנים ל-anti-CD19, CD20 ו-anti-CD45 המשורשנים לכרומופורים שונים בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.לאחר מכן, שטפו את התאים ב-1 ml של Phosphate Buffered Saline בריכוז רגיל ו-1% bovine serum albumin. סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-400-500g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את העלייה (supernatant) וסספנדו מחדש את המשקע ב-200 µL של Phosphate Buffered Saline.נתחו את טוהר תאי ה-B באמצעות ציטומטריית זרימה, שבשיטה זו היא בדרך כלל גבוהה מ-90%. השעו את התאים ב-150 µL של Phosphate Buffered Saline בריכוז סטנדרטי. לאחר מכן, הזריקו את תרחיף התאים תוך-ורידית לווריד הזנב של עכברים בני שישה עד שבעה שבועות, ללא קשר למגדרם.הזרקה תוורידית של תאי הלימפומה שבודדו מדם של מטופל לווריד הזנב של העכבר היא קריטית אף היא להבטחת השתרשות מוצלחת. לאחר הקרבת העכברים בתא פחמן דו-חמצני, אספו את האיברים השונים. לאחר מכן, העבירו את האיברים לפירוק מכני באמצעות מסנן של 70 micron בעזרת גב של בוכנה של מזרק כדי להפיק תרחיף של תאים בודדים.סבבו במערך צנטריפוגה את כל הדגימות, למעט דם, ב-400 עד 500g למשך חמש דקות, והשליכו את העל-משקע. השתמשו בבופר Ammonium-Chloride-Potassium בריכוז בודד כדי לlysis של תאי דם, מח makers, טחול וכבד. סינון של תאים שנגזרו מאיברים שבודדו מעכברים כדי לקבל תמיסת תאים בודדים לפני המעבר לציטומטר זרימה הוא חשוב כדי למנוע סתימה של המכשיר.השתמש בנוגדנים ספציפיים לתאי B, כגון anti-CD19, CD20 ו-CD45, כדי לצבוע את התאים. שימוש בציטומטריה של זרימה הראה כי תאי ה-B שהופקו מכל איבר היו חיוביים לנוגדנים CD19, CD20 ו-CD45. בהתבסס על התאים שנבחרו (gated cells), כמת את תאי הגידול הספציפיים לאיבר ואת תאי הגידול המושתלים שהתקבלו מעכברים שהוזרקו להם תאי לימפומה של תאי מעטפת (mantle cell lymphoma).במחקר זה, בוצע ניתוח בשיטת ציטומטריה זרימה כדי לבחון את טהרת תאי B לפני ואחרי העשרה בלימפומה של תאי המעטפת (mantle cell lymphoma). לאפיון התאים החד-גרעיניים של לימפומת תאי המעטפת, נעשה שימוש בסממנים ספציפיים לתאי B כגון CD45, CD19, CD5, CD200, CD20, Kappa ו-Lambda. ניתוח הציטומטריה הזרימה מראה תאים שנצבעו באופן חיובי עבור CD45, CD19, CD20 ו-CD5.אלה נבחרים לאפיון. נבחרים גם תאים שלא נצבעו ל-CD23 ו-CD200. מידת ההשתבצות הספציפית לאיברים נבדקת על ידי עיבוד נוסף של האיברים באמצעות ציטומטריה זרימה ולאחר מכן ניתוח של תאי B.מוצג כאן ייצוג השוואתי של דפוס ההשתחית (engraftment) שהתקבל משני מטופלים באמצעות איברים כגון הטחול, מוח העצם והכבד. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בתוך שלושה שבועות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להעשיר PBMCs המשמשים להשתלות זרות (xenografts) וכן לבצע בדיקה סדירה של העכברים לאיתור סימנים חיוניים למחלה, כגון פרווה פרועה, גב קמור, שיתוק של הרגליים האחוריות וירידה במשקל.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן יהיה ליישם קסנוגרפטים (xenografts) בסוגים אחרים של לימפומה, למשל, לצורך ביצוע רפואה מותאמת אישית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך לחוקרים אחרים בתחום ההמטו-אונקולוגיה, לבחון את האמצעים להקמת לימפומה של תאי מעטפת (mantle cell lymphoma) המופקת מחולים בעכברי nod scid חסרי חיסון. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לטהר PBMCs המופקים מחולים ולהשתמש בהם להשתלת קסנוגרפטים בעכברים חסרי חיסון, וזאת על מנת להבין את אסטרטגיית הטיפולים.אנא, אל תשכחו שעבודה עם דגימות דם אנושיות ראשוניות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, בעת ביצוע הליכים אלה.

tumor-engraftment-xenograft-mouse-model-human-mantle-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

שיטה אמינה עבור השתלת בלוציפראז-מתויג האדם ממאיר עצב היקפי נדן תאים סרטניים לתוך עצב השת של עכברים immunodeficient מתואר. השימוש הדמיה פליטת אור להפגין הקמת התקין של שתלי וקריטריונים גידול של הפרדה אקראית של בעלי חיים לקבוצות המחקר נדונות גם.

Orthotopic Xenografting של האדם בלוציפראז-Tagged ממאירה היקפיים נדן בתאי העצב גידול של In vivo בדיקה של סוכני המועמד טיפולית

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת מודל עכבר xenograft אנושי. עכבר מדוכא חיסון מוזרק עם cyclophosphamide כדי לגרום לדלדול תאי החיסון. תאי גידול שמקורם במטופל מעורבבים עם תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) בהידרוג'ל מוזרקים תת עורית לעכבר, ויוצרים גידול עם תאי T חודרים.

טכניקה ליצירת מודל עכבר קסנוגרפט אנושי המושתל על ידי PBMC אנושי

xenografts גידול האנושי בעכברים עם מערכת חיסון חלשים הם כלים רבי ערך כדי ללמוד ביולוגיה בסרטן. פרוטוקולים ספציפיים כדי ליצור xenografts תת עורי וintrahepatic מתאי אנושיים hepatocellular קרצינומה או שברי גידול מתוארים. התחדשות כבד הנגרמת על ידי כריתה חלקית בעכברי נמען מוצגת כאסטרטגיה כדי להקל על קליטתם intrahepatic.

דור של תת עורי וintrahepatic אדם xenografts קרצינומה hepatocellular בעכברים עם מערכת חיסון חלשים

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק הוכחה-של-קונספט הכדאיות והן את היעילות antitumor של המועבר intrabrain immunotherapies הסלולר.

העברת סטיאוטטי המאמצת של תאים חיסוניים ציטוטוקסיות במודלים מאתר של האדם Orthotopic גליובלסטומה Xenografts

כאן נשתמש זוהרים, רנטגן, והדמיה פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/שחושב טומוגרפיה ללמוד איך מעכבים פעילות mTOR משפיעה על engrafted-מח עצם מיאלומה גידולים במודל xenograft. דבר זה מאפשר ניתוחים פיזיולוגית הרלוונטיים, לא פולשנית, והן עם מודאלים מרובים של מיאלומה נגד ההשפעה של טיפולים מיקוד engrafted מח עצם מיאלומה גידולים ויוו.

הדמיה עם מודאלים מרובים זוהרים, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/חישובית טומוגרפיה של מיאלומה נפוצה מח עצם Xenografts בעכברים ליקר ביצים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום ולצבור מחלות ב-xenogeneic השתל-מול-מארח (Xenogeneic) מודל. xenoGVHD מספק מודל vivo כדי ללמוד דיכוי חיסוני של תאים האדם T. בנוסף, אנו מתארים כיצד לזהות תאים האדם T ברקמות עם PCR דיגיטלי ככלי כדי לכמת את הדיכוי החיסוני.

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

אנו מתארים היקפית אנושית תא היקפי (pbmc)-מבוסס הומניזציה מודל העכבר מבע שתלת עבור מחקר translational-אונקולוגיה. פרוטוקול זה יכול לשמש כמנחה כללי להקמת ולאפיון מודלים דומים להערכת הטיפול של I-O.

תא היקפי של דם מונאפרור (PBMC) חרט הומניזציה מודל Xenograft עבור מחקר הטרנסג-אונקולוגיה (I-O)

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות כדי ליצור מודלים של מטופלים שנגזר על המטופל (PDX) ושורות של תאים סרטניים העיקרי מדגימות סרטן הקיבה כירורגית. השיטות מספקות כלי שימושי לפיתוח סמים וחקר ביולוגיה של הסרטן.

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

אורתופון האדם גרורות הכבד uveal מלנומה מבע מודלים העכבר נוצרו באמצעות שיטות כירורגי אורתוקפית עם קטע הגידול המטופל נגזר וטכניקות הזרקת מחט עם הגוף האנושי תרבותי שורות מלנומה.

הדור של מלנומה האדם Uveal האנושי פלטפורמת Xהשתל בעכברים חיסוני

כאן אנו מציגים פרוטוקול השתלת גידול לאפיון לימפוציטים חודרים לגידולים שמקורם בגידול ובפריפריה במודל גידול בעכבר. מעקב ספציפי אחר זרם תאי מערכת החיסון שמקורם במקבל עם ציטומטריה של זרימה חושף את הדינמיקה של השינויים הפנוטיפיים והתפקודיים של תאים אלה במהלך תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות.

השתלת גידול להערכת הדינמיקה של תאי T המסתננים לגידולים CD8+ בעכברים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתיל עור אנושי בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD)-scid interleukin-2 קולטן שרשרת גמא (NSG). בדו"ח נכללים תיאור מפורט של הכנת עור אדם להשתלה, הכנת עכברים להשתלה, השתלת עור אדם בעובי מפוצל והליך התאוששות לאחר ההשתלה.

מודל Xenograft לעור למניפולציה של תגובות חיסוניות אנושיות in vivo

חקור הקמת מודל זנוגרפט בעכברים ללימפומת תאי המעטפת באמצעות תאים ממקור חולה. שיטה זו מאפשרת לבחון תרופות על תאי לימפומה אנושיים בתוך גוף חי ולפתח אסטרטגיות טיפול מותאמות אישית.

Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

גלה סרטונים נוספים