אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה
31 ביולי 2017
פרוטוקול זה פותח כדי לזהות כמותית מרכיבים microenvironment הגידול ב resioblastoma החולה resections באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ו ImageJ.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לזהות כמותית רכיבים של הסביבה המיקרובית של הגידול בחתכים של גליובלסטומה מחולים, באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ותוכנת Image J. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מרכזיות בתחום הסביבה המיקרובית של הגידול, כגון כיצם נראים רכיבים אלו בדגימות מחולים וכיצד ניתן לקבוע יחסים פיזיולוגית רלוונטיים של תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות של ניתוח דגימות מחולים. השלכותיה של טכניקה זו פונות לעבר הבהרה של הסביבה המיקרובית המורכבת והבלתי מאופיינת מספיק של גידולי גליובלסטומה.
באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, מאחר ויש לנטר מקרוב את עיתוי הפיתוח הכרומוגני כדי למנוע פיתוח יתר ורוויה של הרקמה. התחילו את הפרוטוקול בביצוע השטיפות המפורטות בפרוטוקול הטקסט המצורף. דללו את תמיסת חשיפת האנטיגנים (antigen unmasking) בעלת ה-pH הגבוה מבוססת tris ומים מזוקקים על פי המלצות היצרן.
עברו לשלב השחזור של האנטיגן באמצעות חום על ידי הוספת תמיסת ה-unmasking המדוללת לכלי מתאים למיקרוגל שאינו אטום. הניחו את השקופיות בתוך הכלי. לאחר מכן, הכניסו את הכלי עם השקופיות למיקרוגל.
בשלב הבא, הרתיחו את הכלי במשך 20 דקות בהספק גבוה. עקבו אחר מפלס הנוזלים כדי לזהות התאיידות ומלאו את הכלי במים מזוקקים לפי הצורך. השאירו את הדגימות להתקרר בתוך התמיסה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
סמנו את מתאר דגימת הרקמה באמצעות חומר הידרופובי כדי למזער את נפח הריאגנטים הדרוש לכיסוי הדגימה. לאחר מכן, העבירו באמצעות פיפט מספיק תמיסת חדירה (permeabilization solution), 100 עד 200 microliters, כדי לכסות את דגימת הרקמה. הסירו והשליכו את התמיסה, וכסו את דגימת הרקמה שוב בתמיסת חדירה.
יש לדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר עם תמיסת חסימה למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לדגור את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים המדוללים בתמיסת חסימה. למחרת, יש לזהות את הנוגדנים הראשוניים באמצעות ריאגנט פולימר חרשרית פרוקסידאז (HRP) התואם לבעל החיים ממנו הופקו הנוגדנים הראשוניים.
העבירו באמצעות פיפט מספיק תמיסת חדירות (permeabilization solution) כדי לכסות את דגימת הרקמה והדגירו את הדגימה למשך חמש דקות. הסירו והשליכו את התמיסה וכסו את דגימת הרקמה בתמיסת חדירות פעם נוספת למשך חמיש דקות. הדגירו את השקופיות ב-0.3% hydrogen peroxide וב-IX TBS למשך 15 דקות.
פתח את הדגימות עם תסבסב peroxidasa diaminobenzidine או dab למשך שתיים עד 10 דקות, עד להשגת עוצמת הצביעה הרצויה. צבע צביעה נגדית לדגימות כדי לזהות את גרעיני התאים, למשל באמצעות hematoxylin בהתאם לפרוטוקול היצרן. ייבש את הדגימות באמצעות 100% ethanol ו-xylene.
לבסוף, קבעו את הדגימות באופן קבוע באמצעות מדיום קיבוע. שניים מאזורי העניין בתוך כריתות הגידול שלנו, הגידול הראשוני (Bulk) והאזורים הסמוכים (Adjacent), המורכבים בעיקר מרקמה בריאה עם תאי סרטן פולשניים מפוזרים, זוהו על ידי נוירופתולוג משתף בדגימות חולה שצבעו בצבעי המטוקסילין ואאוזין. אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית זיהתה צביעה חיובית עבור אסטרוציטים, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים בכל דגימת חולה.
ביצענו צביעה ללא נוגדן ראשוני לצורך בקרה שלילית. היצרן המליץ על דילול נוסף לפני שהכרענו על דילול של 1:200, בשל צביעה חיובית אופטימלית של גוף התא והזרועות תוך מזעור הרקע עבור הנוגדן anti ALDH 1l1. באמצעות Image J, כומת אחוז הכיסוי של צביעת אוליגו-דנדרוציטים חיוביים ל-OSP-1 כדי להשוות בסופו של דבר את ההבדלים באזורי העניין שלנו.
לאחר החלת הסף המתאים על התמונה, ניתן למדוד ולהשוות את אחוז הכיסוי מהסף עבור מספר מטופלים. חמישה אזורים סמוכים ואזורי גוש של דגימות מטופלים עם גליובלסטומה או GBM, לצד רקמת מוח בריאה, הושוו עבור אחוז הכיסוי של Oligodendrocyte-specific protein one או OSP1. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את טכניקת הצביעה בארבע שעות ביום הראשון ובשעתיים ביום השני, אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשגיח מקרוב על עוצמת צביעת הרקמה ועל רמת ההידרטציה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי כמותי של רכיבי סביבת המיקרו של הגידול בחתכים כירורגיים של מטופלים עם גליובלסטומה, באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ותוכנת ImageJ. טכניקה זו שואפת לספק תובנות לגבי סביבת המיקרו המורכבת של גידולי גליובלסטומה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- היסטולוגיה
רקע
- גליובלסטומה היא גידול מוחי אגרסיבי ביותר.
- למיקרו-סביבת הגידול תפקיד מכריע בהתקדמות הגידול.
- הבנת ההרכב של סביבה זו חיונית לפיתוח טיפולים ממוקדים.
- אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של רכיבי הרקמה.
מטרת המחקר
- להערכה כמותית של הסביבה המיקרוסקופית של הגידול במדגמי גליובלסטומה.
- לקביעת יחסים רלוונטיים פיזיולוגית בין סוגי תאים שונים.
- לספק שיטת ניתוח פשוטה עבור מדגמי חולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית לצביעת רקמות.
- תוכנת ImageJ לניתוח כמותי.
- פרוטוקולי שטיפה וחשיפה של אנטיגנים (antigen unmasking) לפי המלמות היצרן.
- ניטור קפדני של זמני הפיתוח הכרומוגני.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של רכיבים שונים של מיקרו-סביבת הגידול.
- ביסוס של שיטות לקביעת יחסי תאים בדגימות גליובלסטומה.
- תובנות לגבי המורכבות של מיקרו-סביבת הגליובלסטומה.
- הדגמת ישימותה של השיטה על דגימות מחולהים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה לחקר מיקרו-סביבות של גליובלסטומה.
- הוא מסייע בהבנת האינטראקציות בתוך מיקרו-סביבת הגידול.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על ממצאים אלה כדי לשפר אסטרטגיות לטיפול בגליובלסטומה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
ניתוח כמותי של הסביבה המיקרובית של הגידול בדגימות גליובלסטומה ממקור חולה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות תאי גליה בגילוי תרופות לנוירו-אונקולוגיה. על ידי אספקת מדידות הניתנות לשחזור וספציפיות לאזור של אסטרוציטים, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים, שיטה זו תומכת בתיקוף מטרות ובסריקה פנוטיפית במערכות הרלוונטיות למחלה. היא מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי קישור הרכב הסביבה המיקרובית לתגובה טיפולית ולמנגנוני עמידות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של פנוטיפים של תאי גליה ומצבם התפקודי בתוך אזורי גידול הטרוגניים.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות כמותיות מבוססות דימות להערכת מעורבות המטרה ו modulates של המיקרו-סביבה.
- ערך ניבוי: תומך בבחירת מטרה המותאמת לסמנים ביולוגיים על ידי קורלציה בין שכיחות תאי הגליה למדרגי פתולוגיה בדגימות מטופלים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: קובע פרוטוקולים סטנדרטיים של אימונוהיסטוכימיה התואמים לתהליכי דימוי ואנליזה בהסבב גבוה.
- פלט כמותי: מספק מדדי אחוזי כיסוי באמצעות ImageJ המאפשרים השוואות בין דגימות ובין אזורים.
- שחזור: מגדיר בקרות תזמון קריטיות לפיתוח כרומוגני על מנת להבטיח ספציפיות של האות ולמזער רעשי רקע.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בדגימות כריתה ממטופלים ממש כדי לשמור על נאמנות פתופיזיולוגית במחקרי תיקוף של מטרות.
- המשכיות תרגומית: גישור בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים על ידי הגדרת מדדים כמותיים להרכב תאי הגליה.
- הפחתת סיכונים: צמצום אי-הוודאות בהפחתת סיכונים ביולוגיים בטיפולים המכוונים לתאי גליה באמצעות אפיון ההקשר של המיקרו-סביבה.
שילוב של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), ובמיוחד עבור תוכניות של נוירו-אונקולוגיה המתמקדות במודולציה של המיקרו-סביבה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אפשור מיפוי מרחבי וכמותי של אוכלוסיות גליאליות ברקמות אנוש.
- סריקה: מייצר דפוסי צביעה סטנדרטיים וכמותיים שניתן להשתמש בהם להערכת השפעת תרכובות על הרכב המיקרו-סביבה.
- אנליזה: מספק מדידות של אחוזי כיסוי מבוססות סף המאפשרות השוואה סטטיסטית בין תנאים ניסויים.
- מחקר תרגומי: תואם לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים על ידי קישור צפיפות תאי גליה לאזורים היסטופתולוגיים רלוונטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה של IHC/ImageJ הניתן להעברה וחל: עבור מודלים של גליומה וגידולי מערכת העצבים המרכזית (CNS) אחרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה באמצעות ניתוח כמותי עם רזולוציה מרחבית של תאי גליה בדגימות חולים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לשחזור אנטיגנים, חסימה וזמני פיתוח.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות להמשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות באינטראקציות של המיקרו-סביבה של המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרופיהות מווסתות גליה המותאם לסיכון, בהתבסס על נתוני מעורבות במיקרו-סביבה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה וטיפול בדגימות נוירופתולוגיות.
- תלוי בתזמון אופטימלי של פיתוח כרומוגני למניעת רוויה של האות.
- מחייב פרוטוקולי סף (thresholding) סטנדרטיים ב-ImageJ לצורך כימות עקבי.
- דורש גישה לדגימות כריתה של גליובלסטומה ממקור חולה עם אזורי עניין (ROI) מסומנים.
- מוגבל על ידי הטרוגניות של הרקמה והצורך בניתוח ספציפי לאזורים כדי למנוע אותות מבלבלים.
