Name: אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: חקור אימונוהיסטוכימיה כמותית של מיקרואנבירונת גידולים בגליובלסטומה החולה באמצעות ImageJ. שיטה זו מאפשרת זיהוי רכיבי סביבת הגידול וקביעת יחסים פיזיולוגיים של תאים לפיתוח טיפולים ממוקדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד&quot;ר. פאהד באפאקיה וג&#39;ים מנדל על רכישת וזיהוי דגימות החולה, גארט פ&#39;ביילי לעזרה עם אימונוהיסטוכימיה, וכן מאגר ביאורוספטורי ומחקר מחקר רקמות, המרכז לחקר הלב וכלי הדם במרכז ההיסטולוגיה ומכון המחקר ביומולקולרי באוניברסיטה של ​​וירג&#39;יניה. רכישת מדגם, אימונוהיסטוכימיה, והדמיה.

פרוטוקול זה מזהה רכיבים סלולריים דגימות פרפין קבוע מוטבע (FFPE) מוטבע (FFPE), כפי אופייני לדגימות המטופלים קליניים. הטבעה פרפין מאפשר תחזוקה הטובה ביותר של מורפולוגיה הסלולר והרקמות, כמו גם יש אריכות ימים טובה יותר של חלקים. הדגימות המשמשות ניתוח זה היו לגשת דרך אוניברסיטת וירג &#39;יניה Biorepository ו מחקר רקמות מתקן. דגימות החולה נבחרו על ידי נוירופתולוג המבוסס על אבחנה סופית של גלובלסטומה (אסטרוציטומה, WHO דרגה IV), אשר סיימה את תהליך החזרת הגידול באוניברסיטה של ​​וירג&#39;יניה בין השנים 2010 ו -2013, וזוהו לפני ניתוח זה 11 . 1. FFPE דוגמה Deparaffinization ו התייבשות הערה: חלק זה של הפרוטוקול הוא ספציפי דגימות FFPE. בעוד דגימות paraffin- מוטבע יכול להיות שימושי יותר עבור ניתוח זה בגלל שימור של תאים סלולריים ו- Tנושא מורפולוגיה, ניתוח זה יכול להיעשות גם עם חלקים קפואים. אם באמצעות מקטעים קפואים, חלק זה יכול להיות מושמט ולהמשיך ישירות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שוטף הבא 5 דקות כל: Xylene, קסילן, אתנול 100%, אתנול 100%, אתנול 95%, אתנול 95%, אתנול 70%, מים deionized, מים deionized </li></ol> 2. אחזור אנטיגן הערה: חלק זה של הפרוטוקול יש צורך לשבור גשרים מתילן נוצר במהלך קיבעון פורמלין של דגימות FFPE ולחשוף אתרי אנטיגן עבור נוגדנים לאגד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל טריס מבוסס גבוה pH אנטיגן מסיר פתרון על המלצה היצרן במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אחזור אנטיגן בחום באמצעות מיקרוגל. צורות אחרות של אחזור בתיווך חום (כגון סיר לחץ, סיר אדים או מים רותחים) יספיקו גם הם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון מסיר מדולל לתוך מיקרוגל לא חתוםכְּלִי שַׁיִט. המקום שקופיות לתוך כלי. המקום שקופיות לתוך מיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים במשך 20 דקות בעוצמה גבוהה. לפקח על רמות נוזלים על אידוי, וכן לחדש עם מים מזוקקים לפי הצורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר דגימות להתקרר פתרון עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם רקמות מתאר עם עט הידרופובי כדי למזער נפח של ריאגנטים הדרושים כדי לכסות מדגם. הערה: הקפד לשמור על דגימות רקמות hydrated ולא נותנים להם להתייבש כמו זה ישפיע על יעילות מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון pipet מספיק permeabilization (טריס שנאגרו מלוחים (TBS) + 0.01% Triton-X) כדי לכסות מדגם רקמות (בדרך כלל על 100-200 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות בטמפרטורת החדר עם פתרון חסימת (פתרון הסרום 2.5% + פתרון permeabilization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות לילה 4 מעלות צלסיוס עם נוגדנים ראשוניים בדילולב חסימת פתרון. הערה: כל נוגדנים ראשוניים המשמשים כאן הם מדולל ב 1: 200, אבל דילולים אופטימלי ניתן לקבוע באמצעות דילולים סדרתי החל עם המלצה היצרן. מידע מפורט על נוגדנים בשימוש בפרוטוקול זה פורסם בעבר 11 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי נוגדנים ראשוניים באמצעות חזרת peroxidase פולימדיאז מגיב המקביל עם החיה המארח העיקרי נוגדן, בעקבות פרוטוקול היצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פתרון permeabilization מספיק כדי לכסות מדגם הרקמה ו דגירה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות 0.3% H 2 O 2 ב 1x TBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח דגימות עם dixinobenzidine peroxidase (DAB) המצע עבור 2 - 10 דקות עד עוצמת הכתם הרצוי מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות Counterstain לזהות גרעיני תאים, כגון עם hematoxylin, בעקבות פרוטוקול היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים דגימות עם 100%אתנול וקסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר דגימות לצמיתות עם התקשורת הרכבה. </li></ol> 4. אזורים של זיהוי אינטרסים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות תמונה תחת מיקרוסקופ brightfield מסוגל תמונות ברזולוציה גבוהה. הערה: השתמש ברכיבים סלולריים להדמיה ברזולוציה של 20x לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מצלמה לאזורים ספציפיים של עניין בכל דגימות הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תמונות כקובצי TIFF לכימות. </li></ol> 5. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תמונות ב- ImageJ לכימות של כיסוי אחוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תוסף צבע הסף כדי להסיר צבע סגול מן הגרעיני hematoxylin מוכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת תמונה ל -8 סיביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סף ללא רקע כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך התמונה באמצעות אחד 17 טעון מראש מסננים סף ImageJ ( כלומר MaxEntropy) כך רק DAB מנות מוכתמות כלולים בסף. הערה: בחר את מסנן הסף האופטימלי מראש ש - minimizהכללה של מכתים רקע. זה יכול לסמוך על איכות מכתים וספציפיות של נוגדנים. השתמש באותו סף עבור כל משכפל טכני בתוך כל מדגם המטופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת סף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אזור האחוזים של התמונה הסופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע אזור כיסוי כיסוי עבור אזורים מרובים בתוך כל מדגם. </li></ol>

<ol><li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+glioma+growth%3A+a+guerilla+war%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li>
<li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+the+terminator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li>
<li>Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+Irradiation+Promotes+Migration+and+Invasiveness+of+Glioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells.</a> Cancer Res. 61 (6), (2001).</li>
<li>Tuettenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrence+pattern+in+glioblastoma+multiforme+patients+treated+with+anti-angiogenic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).</li>
<li>Munson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-invasive+adjuvant+therapy+with+imipramine+blue+enhances+chemotherapeutic+efficacy+against+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma.</a> Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36(2012).</li>
<li>Correia, A. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+is+a+dominant+force+in+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist.+Updat%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance.</a> Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).</li>
<li>Rubin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Only+in+congenial+soil%3A+the+microenvironment+in+brain+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis.</a> Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).</li>
<li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+glioma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li>
<li>Le, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+astrocytes+by+glioma+cells+to+facilitate+invasiveness%3A+a+mechanism+involving+matrix+metalloproteinase-2+and+the+urokinase-type+plasminogen+activator-plasmin+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade.</a> J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+microglia%2Fmacrophages+enhance+the+invasion+of+glioma+stem-like+cells+via+TGF-%CE%B21+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway.</a> J. Immunol. 189, 444-453 (2012).</li>
<li>Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Cellular+Microenvironment+of+Glioblastoma+to+Develop+Predictive+Statistical+Models+of+Overall+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Image+Analysis+of+Cellular+Heterogeneity+in+Breast+Tumors+Complements+Genomic+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling.</a> Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).</li>
<li>Yi, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Obstructive+Intimal+Lesions+and+Their+Cellular+Phenotypes+in+Chronic+Pulmonary+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).</li>
<li>Turcan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH1+mutation+is+sufficient+to+establish+the+glioma+hypermethylator+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype.</a> Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).</li>
<li>Songtao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH+mutations+predict+longer+survival+and+response+to+temozolomide+in+secondary+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma.</a> Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).</li>
<li>Shinojima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Value+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Patients+with+Glioblastoma+Multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme.</a> Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).</li>
<li>Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+high-grade+gliomas%3A+where+do+we+stand%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?</a> Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).</li>
<li>Badie, B., Schartner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+glioma+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in glioma biology.</a> Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).</li>
<li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li>
<li>Alves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cells%3A+A+heterogeneous+and+fatal+tumor+interacting+with+the+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma.</a> Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+and+macrophages+in+glioma+maintenance+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression.</a> Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li>
<li>Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+astrocytes+in+the+progression+of+brain+cancer%3A+complicating+the+picture+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment.</a> Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).</li>
<li>Rath, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Enhance+the+Invasion+Potential+of+Glioblastoma+Stem-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells.</a> PLoS One. 8 (1), e54752(2013).</li>
</ol>

אף אחד.

השיטה המוצעת כאן היא גישה כמותית לניתוח דגימות היסטולוגית מוכתמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית המסורתית. המתודולוגיה הנוכחית עבור סוג זה של ניתוח כולל פרוטוקולים מכתים דומים ואחריו לדירוג על ידי פתולוגים עצמאיים. שיטה זו היתה מהימנה, אולם עבור מספר יישומים, נדרשת הבנה מדויקת יותר של האיפור הסלולרי, כגון הבנה טובה יותר של ההטרוגניות הקשורה בגידולים וסיכום מדויק של גידולים למחקרים חוץ גופית. פרוטוקול זה מדגים...

Glioblastoma (GBM), סרטן השד הנפוץ ביותר וממאיר, מאופיין פלישה מפוזר מאוד מן הגידול העיקרי הראש לתוך parenchyma המוח בריא 1 , 2 . הפלישה המפוזרת הזו גורמת לגידול קשה במיוחד להתרחש באופן מלא, ותאי הסרטן הפולשים שנותרו לאחר הטיפול הם הסיבה השכיחה ביותר להישנות בלתי נמנעת 2 , 3 , 4 . בעבר, מצאנו מעכב את הפלישה לתאי גליומה מפוזר להיות מועיל מבחינה טיפולית 5 , אולם מעט ידוע על מנגנונים מורכבים התורמים פלישה GBM. הגידול microenvironment, או רקמות המקיפות את הסרטן, כבר מעורב בהתקדמות של גידולים במספר סוגי סרטן 6 , 7 . הגידול microivironment הגידול glioblastoma, בעמ &#39;ארטיקולרי, הוא יחסית מאופיין והוא מורכב במיוחד, חיבור של תאים גליה מרובים, כגון אסטרוציטים, microglia, ו oligodendrocytes, כמו גם מטריקס תאיים, גורמים מסיסים, גורמים ביו-פיזי. ניסיוני, astrocytes ו microglia הוצגו כדי להגביר את התקדמות glioma ו פלישה 8 , 9 , 10 , אבל את ההרכב של כל תאי גליה של microenvironment המוח האנושי אינו ידוע. הראינו בעבר רכיבים microenvironmental יכול לחזות הישרדות המטופל על ידי כמותית ניתוח מרכיבי הסלולר של microivironment glioblastoma ושילוב הניתוחים שלנו לתוך מודל סיכונים יחסיים 11 . כאן, אנו מתארים את שיטת ניתוח כמותי לזיהוי אוכלוסיות של תאים גליה בתוך הגידול בתפזורת באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולה glioblastomaS. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה chromogenic כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. הערכת אחוז כיסוי יוצר מדידה פשוטה לקביעת הבדלים מורפולוגיים של תאים, במיוחד אלה מושפעים אינטראקציות עם תאים סרטניים. מחקרים קודמים לכימות מכתים היסטופאתולוגיים משתמשים בכתמים סטנדרטיים כגון hematoxylin ו- eosin 12 או Trichrome 13 של Masson, אשר אינם מנצלים את הספציפיות של מכתים אימונוהיסטוכימיים המבוססים על נוגדנים. השיטה שלנו פותחה כדי לכמת ישירות את אוכלוסיות גלייה בתוך resioblastoma החולה גידולים הגידול, אשר אנו שואפים להשתמש כדי להבהיר את microivironment glioblastoma מורכבים.

<table><tbody><tr><td>קסילן</td><td>פישר כימיקל</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חשיפת אנטיגן עם pH גבוה</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>סרום</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוסים נגד ALDH1L1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-IBA1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>חלבון ספציפי אנטי-אוליגודנדרוציטים1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS מעבדות</td><td>וקטור נגד עיזים</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS אוניברסלי (נגד עכבר/ארנב)</td> <td>מעבדות וקטור</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB מצע</td><td>וקטור מעבדות</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין נגד כתמים</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice הרכבה מדיה</td><td>אמרסקו</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP</td><td>Pen מחקר מוצרים בינלאומיים</td><td>195506</td><td></td></tr></tbody></table>

אימונוהיסטוכימיה כמותית של microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

עם העניין הגובר של microenvironment הגידול, יצאנו לפתח שיטה כדי לקבוע במיוחד את רכיבי microenvironment בתוך דגימות החולה של glioblastoma, סרטן המוח הקטלני הפולשני ביותר. לא רק שיטות כמותיות מועילות לתיאור מדויק של רקמות חולים, הם יכולים גם לתרום פרוגנוזה מדויקת יותר, אבחון, ופיתוח של מערכות הנדסה רקמות תחליפים. ב glioblastoma, תאים גליה, כגון microglia ו astrocytes, היו מתואמים באופן בלתי תלוי עם פרוגנוזה גרועה על פי דירוג הפתולוג. עם זאת, מצבם של תאים אלה ורכיבי תא גליה אחרים לא תוארו באופן כמותי. זה יכול להיות קשה בשל תהליכים גדולים לסמן תאים אלה גליה. יתר על כן, רוב הניתוחים היסטולוגית להתמקד מדגם הרקמה הכוללת או רק בתוך חלק הארי של הגידול, בניגוד כימות שרטוט מבוסס על שנינות אזוריםהין הרקמה ההטרוגנית ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לזיהוי כמותי וניתוח של אוכלוסיות של תאים גליה בתוך בתפזורת הגידול באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולים glioblastoma. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה בגידולים הגידול המטופל ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. בעזרת טכניקות אלה אנו מסוגלים לתאר טוב יותר את התאים גליה ברחבי אזורים של microivironment הגידול glioma.

לצורך ניתוח זה, זוהו שני אזורים של אינטרסים בגידולים שלנו - הגידול העיקרי של הגידול והאזורים הסמוכים, המורכבים בעיקר מרקמות בריאות עם תאים סרטניים פולשים פולשים ( איור 1 א &#39; , 1 ב&#39; ) - זוהו על ידי נוירופתולוגים משתפי פעולה על hematoxylin ו- eosin דגימות. בתוך כל מדגם המטופל, מכתים חיובי עבור האסטרוציטים ( איור 1C ), microglia ( <strong...

פרוטוקול זה פותח כדי לזהות כמותית מרכיבים microenvironment הגידול ב resioblastoma החולה resections באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ו ImageJ.

אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לזהות כמותית רכיבים של הסביבה המיקרובית של הגידול בחתכים של גליובלסטומה מחולים, באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ותוכנת Image J. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מרכזיות בתחום הסביבה המיקרובית של הגידול, כגון כיצם נראים רכיבים אלו בדגימות מחולים וכיצד ניתן לקבוע יחסים פיזיולוגית רלוונטיים של תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות של ניתוח דגימות מחולים. השלכותיה של טכניקה זו פונות לעבר הבהרה של הסביבה המיקרובית המורכבת והבלתי מאופיינת מספיק של גידולי גליובלסטומה.באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, מאחר ויש לנטר מקרוב את עיתוי הפיתוח הכרומוגני כדי למנוע פיתוח יתר ורוויה של הרקמה. התחילו את הפרוטוקול בביצוע השטיפות המפורטות בפרוטוקול הטקסט המצורף. דללו את תמיסת חשיפת האנטיגנים (antigen unmasking) בעלת ה-pH הגבוה מבוססת tris ומים מזוקקים על פי המלצות היצרן.עברו לשלב השחזור של האנטיגן באמצעות חום על ידי הוספת תמיסת ה-unmasking המדוללת לכלי מתאים למיקרוגל שאינו אטום. הניחו את השקופיות בתוך הכלי. לאחר מכן, הכניסו את הכלי עם השקופיות למיקרוגל.בשלב הבא, הרתיחו את הכלי במשך 20 דקות בהספק גבוה. עקבו אחר מפלס הנוזלים כדי לזהות התאיידות ומלאו את הכלי במים מזוקקים לפי הצורך. השאירו את הדגימות להתקרר בתוך התמיסה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.סמנו את מתאר דגימת הרקמה באמצעות חומר הידרופובי כדי למזער את נפח הריאגנטים הדרוש לכיסוי הדגימה. לאחר מכן, העבירו באמצעות פיפט מספיק תמיסת חדירה (permeabilization solution), 100 עד 200 microliters, כדי לכסות את דגימת הרקמה. הסירו והשליכו את התמיסה, וכסו את דגימת הרקמה שוב בתמיסת חדירה.יש לדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר עם תמיסת חסימה למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לדגור את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים המדוללים בתמיסת חסימה. למחרת, יש לזהות את הנוגדנים הראשוניים באמצעות ריאגנט פולימר חרשרית פרוקסידאז (HRP) התואם לבעל החיים ממנו הופקו הנוגדנים הראשוניים.העבירו באמצעות פיפט מספיק תמיסת חדירות (permeabilization solution) כדי לכסות את דגימת הרקמה והדגירו את הדגימה למשך חמש דקות. הסירו והשליכו את התמיסה וכסו את דגימת הרקמה בתמיסת חדירות פעם נוספת למשך חמיש דקות. הדגירו את השקופיות ב-0.3% hydrogen peroxide וב-IX TBS למשך 15 דקות.פתח את הדגימות עם תסבסב peroxidasa diaminobenzidine או dab למשך שתיים עד 10 דקות, עד להשגת עוצמת הצביעה הרצויה. צבע צביעה נגדית לדגימות כדי לזהות את גרעיני התאים, למשל באמצעות hematoxylin בהתאם לפרוטוקול היצרן. ייבש את הדגימות באמצעות 100% ethanol ו-xylene.לבסוף, קבעו את הדגימות באופן קבוע באמצעות מדיום קיבוע. שניים מאזורי העניין בתוך כריתות הגידול שלנו, הגידול הראשוני (Bulk) והאזורים הסמוכים (Adjacent), המורכבים בעיקר מרקמה בריאה עם תאי סרטן פולשניים מפוזרים, זוהו על ידי נוירופתולוג משתף בדגימות חולה שצבעו בצבעי המטוקסילין ואאוזין. אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית זיהתה צביעה חיובית עבור אסטרוציטים, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים בכל דגימת חולה.ביצענו צביעה ללא נוגדן ראשוני לצורך בקרה שלילית. היצרן המליץ על דילול נוסף לפני שהכרענו על דילול של 1:200, בשל צביעה חיובית אופטימלית של גוף התא והזרועות תוך מזעור הרקע עבור הנוגדן anti ALDH 1l1. באמצעות Image J, כומת אחוז הכיסוי של צביעת אוליגו-דנדרוציטים חיוביים ל-OSP-1 כדי להשוות בסופו של דבר את ההבדלים באזורי העניין שלנו.לאחר החלת הסף המתאים על התמונה, ניתן למדוד ולהשוות את אחוז הכיסוי מהסף עבור מספר מטופלים. חמישה אזורים סמוכים ואזורי גוש של דגימות מטופלים עם גליובלסטומה או GBM, לצד רקמת מוח בריאה, הושוו עבור אחוז הכיסוי של Oligodendrocyte-specific protein one או OSP1. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את טכניקת הצביעה בארבע שעות ביום הראשון ובשעתיים ביום השני, אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשגיח מקרוב על עוצמת צביעת הרקמה ועל רמת ההידרטציה.

quantitative-immunohistochemistry-cellular-microenvironment-patient

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: Núñez, F. J.,  et al.{{}} הערכת סמנים ביולוגיים בגליומה על ידי אימונוהיסטוכימיה על תרביות נוירוספרה תלת-ממדיות של גליומה משובצת פרפין. J. Vis. exp. (2019). סרטון זה מדגים טכניקה אימונוהיסטוכימית לתיוג סמנים ביולוגיים של גידול בנוירוספירות של גידולי מוח משובצים בפרפין. החלקים הנוירוספריים עוברים הסרת פרפין והחזרת נוזלים, ולאחר מכן טיפול לחשיפת אתרי סמנים ביולוגיים. לאחר מכן מוחלים נוגדנים ראשוניים ומשניים כדי לסמן את הסמנים הביולוגיים הללו. הנוגדנים המשניים קשורים על ידי אנזימי פרוקסידאז...

צביעה אימונוהיסטוכימית של סמנים ביולוגיים בקטעי נוירוספירה של גידול מוח

פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מימדית לאימונוציטוכימיה מתוארת.

אופטימיזציה של תרבית תאי גליומה בדרגה גבוהה מדגימות כירורגיות לשימוש במודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים ואימונוכימיה תלת-ממדית

מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

כאן אנו מתארים שיטה כדי להפריד ולהעשיר את מרכיבי microenvironment המערכת החיסונית והחיסון של הגידול גידולים הוקמה תת עורית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נפרד של הגידול לחדור המערכת החיסונית ושברים -החיסון הגידול אשר יכולים להרשות אפיון מקיף של microenvironment מערכת החיסון הגידול.

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק הוכחה-של-קונספט הכדאיות והן את היעילות antitumor של המועבר intrabrain immunotherapies הסלולר.

העברת סטיאוטטי המאמצת של תאים חיסוניים ציטוטוקסיות במודלים מאתר של האדם Orthotopic גליובלסטומה Xenografts

Neurospheres גדל כמו תרבויות 3D מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה glioma. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע אימונוהיסטוכימיה תוך שמירה על המבנה התלת-ממד של glioma neurospheres באמצעות הטבעה פרפין. שיטה זו מאפשרת אפיון glioma neurosphere מאפיינים כגון stemness ובידול עצבית.

הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

לייזר לחיתוך מיקרו (LMD) היא טכניקה רגישה ומאוד לגילוי שניתן להשתמש בה כדי לחשוף מסלולים כי בתווך glioma טרוגניות ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב כדי לבודד אזורים נפרדים מרקמת glioma באמצעות LMD לייזר ואחריו ניתוח טרנססקריפט.

לכידת לייזר מיקרודיסקציה של גלימה Subregions עבור אפיון מרחבית ומולקולרית של טרוגניות Intrאטומוראלי, הנחלים, ופלישה

דיסרגולציה פרוטאומית ממלאת תפקיד חשוב בהתפשטות של גליומות המסתננות באופן מפוזר, אך מספר חלבונים רלוונטיים נותרו בלתי מזוהים. עיבוד מרחבי דיגיטלי (DSP) מציע גישה יעילה בעלת תפוקה גבוהה לאפיון הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מועמדים שעשויים לתרום לפלישה ולנדידה של גליומות מסתננות.

פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר

אנו מציגים שיטה לשכפול מיקרו-סביבה של גידול גליומה בחזית פולשנית המשלבת זרימת נוזל אינטרסטיציאלית. מודל זה הוא הידרוג'ל היאלורונן-קולגן I בתרבית רקמה שבה ניתן להפעיל ראש לחץ נוזל. פלישה ניתן לכמת, תאים ניתן לבודד או lysed.

מודל חומצה היאלורונית קולגן פוטופולימרי של מיקרו-סביבה פולשנית מסוג גליומה עם זרימה אינטרסטיציאלית

פרוטוקול זה הצליח להכין מספיק רקמות ניאווסקולריות איכותיות מדגימות גליומה באמצעות מיקרודיסקציה באמצעות לכידת לייזר לניתוח פרוטאומיקה כמותי של אנגיוגנזה גידולית, תוך התגברות על מגבלות מחקרים שמסורתית מתמקדים בעיקר בגורמים אנגיוגניים וסיפק פרופיל פרוטאומיקה רחב היקף של אנגיוגנזה של גליומה.

הכנת רקמות ניאווסקולריות מרקמות גליומה אנושיות לניתוח פרוטאומיקה כמותי של אנגיוגנזה של גידול

חקור אימונוהיסטוכימיה כמותית של מיקרואנבירונת גידולים בגליובלסטומה החולה באמצעות ImageJ. שיטה זו מאפשרת זיהוי רכיבי סביבת הגידול וקביעת יחסים פיזיולוגיים של תאים לפיתוח טיפולים ממוקדים.

אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה

גלה סרטונים נוספים