באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans
7 בספטמבר 2017
השימוש מותאם "צ'יפ חוש הריח" עבור ההדמיה סידן יעיל של C. elegans זכרים מתואר כאן. מחקרים של חשיפה זכר גליצרול פרומון מוצגים גם.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ללכוד ביעילות ארעיות סידן בתמונה בתאי עצב ראש זכריים של C.Elegans בעת חשיפה לפרומונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון הבנת ויסות מעגלים עצביים ספציפיים למין. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שכעת ניתן לצלם C.Elegans זכרים ביעילות במכשיר מלכודת מיקרו-נוזלי.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהעמסת בעלי חיים יכולה להיות קשה בהתחלה ופרומונים ביוגניים אינם מעוררים ארעיות סידן בכל בעל חיים. כדי להתחיל בהרכבת המאגרים, הכינו שלוש סטים של צינורות על ידי הכנסת מחט לקצה אחד וצינור מתכת לקצה השני. לאחר מכן, עבור כל מאגר, קח שסתום לואר תלת-כיווני וחבר מזרק של 30 מיליליטר כשהבוכנה שלו הוסרה, מזרק של שלושה מיליליטר והצינור.
מלאו כל מאגר במאגר המתאים, גירוי S בסיסי או S בזאלי המכיל פלואורסקין. לאחר מכן, הסר את כל בועות האוויר הן מהמאגר והן מהצינור, על ידי לחיצה ושאיבה של המזרק. כעת, מלאו מזרק וצינור חדשים של שלושה מיליליטר ב-S בזאלי והכניסו ליציאת היציאה של המכשיר המיקרו-נוזלי.
הפעל בעדינות מעט לחץ על המזרק עד שהחיץ יופיע על פני חורי הכניסה. לאחר מכן, חבר את צינורות בקרת הזרימה, החיץ ומאגר הגירוי לחורי הכניסה המתאימים להם, וודא שטיפות נוזל נמצאות הן על חור יציאת הטעינה והן על הצינור שיש לחבר. כעת, הפעל בעדינות עוד קצת לחץ על המזרק עד שיופיעו טיפות בכניסת יציאת טעינת התולעת, ולאחר מכן הכנס סיכת חסימה מוצקה לפתח זה.
לאחר מכן, הסר את המזרק מיציאת היציאה והצמד קו יציאה המחובר לבית הוואקום. כעת, בדוק את המכשיר לאיתור בועות בתעלות הציפה בהזנת הווידאו מהמיקרוסקופ. לחץ על שידור חי, כדי לצפות בתמונה החיה והמתין עד שהבועות יתפזרו באופן טבעי לפני שתמשיך.
לאחר מכן, הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי והשתמש במסנן GFP כדי לאשר דינמיקת זרימה תקינה. הפעל את שסתום שלושת הגלים וצפה בזרם הבקרה הפלואורסצנטי המופיע בהזנת הווידאו, כאשר השסתום פתוח. כדי להתחיל, בחרו תולעת אחת על צלחת אגר NGM לא זרועה ואפשרו לתולעת לזחול משם.
לאחר מכן, צף את הצלחת עם S בזאלי. צייר תמיסה המכילה את התולעת לתוך המזרק. כעת, במכשיר, כבה את הוואקום כדי לעצור את הזרימה באמצעות שסתום היציאה.
לאחר מכן, הסר את הסיכה המוצקה החוסמת את יציאת טעינת התולעת. הכנס את הצינור המכיל תולעים לפתח הטעינה. פתח את שסתום היציאה וצפה בהזנת הווידאו החי.
כעת, הפעל לחץ עדין על המזרק עד להופעת התולעת. משוך את התולעת לאחור אם היא נכנסת ראשונה לזנב, היא חייבת להיכנס תחילה לראש כדי להיחשף לגירוי. על המשתמש למשוך את התולעת לאחור לפני שהזנב נכנס במלואו לתעלה, אחרת, הוצאת התולעת מהתעלה היא קשה ביותר ובדרך כלל דורשת שטיפת התולעת לחלוטין דרך התעלה והעמסת תולעת חדשה.
כעת, באמצעות לחץ מהמזרק, קדמו את התולעת דרך התעלה ומקמו את ראש התולעת, כך שהיא תהיה חשופה לזרם החיץ אך לא כל כך רחוק לתוך התעלה, כך שהיא תהיה חופשית לנוע. כמות קטנה של תנועה צירית או סיבובית צפויה בבעלי חיים שאינם משותקים. למרות שהוספת משותק למאגרים כמעט מבטלת את האפקט הזה.
כדי להפחית את הסבירות לתנועה במהלך הניסוי, השתמש בזכרים מבוגרים שנלכדים ביעילות רבה יותר, הקטנת הרוחב או העובי של פתח העמסת התולעת או הגדלת משך הזמן בשיתוק. השתמש בתוכנה כדי לבצע הקלטות באמצעות עירור אור כחול. הגדר את החשיפה ל-100 אלפיות השנייה, פתח את חלון רכישת התמונה, הגדר את נקודות הזמן ל-300 עם מרווח באפס, ולאחר מכן התחל ברכישת התמונה.
לאחר חמש שניות, הפעל את הגירוי על ידי החלפת השסתום התלת-כיווני השולט על המאגרים. גירוי של 10 שניות הוא נקודת התחלה טובה וניתן להתאים את אורך הגירוי לפי הצורך. לאחר הגירוי, החזר את הזרימה על ידי לחיצה נוספת על הכפתור והמשך להקליט עד להשלמת הסרטון בן 30 השניות.
זה מאפשר לפלואורסצנטיות g camp לחזור לקו הבסיס. כעת, תנו להכנה לנוח 30 שניות לפני הניסיון הבא. תולעים המבטאות g camp 3 בנוירון הלא רגיש, ASH, מגיבות לגליצרול מולארי אחד עם שינויים גלויים בפלואורסצנטיות בתוך נוירון ה-ASH, המעידים על פעילות עצבית.
הנוירון צריך להישאר באזור הניתוח במשך כל הסרטון, אחרת עלול להיווצר חפץ תנועה. אם כן, הזז את אזור הניתוח עבור נקודות זמן אלה ומזג את ערכי העוצמה כדי ליצור עקבה יחידה. זכרים שמגורים עם הפרומון הביוגני האטרקטיבי אסקרוסיד שלוש במהלך החשיפה, ארעיות הסידן נמדדה בארבעת נוירוני ה-CEM.
מבעל חיים לחיה ונוירון לנוירון, העקבות השתנו בצורה, בסימן ובגודל. לכן, חשוב מאוד לנתח חיות רבות כאשר חוקרים תגובות פרומונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעמיס C elegans זכר למכשיר מיקרו-נוזלי ולנתח את חולף הסידן בנוירוני הראש.
ניתן להשתמש באותו תהליך עם הרמפרודיטים, כדי לזהות הבדלים ספציפיים בתגובות עצביות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חצי שעה עבור החיה הראשונה שצולמה. לאחר ההקלטה הראשונה, ניתן לטעון חיה חדשה בתמונה תוך כ-10 דקות.
בעקבות הליך זה, ניתן לשלב שיטות אחרות כמו אופטוגנטיקה עם פרוטוקול זה על מנת להבין עוד יותר כיצד מווסתים מעגלים עצביים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר "שבב ריח" (olfactory chip) מותאם שנועד לדימוי סידן יעיל של זכרי C. elegans, ובמיוחד בתגובה לגליצרין ופרומונים. השיטה משפרת את ההבנה של ויסות מעגלים עצביים ספציפיים למין בנוירוביולוגיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירוביולוגיה
- דימוי סידן
- ניתוח התנהגותי
רקע
- C. elegans משמש כאורגניזם מודל חשוב לחקר התפקוד הנוירונלי.
- דימוי סידן מאפשר תצפית על מעגלים עצביים בזמן אמת.
- תגובות תלויות-מין לגירויים מספקות תובנות לגבי הדינמיקה של מעגלים עצביים.
- טכניקות לכידה יעילות משפרות את יכולות הדימוי של דגימות חיות.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה לדימות של תנודות סידן (calcium transients) בנוירונים של הראש ב-C. elegans זכרים.
- בחינה של האופן שבו זכרים מגיבים לפרומונים ביוגניים ולגירויים אחרים.
- מתן תובנות חדשות לגבי הבקרה של מעגלים עצביים ספציפיים למין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתמשו במכשיר מיקרו-פלואידי ללכידה ולהדמיה של *C. elegans*.
- המיקוד היה ב-C. elegans זכרים כמודל ביולוגי להערכת תגובות עצביות.
- דימוי סידן בוצע באמצעות חלבון פלואורסצנטי כדי להדמיא פעילות נוירונלית.
- שלבים קריטיים כללו העמסה זהירה של התולעים ובקרה על זרימת הנוזלים במהלך הדימות.
- התהליך מאפשר דימות עוקב של בעלי חיים חדשים תוך כ-10 דקות.
תוצאות עיקריות
- נצפתה תנודתיות של סידן בנוירון ASH ובארבעה נוירוני CEM בעקבות חשיפה לפרומון.
- התגובות השתנו בצורה ובגודל, מה שמעיד על הבדלים אישיים בתגובות העצביות.
- השיטה הראתה פוטנציאל מבטיח להבנת תגובות של מעגלים עצביים לפרומונים.
- הודגמה היתכנות של הדמיית פעילות עצבית עם מינימום של ארטיפקטים הנובעים מתנועה.
מסקנות
- מחקר זה מבסס שיטה לדימות בזמן אמת של פעילות עצבית ב-C. elegans זכרים.
- ניתן להתאים את הטכניקה לבחינת מנגנונים עצביים תלויי-מין.
- גישה זו משפרת את ההבנה של תגובות עצביות לגירויים כימיים ואת הש imply שלהן עבור ויסות מעגלים עצביים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
שבב ריח מיקרופלואידי זה מאפשר דימות סידן יעיל בזכרים של *C. elegans*, ובכך נותן מענה לפער מרכזי במחקר נוירוביולוגי ספציפי למין. על ידי מתן אפשרות לדימות בזמן אמת של תגובות עצביות לפרומונים, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתיקוף מטרות עבור תרכובות נוירו-אקטיביות. גישה זו מספקת ערך חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבהרת הוויסות של מעגלים עצביים בעלי דימורפיזם מיני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מעגלים עצביים ספציפיים למין בתגובה לגירויים פרומוןליים.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה הניתנת לשחזור ללכידה ולדימוי של נוירוני ראש של זכרי C. elegans.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת היפותזות של מנגנונים בעלי דימורפיזם מיני בסריקה של תרכובות נוירו-אקטיביות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מסייע בהכנת מערכות נוירונליות שעברו תיקוף לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- ערך תפעולי: מאפשר מדידות כמותיות וסטנדרטיות של תנודות סידן באוכלוסיות נוירונליות מוגדרות.
- מוכנות הבדיקה: תומך בזרימות עבודה של דימות הניתנות להרחבה, עם מינימום ארטיפקטים של תנועה לאחר אימון ראשוני.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקשר בין דימוי עצבי בשלב הגילוי לרצף פרה-קליני באמצעות התאמה של סמנים ביולוגיים ספציפיים למגדר.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מצמצמת את העמימות בתגובות עצביות ספציפיות למגדר לגירויים כימיים.
- ביטחון חזוי: מאפשרת קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי חשיפת דפוסי תגובה משתנים בין פרטים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ובמיוחד עבור תרכובות נוירו-אקטיביות הדורשות אפיוני יעילות תלויי-מין.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ויסות מעגלים עצביים תלויי-מין באמצעות חשיפה מבוקרת לפרומונים.
- סריקה: מספק דגימות נוירונליות מוכנות לבדיקה עם הגשה ניתנת לשחזור של גירויים וקריאות סידן.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח כמותי של תנודות סידן בנוירוני ASH ו-CEM באמצעות ImageJ להערכה השוואית של תנאים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם תיקוף פרה-קליני על ידי אספקת נתוני תגובה עצבית מרובדים לפי מין, הרלוונטיים לפיתוח ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה מיקרופלואידית ניתנת לשימוש חוזר לסבבים מהירים של דימוי זכרי C. elegans, ובכך מפחית את זמן ההכנה לכל בעל חיים לאחר ההדרכה הראשונית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי פתרון מנגנוני העברה עצבית תלויי-מין.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הליכי העמסת התולעים וההדמיה, ובכך משפר את התפוקה ומפחית שונות.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go על ידי חשיפת תגובות עצביות עם דימורפיזם מיני שעשויות לנבא יעילות דיפרנציאלית של תרכובות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעדוף של תרכובות נוירו-אקטיביות מותאם סיכון, בהתבסס על פרופילי פעילות עצבית תלויי-מין.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבת התקנים מיקרופלואידיים, טיפול בתולעים וטכניקות של דימיון סידן (calcium imaging).
- תלוי בגישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, משאבות מזרק ומערכות בקרת ואקום לוויסות נוזלים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת הת方向ת טעינה עקבית של התולעים ותזמון גירויים אחיד.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הפרוטוקול להרמאפרודיטים או לזנים נוירונליים אחרים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שיעורי תגובה משתנים לפרומונים ועקומת למידה ראשונית ביעילות טעינת התולעים.
