Name: באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: חקור הדמיית סידן בנוירוני ראש של זכר C. elegans בתגובה לפרומונים באמצעות שבב חוש הריח המותאם למיקרו-זרימה. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של רגולציה מינית במעגלים עצביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות מנואל הצימר סיפק לנו הקובץ הראשוני בעיצוב הותאם לשימוש עם זכרים; פרנק שרדר על סינתזה ועל אספקת ascr #3; רוס Lagoy כדי להפוך את התובנה בסיוע הדמיה וניתוח; לורה Aurilio על הזיוף הבסיס, ומי, לצד כריסטופר המצנח, תרמו הסקירה של כתב היד הזה. מימון עבור עבודה זו סופקה תחת של מכוני הבריאות הלאומיים גרנט 1R01DC016058-01 (ס), המענק הלאומית למדע CBET 1605679 (D.R.A.), ופרס בורוז Wellcome הקריירה ב מדעי ממשק (D.R.A.).

<ol><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis%2C+Microscopy%2C+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).</li>
<li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior%2C+nerve+regeneration%2C+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).</li>
<li>Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worm+chips%3A+Microtools+for+C.+elegans+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Worm chips: Microtools for C. elegans biology.</a> Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).</li>
<li>Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+screening+of+genes+regulating+tryptophan+hydroxylase+transcription+in+Caenorhabditis+elegans+using+microfluidics+and+an+adaptive+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm.</a> Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).</li>
<li>Lockery, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+whole-animal+drug+screening+using+electrophysiological+measures+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans.</a> Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nat Commun. 7, 13023(2016).</li>
<li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neuro%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Front Mol Neuro. 6, 2(2013).</li>
<li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1 (2), 025008(2014).</li>
<li>Tatro, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+imaging+of+neurons+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Brain-wide imaging of neurons in action.</a> Front Neural Circuits. 8, 31(2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Greene, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+selection+shapes+density-dependent+foraging+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour.</a> Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).</li>
<li>Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+changes+in+two+chemoreceptor+genes+contribute+to+a+Caenorhabditis+elegans+QTL+for+foraging+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Chemoreceptors+Mediate+Developmental+Effects+of+Dauer+Pheromone+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans.</a> Science. 326 (5955), 994-998 (2009).</li>
<li>McGrath, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+evolution+of+domesticated+Caenorhabditis+species+targets+pheromone+receptor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes.</a> Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).</li>
<li>Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Expression+of+Channelrhodopsin-2+in+Single+Neurons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43164(2012).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+the+Nervous+System+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+Lon%22%5BJournal%5D)">The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>White, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+circuitry+for+sexual+attraction+in+C.+elegans+males%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males.</a> Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Chute, C. D., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mating+cues+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical mating cues in C. elegans.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).</li>
<li>Izrayelit, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+reveals+a+male+pheromone+and+sex-specific+ascaroside+biosynthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).</li>
<li>Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Ascaroside signaling in C. elegans.</a> WormBook. , 1-22 (2013).</li>
<li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+responses+within+a+single+neuron+class+enable+sex-specific+attraction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Sammut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-derived+neurons+are+required+for+sex-specific+learning+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans.</a> Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).</li>
<li>Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+male%3A+postembryonic+development+of+nongonadal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures.</a> Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).</li>
<li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons%3A+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_transformationmicroinjection/transformationmicroinjection.html">Transformation and microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+Orienting+C.+elegans+Using+Geometry+at+Microscale+for+High-Throughput+Visual+Screens+in+Neurodegeneration+and+Neuronal+Development+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35037(2012).</li>
<li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>García, L. R., Portman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+sexually+dimorphic+and+sexually+divergent+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).</li>
<li>Clokey, G. V., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autofluorescent+%26%2334%3Blipofuscin+granules%26%2334%3B+in+the+intestinal+cells+of+Caenorhabditis+elegans+are+secondary+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">The autofluorescent &#34;lipofuscin granules&#34; in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes.</a> Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).</li>
<li>Coburn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthranilate+Fluorescence+Marks+a+Calcium-Propagated+Necrotic+Wave+That+Promotes+Organismal+Death+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001613(2013).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hub-and-spoke+circuit+drives+pheromone+attraction+and+social+behaviour+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans.</a> Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השבב חוש הריח הותאם זכר משלבת פנייה לתוך נמל טעינה צר יותר, אשר מאפשר שליטה רבה יותר כיוון ועבור לכידה יעילה של זכר C. elegans. דבר זה מאפשר הפריט החזותי של שני ימינה ושמאלה חברי זוגות דו צדדיים עצביים, ללא צורך z-לערום. עקום זה מוביל אוריינטציה מרחק אנכי 100% של הזמן תולעים שבו זוג הדו-צדדיים רק אחד מכוון עם סמן פלורסנט, כגון אפר (איור דו-ממדי-E)29,30. עם זאת, בכיתות עצביים עם ארבעה סימטרי בצורה רדיאלית הנו...

Microfluidic התקני מספקים גישה מוגברת דווקא בסביבות מבוקרות, שבו חיות, כגון תולעים נימיות C. elegans, יכול להיות מרומה השפעול1. מחקרים אלה כוללים מבחני התנהגות, מחקרי הדמיה סידן או הקרנות אפילו על הפנוטיפים ספציפיים, וכתוצאה מכך מדידות מדויקות יותר של תוצאות ניסוי1,2,3,4, 5,6. מיקרופלואידיקה לספק תנאים נוזלי בקנה מידה קטן שדרכו ניסויים מפורטים ניתן להפעיל תוך ניצול כמויות מינימליות של נוגדנים. יש הפקה מתמדת של עיצובים חדשים של המכשיר microfluidic, השימוש של כל משתנה, החל ארנאס המאפשרים טבעי sinusoidal התנועה של C. elegans מבחני התנהגות ולימודים הדמיה עצבית, מלכודת התקנים המשמשים הדמיה עצבית ולימודים חוש הריח, התקנים המאפשרים עבור תפוקה גבוהה פנוטיפי ניתוח גנטי מסכי4,5,6,7. בעקבות ייצור של תבנית בסיס, microfluidic מכשירים זולים לבנות — נתן את שימושית של המאסטר — וקל לשימוש, ומאפשר לדור נתונים מהירה באמצעות מחקרים תפוקה גבוהה. הזיוף של התקנים באמצעות פולימרים כגון polydimethylsiloxane (PDMS) מאפשר היצירה של מכשירים חדשים בתוך שעות.
מחקרי הדמיה סידן להשתמש סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים (GECIs) המתבטא התאים היעד כדי למדוד את הדינמיקה עצבית של תאים אלה בזמן אמת8,9,10,11. הטבע שקוף של C. elegans מאפשר ההקלטה של פלורסנט רמות החלבונים האלה בבעלי חיים. באופן מסורתי, GECIs להסתמך על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-מבוסס חיישן ה-GFP-קלמודולין-M13 פפטיד (GCaMP), אך מחקרים מאוחרים יותר הסתגלו חיישנים אלה כדי לאפשר יותר יחס אות לרעש ופרופילים עירור אדום-העביר. בעקבות הפיתוח של GCaMP3, חלבונים עם מפרטים אלה יש מגוונים, כולל חיישנים כגון GCaMP6s ו- GCaMP6f (לאט ומהר פלורסצנטיות חופש-המחירים, בהתאמה), כמו גם RFP-קלמודולין-M13 פפטיד (RCaMP), אשר יש אדום-העביר הפעלת פרופיל. השילוב של אלה GECIs עם C. elegans גנים ספציפיים תא יזם רצפי ניתן לייעד תאים עניין, במיוחד החישה הניריונים12,13,14,15 , 16.
בעוד קלות השימוש C. elegans במחקרים microfluidic הוא לכאורה, כמעט כל המחקרים התמקדו אנדרוגינוסים. למרות זכרים בלבד החשבונאי 0.01-0.02% מהאוכלוסייה פראי סוג, ממצאים שלא יסולא בפז יכול לנבוע האפיון שלהם. ואילו connectome הפיזי של מערכת העצבים אנדרוגינוס מופה באופן מלא במשך עשרות שנים17, connectome זכר נשאר שלם, במיוחד באזור הראש של בעלי חיים18. השימוש של סידן הדמיה של הזכרים יסייע ליצירת הבנה של מערכת העצבים זכר וההבדלים שעולות בין שני המינים. גודל קטן יותר מהזכרים הבוגרים C. elegans מונעת השמנה יעיל ואמין בנמלי טעינת התקנים חוש הריח מסורתי המיועד אנדרוגינוסים גדול יותר. כדי לטפל בבעיה זו, יש את הגירסה שבב חוש הריח Chronis19 פותחה עם יציאת הטעינה צר יותר, ערוץ בגובה נמוך, והופך בנמל הטעינה תולעת (אשר לסובב את החיה), המאפשר החזיית הדו-צדדיים שמאלה/ימינה זוגות עצביים. עיצוב זה מאפשר: (1) השמנה יעיל של זכרים בוגרים צעירים, (2) כיוון יותר אמין של החיה עבור הפריט החזותי של שני בני נוירונים לזווג דו צדדיים, (3) הדמיה מדויקת של פעילות עצבית בנוירונים זכר.
יותר ויותר מחקרים מראים כי גברים C. elegans להגיב באופן שונה מאשר אנדרוגינוסים למגוון רחב של ascarosides (ascr), או תולעים נימיות פרומונים20,21,22,23 ,24. לכן, לפתח הבנה של דינמיקה עצבית, ייצוגים בתוך connectome זכר הפך אפילו יותר רלוונטי. זכר C. elegans מכיל נוירונים ספציפיים סקס 87 לא נוכח אנדרוגינוס25,26, לשנות את connectome כדרכים שטרם נקבע. היכולת תמונה הדינמיקות האלה עצביות ייחודיות יאפשר לנו להבין טוב יותר את תגובות ספציפיות סקס וייצוגי עצבית.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש שבב חוש הריח זכר הותאם עבור ההדמיה עצבית של זכר C. elegans chemosensation. הנוירון nociceptive שאש מגיב בצורה אמינה גליצרול 1 מ' אצל הזכרים, בקנה אחד עם הקודם אנדרוגיניות מחקרים27. חשיפה ascarosides עשוי להפיק תגובות כי הם משתנה חיה כדי חיה, הדורשות מספר גדול יותר של בעלי חיים כדי להיבדק. התגובה של הנוירונים צ'ם זכר הספציפי שהוצג בעבר, דרך אלקטרופיזיולוגיה וגם סידן הדמיה מחקרים, להגיב variably ascaroside #323.

<table><tbody><tr><td>רקיק אוניברסיטת</td> <td>רקיק סיליקון</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>מפתח</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>מסכת רקיק</td><td>CAD / שירותי אמנות</td> <td>-</td> <td>הזמנה מותאמת אישית. מודפס ברזולוציה של 25,000 dpi.</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0 מ"מ Dermal Punches</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>צינורות רכים</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>צינורות קשיחים</td><td>IDEX Health & מדע</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>פינים</td><td>צינור קטן ניו אינגלנד</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr><tr><td>סיכות חסימה</td><td>צינור קטן ניו אינגלנד</td><td>0.415/0.425 אינץ' OD x .500</td><td>אצווה</td>ארוכה PB07027</tr><tr><td>מזרקים 3 מ"ל</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30 מ"ל מזרקים</td><td>חיוניות רפואית</td><td></td><td>302832 משמש כמאגרי חיץ.</td></tr><tr><td>מחט קהה מנירוסטה 23 מד,</td><td>חברת אספקת רכיבי</td> פוליפרולילן <td>לואר NE-231PL-50</td><td></td></tr><tr><td>פקקי עצירה עם חיבורי לואר; תלת כיווני; מנעול זכר; 5 דפוס זרימה; לא סטרילי</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>מערכת בקרת מרקטור LF-5 מערכת פלזמה</td><td>מרקטור</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>סקוטש טייפ</td><td>סקוטש</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>סדרה 20 קאמרי</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ואקום</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>420250000</td><td>24 ס"מ קוטר פנימי.</td></tr><tr><td>סירות שקילה</td><td>קול-פאלמר</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>קלאסי פלוס איזון</td><td>מטלר טולדו</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר זכוכית</td><td>קול-פאלמר</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברה</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>תנור</td><td>שלדון ייצור בע"מ</td><td>9120993</td><td>מספר דגם: 1500E.</td></tr><tr><td>60 מ"מ, לא מאוורר, קצה חד צלחות פטרי</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td>Zeiss-Hammamatsu</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>אור פלורסנט כחול</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24-30V/7.9A DC.</td></tr><tr><td>מתאם תאורה</td><td>Zeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>סדרה 1 ו-2 שסתום בידוד PTFE אינרטי מיניאטורי</td><td>Parker</td><td>001-0017-900</td><td>שסתום תלת כיווני לבקרת זרימה.</td></tr><tr><td>ValveLink8.2&reg;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>Flow Switch Controller</td></tr><tr>Micro<td>Manager</td> <td>Micro-Manager-Free תוכנה חופשית, ניתן להוריד בכתובת:</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td><td>ImageJ ImageJ-Free</td> <td>תוכנה, ניתן להוריד בכתובת: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Grade</td><td>Apex</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Apex</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>Alfa</td><td>Aesar A11470</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>טטרמיסול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L9756-10(G)</td><td>חנות ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>פלואורסצאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>FD2000S-250 מ"ג</td><td>רגיש לאור. יש לאחסן בבקבוקונים להגנה מפני צילום.</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>אסקרוזיד #3</td> <td>-</td><td></td> <td>מסונתז במעבדת שרדר (אוניברסיטת קורנל).</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 line</td><td>-</td><td>-CX10979</td> <td>(KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). פותח במעבדת ברגמן. מסופק מספריית מעבדת אלברכט.</td></tr><tr><td>קו CEM GCaMP6</td> <td>-</td><td></td> <td>JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). פותח על ידי רובין לינטס. מסופק מספריית מעבדת סריניוואסאן.</td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis המרכז הגנטי</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>"מאגר"</td> <td>-</td><td></td> <td>ליצירת מאגר: "מזרק 30 מ"ל", מחובר ל"תא עצירה עם חיבורי לואר; תלת כיווני; מנעול זכר; דפוס זרימה 5; לא סטרילי", המחובר ל"מזרק 3 מ"ל" ו"מחט קהה מנירוסטה 23 מד, פוליפרולילן לואר". לאחר מכן, "מחט קהה מנירוסטה 23 מד, פוליפרולילן לואר" מוכנס לתוך "צינורות רכים" כ-1/3 מהדרך במורד המחט.</td></tr></tbody></table>

באמצעות שבב חוש הריח של microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי c. elegans

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

השימוש של סידן אינדיקטורים התעלתה ההבנה שלנו של דינמיקה עצבית ורגולציה. תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, עם מערכת העצבים לחלוטין ממופה, אנטומיה שקוף, מציג מודל אידיאלי להבנת הדינמיקה עצבית בזמן אמת באמצעות מחווני סידן. בשילוב עם טכנולוגיות microfluidic עיצובים ניסיוניים, מחקרים סידן-הדמיה באמצעות אינדיקטורים אלה מבוצעות בבעלי חיים חינם-המעבר והן לכוד. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים ניצול התקני לכידה, כגון השבב חוש הריח המתוארים Chronis. et al., יש התקנים שנועדו לשימוש ההרמפרודיט נפוץ יותר, כמו הזכר פחות נפוץ הוא שניהם מורפולוגית, מבחינה מבנית שונה. שבב חוש הריח מותאם היה מתוכנן, מפוברק ליעילות מוגברת בתחום ההדמיה עצביים זכר עם באמצעות בעלי חיים למבוגרים צעירים. פנייה סופחה התולעת בטעינת לנמל כדי לסובב את החיות, כדי לאפשר את ההפרדה של הנוירונים בודדים בתוך זוג הדו-צדדיים בתחום ההדמיה 2D. תולעים נחשפים זרימה מבוקרת של odorant בתוך המכשיר microfluidic, כמתואר במחקרים קודמים דו-מיניים. תופעות מעבר סידן ואז ניתוח שימוש בתוכנת קוד פתוח ImageJ. ההליך המתואר במסמך זה אמור לאפשר עבור כמות מוגברת של מבוססי זכר C. elegans סידן הדמיה מחקרים, העמקת ההבנה שלנו על מנגנוני איתות עצביים מין ספציפי.

ניתן לראות דוגמה של הגדרת התקן הכוללת איור 1A-B. איור 1A , מתאר את בניית מאגר תקין וההתקנה. איור 1B מציגה את החיבורים של המאגרים למכשיר microfluidic. איור 1C מתאר התקן microfluidic עם יציאות בודדות המסומנות על בהירות.
העיצוב של המכשיר הותאם זכר microfluidic מכיל עיקול בנמל הטעינה, אך זרימת dyna...

השימוש מותאם "צ'יפ חוש הריח" עבור ההדמיה סידן יעיל של C. elegans זכרים מתואר כאן. מחקרים של חשיפה זכר גליצרול פרומון מוצגים גם.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ללכוד ביעילות תמונה של חולפות סידן (calcium transience) בנוירוני הראש של זכרי C. elegans בעת חשיפה לפרומונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון הבנת הבקרה של מעגלים עצביים הספציפיים למין. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן כעת לצלם ביעילות זכרי C. elegans במכשיר מלכוד מיקרו-פלואידי.באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה הזו יתקשו בתחילה, כיוון שהעמסת בעלי חיים עשויה להיות מאתגרת ופרומונים ביוגניים אינם גורמים למעברים זמניים של סידן בכל בעל חיים. כדי להתחיל בהרכבת המאגרים, הכינו שלוש סדרות של צינורות על ידי החדרת מחט לקצה אחד וצינור מתכת לקצה השני. לאחר מכן, עבור כל מאגר, קחו שסתום luer בעל שלושה כיוונים וחברו אליו מזרק של 30 milliliter ללא הבוכנה, מזרק של שלושה milliliter ואת הצינורות.מלאו כל מאגר בבופר המתאים, או ב-S basal או ב-S basal המכיל fluorescin. לאחר מכן, הסירו בועות אוויר מהמאגר ומהצינוריות על ידי נקישה ושאיבה עם המזרק. כעת, מלאו מזרק חדש של 3 mL וצינורית ב-S basal והחדירו אותם לפתח היציאה של ההתקן המיקרו-פלואידי.הפעיל לחץ קל על המזרק עד שהבופר יופיע על פני חורי הכניסה. לאחר מכן, חבר את צינורות בקרת הזרימה, הבופר ומאגר הגירוי לחורי הכניסה המתאימים, תוך וידוא שטיפות נוזל נמצאות הן בחור נמל הטעינה והן בצינור המיועד לחיבור. כעת, הפעל לחץ קל נוסף על המזרק עד שטיפות יופיעו בכניסת נמל טעינת התולעים, ולאחר מכן הכנס פין חסימה מוצק לנמל זה.בשלב הבא, הוצא את המזרק מפתח היציאה וחבר קו יציאה המחובר למערכת הוואקום של המעבדה. כעת, בדוק את המכשיר לאיתור בועות בערוצי הציפה בזרם הווידאו מהמיקרוסקופ. לחץ על live כדי לצפות בתמונה חיה, והמתן עד שהבועיות יתפוגגו באופן טבעי לפני שתמשיך.לאחר מכן, הדליקו את מקור האור הפלואורסצנטי והשתמשו במסנן GFP כדי לאשר את דינמיקת הזרימה התקינה. הפעילו את שסתום התלת-גל (three wave valve) וצפו בזרם הבקרה הפלואורסצנטי המופיע בהזנה הווידאו כאשר השסתום פתוח. כדי להתחיל, העבירו תולעת אחת לצלחת אגר NGM ללא זריעה ואפשרו לתולעת לזחול הלאה.לאחר מכן, השטה את הצלחת ב-S basal. שאב את התמיסה המכילה את התולעת לתוך המזרק. כעת, במכשיר, כבה את הוואקום כדי להפסיק את הזרימה באמצעות שסתום הלור של היציאה.לאחר מכן, הסר את הפין המוצק החוסם את פתח טעינת התולעים. הכנס את הפתיל המכיל תולעים אל פתח הטעינה. פתח את שסתום ה-luer של היציאה ועקוב אחר שידור הווידאו בשידור חי.כעת, הפעל לחץ עדין על המזרק עד להופעת התולעת. משוך את התולעת חזרה אם היא נכנסת קודם כל בזנבה; היא חייבת להיכנס קודם כל בראשה כדי להיות חשופה לגירוי. על המשתמש למשוך את התולעת חזרה לפני שהזנב נכנס במלואו לתעלה, אחרת, הוצאת התולעת מהתעלה היא קשה ביותר ובדרך כלל דורשת שטיפה מלאה של התולעת דרך התעלה והטענה של תולעת חדשה.כעת, באמצעות הפעלת לחץ מהמזרק, הניעו את התולעת דרך התעלה ומקמו את ראשה כך שיהיה חשוף לזרימת הבאפר, אך לא עמוק מדי בתוך התעלה, כדי שלא תוכל לנוע בחופשיות. תנועה קטנה, אקסאלית או סיבובית, צפויה בבעלי חיים שאינם משותקים. עם זאת, הוספת חומר משתק לבאפרים מבטלת כמעט לחלוטין אפקט זה.כדי להפחית את הסבירות לתנועה במהלך הניסוי, השתמשו בזכרים מבוגרים יותר אשר נלכדים ביעילות רבה יותר, הפחיתו את הרוחב או העובי של פתח טעינת התולעים או הגדילו את משך הזמן שהם שוהים בחומר המשתק. השתמשו בתוכנה כדי לבצע הקלטות באמצעות עירור באור כחול. הגדירו את זמן החשיפה ל-100 milliseconds, פתחו את חלון רכישת התמונות, הגדירו את נקודות הזמן ל-300 עם מרווח של אפס, ולאחר מכן התחילו את רכישת התמונות.לאחר חמש שניות, יש להפעיל את הגירוי על ידי שינוי השסתום התלת-דרכי השולט בתמיסות הבופר. גירוי למשך 10 שניות מהווה נקודת התחלה טובה, וניתן להתאים את משך הגירוי לפי הצורך. לאחר הגירוי, החזירו את זרימה על ידי לחיצה חוזרת על הכפתור והמשיכו בהקלטה עד לסיום סרטון הווידאו בן ה-30 שניות.פעולה זו מאפשרת לפלואורסצנציית ה-g camp לחזור לקו הבסיס. כעת, יש להניח להכנה לנוח במשך 30 שניות לפני הניסוי הבא. תולעים המבטאות g camp three בנוירון ה-nosocceptive, ASH, מגיבות ל-1 M glycerol בשינויים נראים לעין בפלואורסצנציה בתוך נוירון ה-ASH, המעידים על פעילות עצבית.הנוירון צריך להישאר באזור הניתוח לאורך כל הסרטון, אחרת עלול להיווצר ארטיפקט של תנועה. במקרה כזה, העבירו את אזור הניתוח עבור אותן נקודות זמן ומזגו את ערכי העוצמה כדי ליצור עקבה אחת. בזכרים שעוברו בגירוי באמצעות הפרומון הביוגני המושך ascaroside three במהלך החשיפה, נמדדו תנודות סידן בארבעת נוירוני ה-CEM.מבעל חי אחד למשנהו ומנוירון לנוירון, העקבות השתנו בצורתם, בסימנם ובגודלם. לפיכך, חשוב מאוד לנתח מספר רב של בעלי חיים בעת חקר תגובות לפרומונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו טוענים זכר של C elegans לתוך התקן מיקרו-פלואידי ומנתחים תנודתיות של סידן בנוירוני הראש.ניתן להשתמש בתהליך זה גם עם הרמפרודיטים, כדי לזהות הבדלים ספציפיים למין בתגובות עצביות. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בחצי שעה עבור החיה הראשונה שצולמה. לאחר ההקלטה הראשונה, ניתן להטעין ולצלם חיה חדשה תוך כ-10 דקות.בעקבות הליך זה, ניתן לשלב שיטות אחרות, כגון אופטוגנטיקה, עם פרוטוקול זה על מנת להבין טוב יותר כיצד מוסברים מעגלים עצביים.

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

מאמר זה מציג את הפרוטוקולים של אותות אופטיים flavoproteins מהותי autofluorescence הדמיה אותות ריח עורר פעילויות המפה על פני השטח של הנורה חוש הריח אצל עכברים.

פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence

מכשיר microfluidic פשוט פותח כדי לבצע הרדמה...

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

כאן אנו מתארים readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך...

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

כלים חדשים למחקר mechanobiology יש צורך להבין כיצד מכאניים מפעילה מסלולים ביוכימיים, מעורר תגובות ביולוגיות. כאן, אנחנו ראווה שיטה חדשה עבור סלקטיבית גירוי מכני של חיות קיבוע עם מלכודת microfluidic ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר.

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה קובע שיטות לחילוץ וכימות תגובות לפרומון המין הנדיף ב- C. elegans, ומספק כלים לחקר תקשורת כימית ומסלול ניווט.

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר הדמיית דולג זמן מבוססת מיקרופלואידית על פני כל ההתפתחות הפוסט-עוברית.

הדמיה ברזולוציה גבוהה של C. elegans בכל שלבי הזחל

חקור הדמיית סידן בנוירוני ראש של זכר C. elegans בתגובה לפרומונים באמצעות שבב חוש הריח המותאם למיקרו-זרימה. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של רגולציה מינית במעגלים עצביים.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

גלה סרטונים נוספים