באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

המטרה הכוללת של הליך זה היא ללכוד ביעילות ארעיות סידן בתמונה בתאי עצב ראש זכריים של C.Elegans בעת חשיפה לפרומונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון הבנת ויסות מעגלים עצביים ספציפיים למין. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שכעת ניתן לצלם C.Elegans זכרים ביעילות במכשיר מלכודת מיקרו-נוזלי.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהעמסת בעלי חיים יכולה להיות קשה בהתחלה ופרומונים ביוגניים אינם מעוררים ארעיות סידן בכל בעל חיים. כדי להתחיל בהרכבת המאגרים, הכינו שלוש סטים של צינורות על ידי הכנסת מחט לקצה אחד וצינור מתכת לקצה השני. לאחר מכן, עבור כל מאגר, קח שסתום לואר תלת-כיווני וחבר מזרק של 30 מיליליטר כשהבוכנה שלו הוסרה, מזרק של שלושה מיליליטר והצינור.

מלאו כל מאגר במאגר המתאים, גירוי S בסיסי או S בזאלי המכיל פלואורסקין. לאחר מכן, הסר את כל בועות האוויר הן מהמאגר והן מהצינור, על ידי לחיצה ושאיבה של המזרק. כעת, מלאו מזרק וצינור חדשים של שלושה מיליליטר ב-S בזאלי והכניסו ליציאת היציאה של המכשיר המיקרו-נוזלי.

הפעל בעדינות מעט לחץ על המזרק עד שהחיץ יופיע על פני חורי הכניסה. לאחר מכן, חבר את צינורות בקרת הזרימה, החיץ ומאגר הגירוי לחורי הכניסה המתאימים להם, וודא שטיפות נוזל נמצאות הן על חור יציאת הטעינה והן על הצינור שיש לחבר. כעת, הפעל בעדינות עוד קצת לחץ על המזרק עד שיופיעו טיפות בכניסת יציאת טעינת התולעת, ולאחר מכן הכנס סיכת חסימה מוצקה לפתח זה.

לאחר מכן, הסר את המזרק מיציאת היציאה והצמד קו יציאה המחובר לבית הוואקום. כעת, בדוק את המכשיר לאיתור בועות בתעלות הציפה בהזנת הווידאו מהמיקרוסקופ. לחץ על שידור חי, כדי לצפות בתמונה החיה והמתין עד שהבועות יתפזרו באופן טבעי לפני שתמשיך.

לאחר מכן, הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי והשתמש במסנן GFP כדי לאשר דינמיקת זרימה תקינה. הפעל את שסתום שלושת הגלים וצפה בזרם הבקרה הפלואורסצנטי המופיע בהזנת הווידאו, כאשר השסתום פתוח. כדי להתחיל, בחרו תולעת אחת על צלחת אגר NGM לא זרועה ואפשרו לתולעת לזחול משם.

לאחר מכן, צף את הצלחת עם S בזאלי. צייר תמיסה המכילה את התולעת לתוך המזרק. כעת, במכשיר, כבה את הוואקום כדי לעצור את הזרימה באמצעות שסתום היציאה.

לאחר מכן, הסר את הסיכה המוצקה החוסמת את יציאת טעינת התולעת. הכנס את הצינור המכיל תולעים לפתח הטעינה. פתח את שסתום היציאה וצפה בהזנת הווידאו החי.

כעת, הפעל לחץ עדין על המזרק עד להופעת התולעת. משוך את התולעת לאחור אם היא נכנסת ראשונה לזנב, היא חייבת להיכנס תחילה לראש כדי להיחשף לגירוי. על המשתמש למשוך את התולעת לאחור לפני שהזנב נכנס במלואו לתעלה, אחרת, הוצאת התולעת מהתעלה היא קשה ביותר ובדרך כלל דורשת שטיפת התולעת לחלוטין דרך התעלה והעמסת תולעת חדשה.

כעת, באמצעות לחץ מהמזרק, קדמו את התולעת דרך התעלה ומקמו את ראש התולעת, כך שהיא תהיה חשופה לזרם החיץ אך לא כל כך רחוק לתוך התעלה, כך שהיא תהיה חופשית לנוע. כמות קטנה של תנועה צירית או סיבובית צפויה בבעלי חיים שאינם משותקים. למרות שהוספת משותק למאגרים כמעט מבטלת את האפקט הזה.

כדי להפחית את הסבירות לתנועה במהלך הניסוי, השתמש בזכרים מבוגרים שנלכדים ביעילות רבה יותר, הקטנת הרוחב או העובי של פתח העמסת התולעת או הגדלת משך הזמן בשיתוק. השתמש בתוכנה כדי לבצע הקלטות באמצעות עירור אור כחול. הגדר את החשיפה ל-100 אלפיות השנייה, פתח את חלון רכישת התמונה, הגדר את נקודות הזמן ל-300 עם מרווח באפס, ולאחר מכן התחל ברכישת התמונה.

לאחר חמש שניות, הפעל את הגירוי על ידי החלפת השסתום התלת-כיווני השולט על המאגרים. גירוי של 10 שניות הוא נקודת התחלה טובה וניתן להתאים את אורך הגירוי לפי הצורך. לאחר הגירוי, החזר את הזרימה על ידי לחיצה נוספת על הכפתור והמשך להקליט עד להשלמת הסרטון בן 30 השניות.

זה מאפשר לפלואורסצנטיות g camp לחזור לקו הבסיס. כעת, תנו להכנה לנוח 30 שניות לפני הניסיון הבא. תולעים המבטאות g camp 3 בנוירון הלא רגיש, ASH, מגיבות לגליצרול מולארי אחד עם שינויים גלויים בפלואורסצנטיות בתוך נוירון ה-ASH, המעידים על פעילות עצבית.

הנוירון צריך להישאר באזור הניתוח במשך כל הסרטון, אחרת עלול להיווצר חפץ תנועה. אם כן, הזז את אזור הניתוח עבור נקודות זמן אלה ומזג את ערכי העוצמה כדי ליצור עקבה יחידה. זכרים שמגורים עם הפרומון הביוגני האטרקטיבי אסקרוסיד שלוש במהלך החשיפה, ארעיות הסידן נמדדה בארבעת נוירוני ה-CEM.

מבעל חיים לחיה ונוירון לנוירון, העקבות השתנו בצורה, בסימן ובגודל. לכן, חשוב מאוד לנתח חיות רבות כאשר חוקרים תגובות פרומונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעמיס C elegans זכר למכשיר מיקרו-נוזלי ולנתח את חולף הסידן בנוירוני הראש.

ניתן להשתמש באותו תהליך עם הרמפרודיטים, כדי לזהות הבדלים ספציפיים בתגובות עצביות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חצי שעה עבור החיה הראשונה שצולמה. לאחר ההקלטה הראשונה, ניתן לטעון חיה חדשה בתמונה תוך כ-10 דקות.

בעקבות הליך זה, ניתן לשלב שיטות אחרות כמו אופטוגנטיקה עם פרוטוקול זה על מנת להבין עוד יותר כיצד מווסתים מעגלים עצביים.