לייזר דופלר: כלי למדידת הלבלב איון Microvascular Vasomotion In Vivo

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את המצב התפקודי של תנועת כלי הדם המיקרווסקולריים (vasomotion) באי islets של הלבלב in vivo, על מנת להעריך את השפעתה על מחלות קשורות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הסירקולציה הרפואית, כגון האם תנועת כלי הדם המיקרווסקולריים באי islets של הלבלב משתנה במצב פתולוגי. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הדגמנו כי קיימת סירקולציה מכנית תפקודית שהתפתחה במהלך התפתחותה של סוכרת.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להעריך את המצב התפקודי של תנועת כלי דם (vasomotion) מיקרו-וסקולרית ברקמות ואיברים, הן במסגרת קלינית והן בתנאי מעבדה. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מחלות הקשורות לאיי הלבלב. ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות, כגון מחלות מיקרו-וסקולריות הקשורות לכליות ולרשתית.

היישומים של טכניקה זו מתרחבים גם להבנת טבען של המגמות במצב התפקודי של תנועת כלי דם מיקרו-וסקולריים (vasomotion). באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשרו, שכן במהלך הניסויים נגזרים כמויות עצומות של נתונים אקדמיים מיקרו-וסקולריים באמצעות לייזר דופלר. יש לוודא כי הדגמה של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שגורמים רבים עלולים להשפיע לרעה על איסוף מדויק של נתוני מיקרו-סירקולציה.

פרוטוקול זה מתחיל במתן הזרקה יומית של STZ לעכברים במשך חמישה ימים רצופים. המיסו את ה-STZ בבופר נתרב Citrate לריכוז עבודה של 5 mg/mL. לאחר מכן, המתינו את ההזרקות תוך-בטנית באמצעות מזרק של 1 mL ומחט במידה 25 gauge.

על העכברים לצום במשך ארבע שעות לפני ההזרקה, אך אין להסיר את הגישה למים. יש להזריק לעכברי הביקורת את אותו נפח של תמיפת סודה של נתרן ציטראט (sodium citrate buffer) טהורה. לאחר ההזרקות, יש לספק לעכברים מזון רגיל ומים עם 10% sucrose.

לאחר היום החמישי של הזרקת STZ, החליפו את מי הסוכרוז בריכוז 10% במים רגילים. תשעה ימים לאחר מכן, בדקו את רמת הגלוקוז בדם. ראשית, השאיבו את העכברים למשך שש שעות עם גישה חופשית למים.

לאחר מכן, קחו דם מוורידי הזנב שלהם והשתמשו במד סוכר ידני סטנדרטי כדי למדוד את רמת הסוכר בדם. הגדירו עכברים עם רמות גלוקוז בדם מעל 200 milligrams per deciliter כסוכרתיים. לפני השימוש במכשיר הלייזר דופלר, נקו תחילה את המשטחים האופטיים של קצה הגשש ומחבר הגשש בעזרת מטלית רכה שאינה שוחקת, ולאחר מכן חברו את הכבל ליציאה של המכשיר.

בשלב הבא, הרכיבו את מעמד הכיול. ראשית, הניחו לתקן השבץ (flux standard) המאוחסן להגיע לטמפרטורת החדר. תהליך זה אורך כחצי שעה.

לאחר מכן, נערו בעדינות את תמיסת הסטנדרט של השבץ למשך 10 שניות והניחו לה לנוח על בסיס הכיול למשך שתי דקות. בשלב הבא, הרימו את התפס גבוה ככל האפשר והדקו את האטב לתוכו. כעת, טבלו לאט את האטב לתוך תמיסת הסטנדרט של השבץ וקבעו אותו באמצעות מחזיקי האטבים.

כדי להמשיך, העמידו את תאורת החדר על עוצמה נמוכה ולחצו על כיול (calibration) במכשיר הלייזר דופלר. כעת בחרו את ערוץ העבודה שאליו מחוברת הפרובה והפעילו את תוכנית הכיול. מקמו עכבר הרדום בתנוחה גבנית (supine) על פלטפורמת עבודה וקבעו אותו באמצעות סרט הדבקה כירורגי.

בשלב הבא, סטריליזציה של עור הבטן בעזרת 75%ethanol מאזור הצוואר ועד הזנב, ולאחר מכן כיסוי פרימטרי של האזור בעזרת ספוג גזה יבש עם חור במרכז ברוחב שלושה סנטימטרים. לאחר מכן, הרם את עור הבטן באמצעות פינצטה ובצע חתך אנכי ראשוני לאורך קו האמצע של הבטן בעזרת סקאלפל או מספרי עור. לאחר מכן, אחוז את השריר שמתחת לעור באמצעות פינצטה ובצע חתך כדי להיכנס לחלל הבטן.

אין לפגוע באיברים כלשהם. כדי לחשוף את חלל הבטן, קפלו את העור ואת השרירים שמתחתיו מעל החזה, ולאחר מכן חשפו בעדינות את גוף הלבלב ואת הטחול באמצעות פינצטה בעלת קצה קהה. כעת, בתוכנת הבקרה של מכשיר הלייזר דופלר, צרו קובץ מדידה חדש, ולאחר מכן הגדירו את המסכים המחוברים.

בלשונית הכללי (general), הגדירו את משך הניטור כהרצה חופשית (free run) והשתמשו בברירת המחדל של היצרן בלשונית ניטור ה-LDF. לאחר מכן, פתחו את תיבת הדו-שיח להגדרת התצוגה ובחרו בערוצים המתאימים. לאחר מכן, הגדירו את הפרמטרים הבאים: מקור הנתונים עבור הערוץ והתווית, יחידות מידה וצבע, ואז לחצו על הבא (next).

בשלב הבא, הזינו את פרטי הזיהוי של הנבדק והמדידה בתיבת הדו-שיח של מידע הקובץ והמשיכו על ידי לחיצה נוספת על כפתור הבא. כעת, התצורה הושלמה וחלון מדידה יקפוץ על המסך. לאחר מכן, הניעו ידנית את האלקטרודה עד למרחק של מילימטר אחד מהלבלב.

דיוק המדידה תלוי במרחק שבין הגשושית לבין רקמת אירי הלבלב. קריאת זרימת הדם לא תהיה מדויקת אלא אם כן יישמר בקפידה מרווח של מילימטר אחד בין הרקמות לבין הגשושית. כדי להתחיל את ההקלטה, לחצו על סמל ההפעלה (start) ונתוני ה-PU של זרימת הדם המיקרו-וסקולרית יתחילו להישמר.

בצעו זאת למשך דקה מלאה, והשתמשו בכפתורי התצוגה של דחיסה והרחבה ובכפתורי הגדלה או הקטנה של גובה עקבי הגרף כדי להתאים את האפקט המוצג במהלך ההקלטה, ולאחר מכן הפסיקו את ההקלטה. כעת, שמרו את הקובץ בשם מתאים. לאחר מכן, reposition את הגשושית באופן ידני כדי למנוע השפעות מצטברות ודלילות מקומית של יכולת הכיווץ וההרפיה.

בסך הכל, אספו נתוני PU משלוש נקודות אקראיות בלבלב עבור כל עכבר. בשלב מסוים במהלך הניסוי, מדדו נתוני PU מלוח שאינו מחזיר אור כדי לקבל ערך בקרה בסיסי. לאחר ביצוע שלוש המדידות, השתמשו בתפרי 3-0 לסגירת שכבות השריר ולאחר מכן בתפרי 4-0 לסגירת שכבת העור.

כעת יש לעקוב אחר העכבר בכלוב התאוששות עד אשר יהיה מוכן להעברה לכלוב בית נקי. באופן כללי, מצב המיקרוסירקולציה של האיים הלבלביים בא לידי ביטוי בשלבים מחזוריים של כיווץ והרפיה. התופעות ההמודינמיות הכוללות יוצרות תבנית של פרפוזיית זרימת דם.

באמצעות מכשיר הלייזר דופלר, נאספו נתוני PU כדי להראות את דפוס ההפצה של פרפוזיית דם מיקרו-וסקולרית בעכברים לא סוכרתיים וסוכרתיים. התוצאות היו שונות לחלוטין. קצב ההתכווצויות וההרפיות של התנועה הכלית (vasomotion) המיקרו-וסקולרית של אירי הלבלב היה כאוטי ולא סדיר בעכברים סוכרתיים שהושרה על ידי STZ, בעוד שבעקובים לא סוכרתיים נצפו תנודות קצביות.

בשלב הבא, התנועה של כלי הדם (vasomotion) כומתה באמצעות פרופילי PU. בהשוואה לקבוצות הביקורת, פרפוזיית הדם הממוצעת של מיקרו-סירקולציית איורי הלבלב הייתה מופחתת בעכברים עם סוכרת שחוללה על ידי STZ. עכברים אלו הראו גם ירידות משמעותיות באמפליטודה ובתדירות של תנועה זו, וכן במהירות היחסית של פרפוזיית הדם לאיורי הלבלב.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה תוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לוודא שהמרחק בין הפרובה לרקמת הלבלב הוא פחות ממילימטר אחד. מרחק לא מתאים יגרום לקריאת זרימת דם מוגברת או מופחתת באופן מלאכותי.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון laser speckle וחמצן המעתיק (translocating oxygen), כדי לענות על שאלות נוספות כמו ויזואליזציה של איסכמיה, הערכת זרימת דם והערכת המצב התפקודי של תנועות כלי דם מיקרווסקולריים (microvascular vasomotion). לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים וקליניקאים בתחום האנדוקרינולוגיה והמטבוליזם לחקור את מנגנוני המיקרו-סירקולציה החבויים מאחורי מחלות הקשורות לאיי הלבלב. זכרו כי עבודה עם מכשיר לייזר עלולה להיות מסוכנת ביותר בשל חשיפה לקרינה, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע פרוצדורה זו, כגון שמירה על מרחק של לפחות 200 millimeter מהעין.