Name: בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: למד פרוטוקול האכלה בשומן גבוה ומדידת triacylglyceride ב-Drosophila melanogaster לחקר השמנה וליפוטוקסיות. שיטה זו מאפשרת אבחון מהיר של מחלות מטבוליות וגילוי תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות אריקה טיילור עבור עריכת כתב היד הזה. עבודה זו מומן על ידי מענקים של מכוני הבריאות הלאומיים (P01 HL098053, P01 AG033561 ו- R01 HL054732) כדי R.B., תוספת מחקר פוסט דוקטורט (R01 HL085481), מלגת (AAUW) S.B.D., מענקים של איגוד הלב האמריקני S.B.D. ואני חוזר לבסיס

1. HFD האכלה פרוטוקול <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> טבלה 1. מתכון אוכל לעוף. 
טבלה זו מסכמת החומרים השונים המשמשים להכנת לשליטתנו מזון. לאחר ביצוע, 10 מ של המזון הוא נשפך לתוך מבחנות, מקורר ומאוחסנים ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך-
<ol><li>HFD הכנה <ol><li>להכין 1 ק ג של מזון שמן גבוהה, שוקל 700 גר' מוכנות מראש אוכל לטוס רגיל (ראה טבלה 1) ו- 300 גרם שמן קוקוס לתוך שני מיכלים נפרדים באמצעות איזון האנליטי.</li>
		<li>חום לכל מכולה בנפרד במיקרוגל, עד התוכן נמס לחלוטין. שופכים שמן קוקוס לתוך המיכל אוכל לעוף. מערבבים בעזרת מקצף עד טוב לערבב את השמן לתוך האוכל לעוף. 
		הערה: אין גושים של מזון או שמן צריך להיות גלוי. כאשר האוכל לטוס נמס במיקרוגל, להפסיק במרווחים של 1 דקות לערבב את האוכל ולמנוע גולש.</li>
		<li>לשקול מחדש את האוכל שומן גבוהה. אם המשקל הכולל פחות מ 1 ק ג (700 גרם מזון + 300 גרם שמן קוקוס), להוסיף מים (כ- 10 מ"ל) כדי לפצות על אידוי בזמן חימום, כדי להחזיר את המשקל 1 ק</li>
		<li>Pour מעורבב היטב 10 מ"ל מזון שמן גבוהה לכל מבחנה (בסביבות 25% נפח המבחנה). בשלב הבא, לכסות עם גזה כדי למנוע זבובים &#39; זיהום. מגניב לשעה בטמפרטורת החדר ואז להעביר את הבקבוקונים עד 4 ° C עבור אחסון עד כדי 4 שבועות. 
		הערה: האוכל הרגיל (NF) משמש כמזון שליטה. גם למזוג 10 מ"ל (בסביבות 25% נפח המבחנה) של NF לכל מבחנה. על האוכל HFD להחליף 30% של האוכל NF שמן קוקוס. עבור פקד ותנאים ניסיוני, הזבובים קיבלו את אותה כמות של NF ו- HFD (10 מ"ל של מזון לכל מבחנה).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> איור 1 . HFD האכלה דרוזופילה. 
ערכת מראה את השלבים האכלה שונים עבור זבובים על בקרת מזון (תזונה נורמלית ללא תוספת של שמן קוקוס-NF) או HFD (עם התוספת של שמן קוקוס). התהליך כולו לוקח 10 ימים אחרי האוסף הראשונית של הזבוב הבוגר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"> <li>HFD האכלה של melanogaster ד הערה: פרוטוקול זה כולל שליטה ואוכל HFD האכלה נהלים התואמים כל קו לעוף. שליטה וזבובים ניסיוני שמים בקבוקונים המכילים את אותו כמות האוכל (NF או HFD).
	<ol><li>שימוש CO 2 כדי עזים ומתנגד הזבובים. 
		הערה: עבור ינוקות, אנא קרא הפניה 21 למבט כולל על גידול וטיפול melanogaster ד.</li>
		<li>לאסוף 0-5 בנות יום זבובים בקבוקונים והעברה (על-ידי היפוך) הזבובים לתוך מבחנות החדש שמכילות את NF (חימם בעבר בטמפרטורת החדר). תן לעידן זבובים במשך 5 ימים נוספים-21 מעלות צלזיוס</li>
		<li>בסוף 5 הימים, להוציא את הבקבוקונים המכיל HFD NF מ- 4 מעלות צלזיוס 
		הערה: כמו זבובים חיים, מתח יכול הטמפרטורות הקרות. תן את הבקבוקונים לשבת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר להתחמם לפני השימוש.</li>
		<li>באמצעות מגבונים לחים, לנקות ולהסיר עודפי הנוזלים מן הצדדים של הבקבוקונים.</li>
		<li>הוסף פיסת נייר סינון, קטנה על 1 ס מ x 3 ס"מ, לתוך האוכל השמן גבוהה כדי לספוג את הנוזל העודף. 
		הערה: שלב זה הוא קריטי עבור מניעת הזבובים נדבקות האוכל HFD.</li>
		<li>הבא, העברת הזבובים על האוכל השמן גבוהה (על-ידי היפוך). להניח את הבקבוקונים אופקית בצד שלהם, (לא עומדת) ב 21-22 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים. 
		הערה: להימנע טמפרטורות גבוהות יותר כמו זה באופן חלקי ממיסים האוכל השמן גבוהה, גורם הזבובים לדבוק המזון ולמות.</li>
		<li>לאחר 5 ימים, העברה (על-ידי היפוך) הזבובים מן NF ו- HFD לתוך בקבוקונים חדשים ללא מזון כדי לאפשר את המעיים שלהם ריק במשך 30 דקות. בשלב הבא, להמשיך שקילה הזבובים. 
		הערה: אחד הצעדים הקריטיים ב הזה HFD האכלה פרוטוקול היא להכין HFD מעורבב היטב, ללא כל נתחי אוכל לעוף או שמן מרוכז. ערבוב הומוגנית וקירור של HFD עד 45-30 ° C, מומלץ, לפני לשפוך לתוך מבחנות ואחסון של האוכל-4 מעלות צלזיוס. לגיל המתאים ההתאמה של שליטה וזבובים ניסיוני חשוב כמו גם תנאים מבוקרים תזונתיים וסביבתיים פריור להאכיל HFD. במהלך שלב האכלה, שליטה וזבובים ניסיוני יש להעניק את אותה כמות של NF ו- HFD. אף פעם לא לאסוף זבובים בקבוקונים צפוף או בקבוקים (כדי למנוע תופעות transgenerational). תמיד שמים מקסימלית של 25 זבובים לכל מבחנה במהלך NF ו- HFD האכלה כדי למנוע הגבלות תזונתיות או אפקטים המתגודדים אחרים. HFD מורכב של שמן קוקוס 30%, ולכן טמפרטורות מעל 22 ° C עלול להמיס חלקית HFD, גורם הזבובים מקל על מזון שומני, מתים. לפני שאת מורחת את הזבובים HFD, לנקות את הבקבוקונים כדי להסיר את כל מזוט ולהוסיף נייר סינון כדי לספוג את כל הנוזלים העודפים במזון. במהלך הדגירה של הזבובים על HFD, הבקבוקונים שכוב על צדם לספק משטח אופקי ללא שומן הזבובים.</li>
	</ol></li> <li>במשקל של הזבובים <ol><li>עבור כל גנוטיפ ומגדר להיבדק, להשתמש של סולם לאולטרה רגישות כדי לתעד את המשקולות של mL 1.7 מראש שכותרתו וריקה צינורות.</li>
		<li>באמצעות הרדמה לעוף או CO 2, עזים ומתנגד לאסוף זבובים 36 של גנוטיפ באותה, מגדר, ואת האכלה מצב עם מברשת לתוך אחד מראש שקל 1.7 צינור mL-</li>
		<li>שוקל את הצינור המכיל זבובים עם אותו סולם לאולטרה רגישות.</li>
		<li>לקבוע את המשקל הממוצע לטוס בעקבות נוסחה זו: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> הערה: המספר של זבובים פרוטוקול זה הוא 36.</li>
		<li>פלאש להקפיא את הצינורות 1.7 mL המכילה זבובים על-ידי צולל לתוך חנקן נוזלי עבור 2 דק לאסוף ולשים הצינורות לתיבות. בשלב הבא, להעביר את התיבות-80 מעלות (עדיף טמפרטורה) לאחסון עד לשימוש עם תג וזמינותו. 
		זהירות: חנקן נוזלי היא בטמפרטורה נמוכה ביותר. נא להשתמש ציוד מגן אישי המתאים.</li>
	</ol></li></ol> 2. Assay תגים <ol><li>הכנת ריכוז רגיל תג <ol><li>להכין 500 מ"ל של PBT (PBS 1 X, 0.05% טריטון).</li>
		<li>באמצעות צינורות 0.5 mL, הפתרון תג (טבלה של חומרים), להכין µL 100 של ריק (PBT בלבד) ו- µL 100 של שישה ריכוזים תג רגיל (2 µg/µL µg 1/µL 0.5 µg/µL; 0.25 µg/µL; 0.125 µg/µL; 0.0625 µg/µL) עם PBT-</li>
		<li>במקום הצינורות על קרח ולהמשיך עם טחינת הזבובים.</li>
	</ol></li> <li>טחינת הזבובים <ol><li>להוציא את הזבובים קפוא מ-80 מעלות צלזיוס (שלב 1.3). העברת הצינורות המכילים הזבוב על קרח</li>
		<li>ראשון, מקום 2 מ מ מתכת טחינת כדורים לתוך מתקן כדור 96-ובכן, להשתמש במברשת קטנה להסיר את הביצים נוספת.</li>
		<li>מקום 96-ובכן שהטחינה צלחת הפוכה מעל הכדור dispenser ו הפוך כדי להעביר את הכדורים מתכת ישירות לתוך הלוח שחיקה. צריך להיות כדור אחד לכל טוב.</li>
		<li>בעזרת פיפטה של רב ערוצית, להוסיף µL 600 של PBT לתוך כל שורה של צלחת שחיקה 96-ובכן.</li>
		<li>עם מלקחיים, להוסיף 3 זבובים לכל טוב. ציין את התנאי גנוטיפ, מין ואוכל של הזבובים בכל שורה/היטב של צלחת שחיקה 96-ובכן.</li>
		<li>מקום בחוזקה את הפקקים לצלחת שחיקה 96-ובכן. הקלטת יוטלו על העליונה כדי לוודא שאין זליגת.</li>
		<li>כראוי למקם את הצלחות שחיקה של 96-ובכן לתוך המכונה שחיקה. הגדר את המכונה המהירות הגבוהה ביותר ואת העיתונות &#34; לרוץ &#34; לטחון עם אמו והוריה מינימום 3</li>
		<li>לאחר 3 דקות, תפסיק לשפשף את ולהמשיך עם צלחת צנטריפוגה: centrifuג ' נרל אלקטריק למשך 15 דקות ב g x 4,000, 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, לנהל את הצלחת שחיקה בקפידה כדי למנוע ערבוב את תגובת שיקוע עם בגדר.</li>
	</ol></li> <li>טעינה הדגימה ונחישות תוכן תג <ol><li>לקחת צלחת 96-ובכן ספקטרופוטומטרים חדש. באמצעות פיפטה של רב ערוצית, לטעון µL 200 מהתרכובת תג לתוך כל שורה של הצלחת-</li>
		<li>µL 20 עומס של PBT לתוך הבאר הראשונה של השורה הראשונה, כדי ליצור ריק. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>טען 20 µL של כל דילול סטנדרטי (מתוך שלב 2.1.2) לתוך הנותרים הבארות הראשונים בשורה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של רב ערוצית, להעביר µL 20 של תגובת שיקוע מכל שורה של צלחת שחיקה על השורה המתאימה בצלחת ספקטרופוטומטרים 96-ובכן. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>הבא, הצב תשובה מכשילה גז-חדיר מעל החלק העליון של הלוח 96-ובכן.</li>
		<li>דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות 
		הערה: אם יש בועות הבארות, centrifuge את הצלחת למשך 2 דקות ב 2,000 g x כדי להסיר את כל הבועות. הנוכחות של בועות יפריעו הקריאה ספיגת.</li>
		<li>קרא ספיגת של כל טוב של הצלחת ב 550 ננומטר שימוש בקורא תואם microplate. בשלב הבא, לאתר את עקומת סטנדרטי ולקבוע את הריכוז [µg µL] של הדגימות לא ידוע.</li>
		<li>לקביעת כמות התוכן תג לאדם רשע במשקל זבוב, להשתמש בנוסחה הבאה: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> הערה: ב פרוטוקול זה, היו 3 זבובים טחון ב- 600 µL של PBT; וכתוצאה מכך האחסון מתכוון לכל זבוב הוא 200 µL.</li>
	</ol></li> <li>Assay ברדפורד, נורמליזציה של תוכן תג עם תכולת החלבון <ol><li>להכין 7 µL 100 של אלבומין שור (BSA) דילולים סטנדרטי (75 µg/mL µg 100/mL; µg 150/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1,000 µg/mL) עם PBT-</li>
		<li>לקחת צלחת חדשה 96-ובכן, לטעון µL 200 של ריאגנט ברדפורד X 1 לתוך כל שורה של הצלחת-</li>
		<li>, הבאר הראשונה של השורה הראשונה, להוסיף 10 µL של PBT כדי ליצור ריק. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		בארות <li>להוסיף 10 µL של כל דילול סטנדרטי לתוך שאר הראשונים בשורה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של רב ערוצית, להעביר µL 10 של הזבוב supernatant מכל שורה של צלחת שחיקה אל השורה המתאימה בצלחת 96-ובכן. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. למנוע יצירת בועות.</li>
		<li>הצב תשובה מכשילה גז-חדיר מעל החלק העליון של הלוח 96-ובכן.</li>
		<li>דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. אם יש בועות הבארות, centrifuge את הצלחת למשך 2 דקות ב 2,000 g x כדי להסיר אותם. 
		הערה: הנוכחות של בועות יפריעו הקריאה ספיגת.</li>
		<li>שימוש ספקטרופוטומטרים כדי לקרוא ספיגת של הריק, תקנים ודוגמאות לא ידוע-595 nm. להשתמש העקומה הסטנדרטי לקביעת הריכוזים [µg µL] של הדגימות בכל שורה.</li>
		<li>לנרמל את התג תוכן עם רמת חלבון באמצעות הנוסחה הבאה: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol><li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li>
<li>Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm">https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm</a> (2015).</li>
<li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+development+in+Drosophila+and+its+relationship+to+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates.</a> Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+melanogaster+to+map+human+cancer+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways.</a> Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).</li>
<li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).</li>
<li>Levine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+sequences+homologous+to+a+protein+coding+region+conserved+between+homeotic+genes+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila.</a> Cell. 38, 667-673 (1984).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li>
<li>Noyes, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expression+of+the+Drosophila+adipokinetic+hormone+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene.</a> Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).</li>
<li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+flies+and+men%3A+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biol. 11, 38(2013).</li>
<li>Rulifson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1120 (2002).</li>
<li>Birse, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat-diet-induced+obesity+and+heart+dysfunction+are+regulated+by+the+TOR+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila.</a> Cell Metab. 12, 533-544 (2010).</li>
<li>Musselman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-sugar+diet+produces+obesity+and+insulin+resistance+in+wild-type+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Models+Mech%22%5BJournal%5D)">A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila.</a> Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).</li>
<li>Diop, S. B., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+Insights+into+Diabetic+Cardiomyopathy+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila.</a> Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).</li>
<li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Obesity-Linked+Gene+Nudt3+Drosophila+Homolog+Aps+Is+Associated+With+Insulin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling.</a> Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).</li>
<li>Morris, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).</li>
<li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li>
<li>Erkkila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%3A+an+epidemiological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach.</a> Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).</li>
<li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+feeding+results+in+gender+specific+steatohepatitis+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation.</a> World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).</li>
<li>Wang, C. Y., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Mathews, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+Dimorphism+of+Body+Size+Is+Controlled+by+Dosage+of+the+X-Chromosomal+Gene+Myc+and+by+the+Sex-Determining+Gene+tra+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila.</a> Genetics. 205, 1215-1228 (2017).</li>
<li>Golay, A., Bobbioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dietary+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">The role of dietary fat in obesity.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).</li>
<li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1%2FSpargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Rep. 10, 1-13 (2015).</li>
<li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).</li>
<li>Palanker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+HNF4+regulates+lipid+mobilization+and+beta-oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation.</a> Cell Metab. 9, 228-239 (2009).</li>
<li>Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+high-fat+diet+in+stress+response+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of high-fat diet in stress response of Drosophila.</a> PLoS One. 7, 42587(2012).</li>
<li>Kitahara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+class+III+obesity+%28BMI+of+40-59+kg%2Fm2%29+and+mortality%3A+a+pooled+analysis+of+20+prospective+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies.</a> PLoS Med. 11, 1001673(2014).</li>
<li>Reis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).</li>
<li>Turne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercritical+fluid+extraction+and+chromatography+for+fat-soluble+vitamin+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis.</a> J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).</li>
<li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175(2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השמנת יתר אינדוקציה בעכברים יכול לקחת חודשים19,20. בזבובים, זו HFD האכלה הפרוטוקול מאפשר אינדוקציה של עודף הצטברות שומן תוך מספר ימים או פחות, גורם מגביר הצטברות שומן רק לאחר 18 h (ראה איור 2). HFD האכלה עם פרוטוקול המתואר גלוקוז תוכן 12 עליות וירידות Bmm ליפאז ו PGC-1 ביטוי24. זאת בניגוד צום של מבוגרים דרוזופילה הגורמת לירידה מהירה fat ו גלוקוז תוכן2...

אנחנו בתקופה שבה השמנת יתר, הנטל הכלכלי, המשויכת שלו הוא בעיה ברחבי העולם1. . שניים מתוך כל שלושה אמריקאים הם מעודף משקל או מהשמנת יתר עם פתולוגיות הקשורות ללב, הגורם העיקרי למוות בתוך אוכלוסיית הבוגרים2. השיטה היעילה חדש דרושים כדי שלמאחה לחקור את הרכיבים גנטית ומולקולרית מעורב ברגולציה של תסמונת מטבולית באמצעות מודל אורגניזמים. מסיבה זו, אנו בוחרים את המודל דרוזופילה זבוב הפירות כי היא חולקת את התהליכים הביולוגיים הבסיסיים ביותר עם יונקים, כולל בעכברים ובבני אדם3,4,5,6. הגנום של דרוזופילההוא מאוד שנשמרת במשך האבולוציה אבל בסך הכל הרבה יותר קטן עם פחות שכפול גנטי, המורכבות מטבולית, שהופך אותו אידיאלי עבור הבנת המנגנונים הבסיסיים מעורב מחלות אנושיות רבות4 , 7 , 8. בנוסף, תהליכים אופייניים המבוצע על ידי רקמת שומן, הבטן ואת הלבלב מיוצגים הזבוב ולסיים רגולטוריות פונקציות בגלוקוז, ליפיד חילוף חומרים, לדוגמה, דומים לבני אדם9, 10,11. יתר על כן, בסיסי מסלולים מולקולריים המעורבים בבקרה על השמנה, עמידות לאינסולין וסוכרת בבני פונקציונלית נשמרים דרוזופילה melanogaster12,13,14 , 15 , 16. כמו עילאיים, דרוזופילה יש לב פועם נוצרת במהלך הפיתוח על-ידי תהליכים דומים לזה של ה-3,לב בתרבית של17. לפיכך, התפתחות HFD אמין האכלה הפרוטוקול ואת וזמינותו תג תפוקה גבוהה, המותאמים למטרות סינון יעיל באמצעות תיבת כלי גנטי של דרוזופילה, לספק אמצעי חשוב ללמוד ולהבין את הבסיס הגנטי הבסיסי מחלות מטבוליות מורכבת המשמשת כבסיס.
המזון HFD עצמו עשוי מאכל לעוף מעבדה רגיל בתוספת שמן קוקוס, אשר מורכב ברובו של חומצות שומן רוויות ידוע להיות מזוהה עם תסמונת מטבולית18. בעוד שייצור השמנה במודלים יונקים, כגון מכרסמים, יכול לקחת חודשים19,20, שלנו HFD ממוטבת האכלה פרוטוקול דרוזופילה ביעילות, reproducibly מגדיל organismal שומן בעניין של ימים12,14. פרוטוקול זה, בשילוב עם וזמינותו תפוקה גבוהה תג, מאפשר הקרנה המונים יעילה על ההשפעות של גורמים גנטיים, השפעות הסביבה. סמים מועמדים לגלות מאפננים החדש של חילוף החומרים של השומן. כתוצאה מכך, צפויים פרוטוקולים אלה רלוונטיים להבין ו/או לחימה השמנת יתר, השמנת יתר-הקשורים פתולוגיות אנושי.
פרוטוקול האכלה הוא תכליתי ולא ניתן להחיל לחקור את ההשפעות מטבולית ופונקציונליים של חומצות שומן רוויות או רוויים יחיד. שימוש assay תגים תפוקה גבוהה זו אינה מוגבלת melanogaster ד, אך עשוי להתאים למגוון רחב של אורגניזמים מודל קטן עם לציפורן או מטריצה חוץ-תאית קשה (למשל, מינים אחרים דרוזופילה , C. elegans השני המתעוררים דגם הגעה אורגניזמים) כדי למדוד את תכולת שומן תחת תנאים סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיות שונות, בכל שלב של פיתוח, לבגרות או שלב של מחלה מטבולית. וזמינותו תג מבוססת על מדידה ערכי צבע מוחלטים של סדרה של תגובות אנזימטיות זה לבזות את התגים לתוך חומצות שומן בחינם, גליצרול, גליצרול 3-פוספט ולבסוף2O H2 זה מגיב 4-aminoantipyrine (4-AAP) ו- 3.5- dichloro-2-hydroxybenzene (DHBS 3.5) כדי לייצר מוצר בצבע אדום נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים 96-ובכן סולפנט

<table><tbody><tr><td>טפטפת כדור/מתקן חרוזים Talboys</td><td></td> <td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys הומוגנייזר תפוקה גבוהה</td><td>Talboys</td><td>#:</td> כדורי שחיקה 930145<td></td></tr><tr><td>, נירוסטה&nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td> <td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 כדורים</td></tr><tr><td>מאסטרבלוק 96 מיקרו-פלטות עמוקות היטב</td><td>Greiner Bio-One</td> <td># T-3058-1</td><td>מארז של 80 צלחות</td></tr><tr><td>Greiner&nbsp; 96 באר מיקרופלייט תחתון שטוח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td> <td># M4436</td><td>40 צלחות</td></tr><tr><td>גריינר CapMat לאיטום צלחות מרובות בארות</td><td>סיגמא אולדריץ'</td> <td># C3606</td><td>50 לוחות איטום</td></tr><tr><td>מאגרי ריאגנטים& נ.ב.פ;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul multipipette</td></tr><tr><td>רב ערוצי טיפים</td><td>דנוויל סיינטיפיק בע"מ</td> <td># P3131-S</td><td>עבור 10 טיפים פיפטה uL</td></tr><tr>טיפים<td>רב-ערוציים</td><td>דנוויל סיינטיפיק בע"מ</td> <td># P3133-S</td><td>עבור 200 uL פיפטה</td></tr><tr><td>טיפים רב-ערוציים</td><td>דנוויל סיינטיפיק בע"מ</td><td>#P1125</td><td>עבור 100 uL פיפטה</td></tr><tr><td>מלקחיים&nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>מלקחיים סופר עדינים</td></tr><tr><td>מטלר טולדו אקסלנס XS איזון אנליטי Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer מומחים מדעיים</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td><td>Cole-Parmer מומחים מדעיים</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96-Well microplate צנטריפוגה</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Microplate מכשירים</td><td>מולקולריים</td> קורא<td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>קו מעבדה ספסל עליון אורביט סביבה שייקר אינקובטור</td><td>Biostad</td> <td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טריגליצרידים אינפיניטי</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>טריגליצרידים סטנדרטי</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>התחלה מהירה בדיקת חלבון ברדפורד</td><td>Bio-RAD</td> <td># 500-0205</td><td>מגיב צבע 1x</td></tr><tr><td>שמן קוקוס</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>צנצנת 15 0z PBS</td></tr><tr><td>10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>רדיד חדיר גז</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 חתיכות</td></tr><tr><td>נייר</td><td>סינון VWR</td><td># 28317-241</td><td>חבילה של 100</td></tr><tr><td>בקבוקוני</td> <td>דרוזופילהGenesee</td><td>Scientific Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>התחלה מהירה סרום בקר אלבומין סטנדרטי</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap Anesthetic</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-Player, 4.4 x 8.4 אינץ'</td></tr></tbody></table>

בשומן האכלה ואת וזמינותו triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

מחלת לב היא הגורם מספר אחד למוות אדם ברחבי העולם. מחקרים רבים הראו קשרים חזקים בין השמנת יתר בתפקוד הלב אצל בני אדם, אבל מאמצי המחקר וכלים נוספים יש צורך להבהיר טוב יותר את המנגנונים המעורבים. במשך יותר ממאה, הדגם גנטית מאוד צייתן של דרוזופילה כבר אינסטרומנטלי גילוי גנים מרכזיים, מסלולים מולקולריים אשר הוכיח להיות מאוד שמור על פני מינים. תהליכים ביולוגיים רבים, מנגנוני המחלה באופן פונקציונלי נשמרים בתוך הזבוב, כגון פיתוח (למשל, תוכנית גוף, לב), סרטן, מחלות ניווניות. לאחרונה, המחקר של השמנת יתר, פתולוגיות משני, כגון מחלות לב דגם אורגניזמים, שיחק תפקיד קריטי מאוד הזיהוי של הרגולטורים מפתח מעורב תסמונת מטבולית אצל בני אדם.
כאן, אנו מציעים שתשמש כלי יעיל זה אורגניזם מודל זירוז השמנת יתר, כלומר, הצטברות שומן עודף, ולפתח פרוטוקול יעיל כדי לנטר בצורה של תגיות הצטברות שומן. בנוסף שנשמרת מאוד, אבל פחות מורכבים הגנום, הזבוב יש גם אורך חיים קצר לניסויים מהירה, בשילוב העלות האפקטיביות. מאמר זה מספק נוהל מפורט עבור דיאטה שומן גבוהה (HFD) האכלה דרוזופילה לזירוז השמנה ואת וזמינותו triacylglyceride (תג) של תפוקה גבוהה למדידת העלייה המשויך תכולת השומן, במטרה להיות מאוד לשחזור, יעיל לסינון גנטי או כימיות בקנה מידה גדול. פרוטוקולים אלה מציעים הזדמנויות חדשות ביעילות לחקור מנגנונים רגולטוריים מעורב השמנת יתר, וכן מספקים פלטפורמה סטנדרטית למחקר גילוי סמים בדיקה מהירה של השפעת סמים מועמדים על הפיתוח או מניעת השמנת יתר, סוכרת ומחלות מטבוליות הקשורות.

ד melanogaster, כפי שקורה עם מינים אחרים, יש דו-צורתיות בין זכרים ונקבות22. זה ידוע כי נשים הם גדולים, עם יותר שומן בתוך הבטן שלהם, מאשר זכרים22. כדי לבדוק את האפקטיביות של פרוטוקול שלנו, נוכל לבצע מבחני תג כדי לקבוע ההבדלים בתוכן התג בין זכרים ונקבות של מעבדה סטנדרטיים wildtype (w1118) יש טיסות. הנתונים מראים כי נקבות יש יותר שומן הגוף כל הזכרים (איור 2א, ב). הנתוני...

זוהי דיאטה שומן גבוהה האכלה פרוטוקול לזירוז ההשמנה דרוזופילה, דוגמנית על הבנת המנגנונים המולקולריים יסודי מעורב lipotoxicity. הוא גם מספק assay triacylglyceride של תפוקה גבוהה למדידת הצטברות שומן דרוזופילה ואת פוטנציאל אחרים מודלים (חרק) בתנאים תזונתיים, סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיים שונים.

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

המטרה הכללית של פרוטוקול ההאכלה בתזונה עשירה בשומן ומבחן הטריאצילגליצרול בקיבולת גבוהה זו היא להשרות השמנה באורגניזם מודל כגון *Drosophila melanogaster* ולנטר את השינויים הנלווים בתכולת השומן תחת מגוון תנאים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המטבוליזם, כולל השמנה ברמת האורגניזם וליפוטוקסיות ספציפית לאיברים הרלוונטית לסוכרת, תסמונת מטבוליים, וסטאטוזיס של הכבד והלב. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשרות הצטברות עודפת של שומן ב-drosophila בתוך מספר ימים, ולקבוע את תכולת השומן בו-זמנית בתוך כשעה.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחנה של מחלות מטבוליות ועל הטיפול בהן, מכיוון שפרוטוקול בעל תפוקה גבוהה מאפשר מחקרי גילוי תרופות מואצים באמצעות מערכת מודל זו. כדי להתחיל בניסוי, הכינו קילוגרם אחד של מזון עשיר בשומן: שקלו 700 גרם של מזון זבובים מוכן מראש ו-300 גרם של שמן קוקוס לשני מכלים נפרדים באמצעות מאזניים אנליטיים. חממו כל מכל בנפרד במיקרוגל עד שהתכנים יימסו לחלוטין.שפכו את שמן הקוקוס המומס לתוך מיכל מזון הזבובים, וערבבו את התוכן בעזרת מטרפה עד ששמן הקוקוס יתערבב עם מזון הזבובים. שקלו שוב את המזון עתיר השומן. אם המשקל הכולל נמוך מקילוגרם אחד, הוסיפו כ-10 milliliters של מים כדי להחזיר את המשקל לקילוגרם אחד.לאחר מכן, מזגו 10 milliliters של המזון עתיר השומן המעורבל היטב לתוך כל מבחנה. כסו את המזון בבד גזה כדי למנוע זיהום והניחו למזון להתרנן במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הקירור, העבירו את המבחנות לטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius לאחסון למשך עד ארבעה שבועות.השתמשו ב-CO2 כדי להרדימ את הזבובים. אספו זבובים בני אפס עד חמישה ימים מבקבוקי המקור, והעבירו את הזבובים לבקבוקים חדשים המכילים מזון רגיל, או NF, שחומם מראש. אפשרו לזבובים להתבגר למשך חמישה ימים נוספים בטמפרטורה של 21 degrees Celsius. בתום חמשת הימים, הוציאו מהמקרר (4 degrees Celsius) את הבקבוקים המכילים תזונה עשירה בשומן, או HFD, ואת אלה עם ה-NF.נקה והסר נוזלים עודפים מדפנות המבחנות באמצעות מגבונים כדי למנוע מהזבובים להידבק לאוכל ה-HFD. הכנס פיסת נייר סינון קטנה, במידות של כמרבית סנטימטר על שלושה סנטימטרים, לתוך האוכל עשיר השומן כדי לספוג כל נוזל עודף. לאחר מכן, העבר את הזבובים אל האוכל עשיר השומן.הניחו את הבקבוקונים באופן אופקי על צדם, בטמפרטורה של 21 עד 22 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. לאחר חמישה ימים, העבירו את הזבובים מקבוצות ה-NF וה-HFD לבקבוקונים חדשים ללא מזון, כדי לאפשר למעי שלהם להתרוקן למשך 30 דקות. המשיכו לשקילת הזבובים.עבור כל גנוטיפ ומגדר שייבחנו, השתמש במאזניים רגישים במיוחד כדי לתעד את משקלן של מבחנות ריקות בנפח 1.7 מיליליטר המסומנות מראש. הרדם ואסוף בעזרת מברשת 36 זבובים מאותו גנוטיפ, מגדר ומצב תזונה אל תוך מבחנה אחת בנפח 1.7 מיליליטר שנשקלה מראש. לאחר מכן, שקול את המבחנה המכילה את הזבובים באמצעות אותם מאזניים רגישים במיוחד.בצעו הקפאה מהירה (Flash freeze) למבחנות ה-1.7 milliliter המכילות את הזבובים על ידי טבילה בחנקן נוזלי למשך שתי דקות. אספו את המבחנות והניחו אותן בקופסאות. לאחר מכן, העבירו את הקופסאות למקפיא של 80- degrees Celsius לאחסון עד לשימוש בבדיקת ה-TAG.ראשית, הוציאו את הזבובים הקפואים מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס, והניחו את המבחנות על קרח. הכניסו כדורי טחינה ממתכת בקוטר שני מילימטרים למחלק כדורים בעל 96 בארות, והשתמשו במכחול קטן כדי להסיר כדורים מיותרים. לאחר מכן, הניחו את פלטת הטחינה בעלת 96 הבארותהפוכה מעל למחלק הכדורים, והפכו אותה כדי להעביר את הכדורים המתכתים ישירות לתוך פלטת הטחינה.יש לוודא שבכל באר נמצא כדור אחד. לאחר מכן, באמצעות פיפט רב-ערוצי, יש להוסיף 600 µL של PBT לכל שורה בלוח הטחינה בעל 96 הבאערים. בעזרת פינצטה, יש להוסיף שלוש זבובים לכל באר.ציינו את הגנוטיפ, המין ומצב התזונה של הזבובים בכל שורה או באבאר של פלטת הטחינה בעלת 96 האבארים. סגרו את הפקקים של פלטת הטחינה בעלת 96 האבארים באופן הדוק. הדביקו סרט דביק מעל כדי להבטיח שלא תתרחש דליפה.מקם נכון את לוחות הריסוק בעלי 96 הבא reworked בתוך מכונת הריסוק. הגדר את המכונה למהירות הגבוהה ביותר, ולחץ על run כדי לרסק את הזבובים למשך שלוש דקות. לאחר שלוש דקות, עצור את הריסוק והמשך לסבב צנטריפוגה.לאחר הצנטריפוגציה, טפלו בלוח הריסוק בזהירות כדי למנוע ערבוב של הנוזל העליון (supernatant) עם המשקע (pellet). בעזרת פ pipette רב-ערוצית, העבירו 200 µL של ריאגנט TAG לכל שורה בלוח ספקטרופוטומטר חד בן 96 בארות. העבירו 20 µL של PBT לבאר הראשונה בשורה הראשונה לצורך יצירת דגימה ריקה (blank).ערבבו על ידי פיפטאג למעלה ולמטה. העבירו 20 µL מכל מהילול סטנדרט לבארי הנותרים בשורה הראשונה, וערבבו על ידי פיפטאג למעלה ולמטה. באמצעות פיפט רב-ערוצי, העבירו 20 µL של עלומי (supernatant) מכל שורה בלוח הגריסה לשורה התואמת בלוח הספקטרופוטומטר בעל 96 בארים.יש לpipette למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. לאחר מכן, יש להניח רדיף חסימה חדיר לגז מעל פלטת 96 בארות. יש לדגור את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך עשר דקות.מדדו את הבליעה של כל באר בלוח ב-550 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלייטים תואם. בדיקות תיוג של זבובים מסוג wild type סטנדרטיים במעבדה מראות כי לנקבות יש יותר שומן בגוף השלם מאשר לזכרים. הנתונים הראו גם כי הבדיקה יציבה, ללא שונות בכימות התיוג לאורך זמן וללא שונות התלויה בגודל הדגימה הביולוגית.בדיקות תיוג של זבובים נקבות שהוזנו בתזונה עתירת שומן (HFD) לעומת קבוצת ביקורת גילתה כי צריכה של HFD ב-drosophila גורמת לעלייה בתכולת השומן המצטברת באופן פרוגרסיבי עם הזמן. לאחר 18 שעות בלבד של הזנה ב-HFD, התinducing עלייה משמעותית בתכולת השומן בזבובים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בבקבוקוני זבובים (vials) נקיים היטב להזנה בתזונה עתירת שומן.יש לאחסן את הזבובים בטמפרטורה של 22 מעלות או פחות; כמו כן, יש להימנע מערבוב של supernatant עם השאריות בעת הפעולה עם הפ pipette במהלך בדיקת התג (tag assay). לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים הלומדים מטבוליזם ומחלות נלוות לחקור את ההשפעה של עודף חומרים מזינים ואת הבסיס הגנטי של הצטברות שומן וליקויים תפקודיים באיברים נלווים, כגון lipotoxic cardiomyopathy ב-drosophila.

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות...

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

פרוטוקול זה מתאר בדיקת תפוקה גבוהה לבדיקת העדפות הטלת ביצים של Drosophila melanogaster ברזולוציה של בעל חיים יחיד.  בדיקה זו מספקת פלטפורמה פשוטה, יעילה וניתנת להרחבה לזיהוי גנים ורכיבי מעגלים השולטים בתהליך קבלת החלטות פשוט.

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט<em&gt; תסיסנית</em

דג הזברה מתגלה כמודל רב ערך של עיבוד שומנים תזונתי ומחלות מטבוליות. מתוארים פרוטוקולים של הזנת זחלים עשירה בשומנים, הדמיה חיה של אנלוגים של שומנים פלואורסצנטיים תזונתיים וכימות צריכת מזון. ניתן ליישם טכניקות אלו במגוון טכניקות סינון, הדמיה וחקירה מונעת השערות.

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

כאן אנו מציגים שיטה למדידת רמות שומן האורגניזם ב instar השלישי (L3) בשלב הזחל של תסיסנית. שיטה זו מנצלת את הצפיפות נמוכה יחסית של רקמת שומן להבדיל בין זחלים עם ממאגרי שומן שונים. ניתוח מבוסס ציפה הוא כלי רב ערך עבור לסינון מהיר, לשחזור, וחסכוני.

שיטה מבוססת חוק ארכימדס של קביעת רמות שומן<em&gt; תסיסנית</em

אנו מתארים פרוטוקול גרימת מתגמל nonrewarding חוויות בזבובי פירות (תסיסנית) באמצעות צריכת אתנול מרצון כאמצעי לשינויים במדינות גמול.

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש<em&gt; תסיסנית</em

בדיקת FEeder (CAFE) היא שיטה פשוטה, ידידותית לתקציב ואמינה ביותר לחקירת מנגנונים העומדים בבסיס צריכת מזון. בשימוש עם אורגניזם המודל הגנטי הרב-תכליתי Drosophila melanogaster, הוא מספק אמצעי רב עוצמה להשגת תובנות חדשות לגבי מנגנוני ויסות צריכת מזון.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

מבחני צריכת המזון כמותיים באוכל צבוע לספק חזקים, תפוקה גבוהה אומר להעריך את המוטיבציה האכלה. שילוב וזמינותו צריכת מזון עם thermogenetic ו optogenetic המסכים היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור את המעגלים העצביים שבבסיס התיאבון למבוגרים melanogaster דרוזופילה.

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

TreadWheel משתמשת תנועה סיבובית לזירוז תרגיל למבוגרים דרוזופילה melanogaster בעדינות על ידי ניצול geotaxis של הזבובים מולדת, שלילי. היא מאפשרת ניתוח של אינטראקציות בין פעילות גופנית לבין גורמים, כגון גנוטיפ, סקס, תזונה, ועל השפעתם על מבחני מולקולרית, פיזיולוגיים להערכת הבריאות המטבולית.

TreadWheel: מרווח אימון פרוטוקול בעדינות המושרה תרגיל דרוזופילה melanogaster

להלן פרוטוקול המאפשר כימות צבעוני של כמות המזון הנאכל בתוך פרק זמן מוגדר על ידי זחלי מלנוגאסטר דרוזופילה שנחשפו לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. מבחנים אלה מתבצעים בהקשר של מסך תרמוגנטי עצבי.

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

אנחנו מציגים פרוטוקול לבדיקת האכלה של שתי אפשרויות לזבובים. מבחני האכלה אלה מהירים וקלים להפעלה ומתאימים לא רק למחקר מעבדה בקנה מידה קטן, אלא גם למסכים התנהגותיים בעלי תפוקה גבוהה בזבובים.

מבחני העדפת מזון מהירה בדרוסופילה

מאכיל המיקרו-לוח מציע שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לכימות צריכת מזון נוזלי בדרוזופילה. התקן מודפס בתלת-ממד מחבר מיקרו-לוחית בעלת 96 באר שבה זבובים שוכנים למיקרו-לוחית בעלת 1536 בארות שממנה זבובים צורכים תמיסת הזנה עם צבע מעקב. ירידת נפח הפתרון נמדדת באופן ספקטרופוטומטרי.

מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

למד פרוטוקול האכלה בשומן גבוה ומדידת triacylglyceride ב-Drosophila melanogaster לחקר השמנה וליפוטוקסיות. שיטה זו מאפשרת אבחון מהיר של מחלות מטבוליות וגילוי תרופות.

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

גלה סרטונים נוספים