Name: ג ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנא קומפלקסים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: למדו את שיטת האלקטרופורזה האופקית בג'ל פוליאקרילמיד נייטיב לניתוח אינטראקציות RNA-חלבון. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי תהליך יצירת הקומפלקסים במהלך האלקטרופורזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לורה Vanderploeg להכנת דמויות. עבודה במעבדה Sheets נתמך על ידי מענק NSF 1050395 ומענק NIH (R21HD076828). עבודה במעבדה ריידר נתמכת על ידי מענקים NIH R01GM117237 ו R01GM117008. מייגן Dowdle נתמכת על ידי מלגת GRS SciMed הזדמנות מתקדמת באמצעות אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון בוגר בית הספר ותוכנית ביוטכנולוגיה הדרכה באמצעות המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות (T32GM008349).

1. הכנת ג &#39;ל אופקי הילידים Polyacrylamide ג&#39;ל 4 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת החומרים הדרושים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכשיר ג&#39;ל אופקי, השתמש בתיבת ג&#39;ל (37 ס&quot;מ x 24 ס&quot;מ) עם מגש 27 ס&quot;מ x 21 ס&quot;מ ויכולת עבור שתי מסרקים 24 היטב. התקנה זו מספקת סך של 48 דגימות שניתן לנתח בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ריאגנטים הבאים: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), TEMED, ו 10% APS (persulfate אמוניום). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דור של 10% יליד אקרילמיד היל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך בקבוק 500 מ&quot;ל, מוסיפים 80 מ&quot;ל של TBE 5x, 100 מ&quot;ל של 40% acrylamide, ו מים נפח סופי של 400 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של APS 10% ו 400 μL של TEMED. לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לתוך מגש הליהוק האופקי ומאפשרים את הג&#39;ל לפלמור במשך 30 דקות. הג&#39;ל יהיה בערך 2 ס&quot;מ עובי. הערה: ג &#39;לים יכול להטיל על מכסה המנוע קטר כדי להאיץ- פילמור. לאחר פילמור, שכבה דקה של נוזל יישאר על גבי הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הנוזל ואת לשטוף עם חיץ פועל. הסר את המסרק (ים) בזהירות ולשטוף את הבארות עם חיץ פועל באמצעות מזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר חיץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 L של 1x TBE פועל מאגר עבור תיבת ג&#39;ל. מדולל 400 מ&quot;ל של 5XTBE עם 1600 מ&quot;ל ומערבבים. מקום 1x TBE חיץ בחדר קר להתקרר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום הפעלת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 L למאגר ריצה קר לתיבת ג&#39;ל ולהכניס את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להפעיל את הג&#39;ל ב 120 V במשך שעה 1 ב 4 ° C בחדר קר. במהלך תקופה זו, להכין את התגובה מחייב. </li></ol></li></ol> 2. תגובה מחייב 8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.1.הכנה את רכיבי התגובה הבאים. 20 מ&quot;מ DTT 10 מ&quot;מ BSA 10 mM שמרים tRNAs חיץ 5X מחייב (50 מ&quot;מ HEPES pH 8.0, 5 מ&quot;מ EDTA, 250 מ&quot;מ KCl, 0.2% Tween-20) 100 פלואורסצין ננומטר שכותרתו RNA מסחרית חלבון Bicudal C מרוכז 50% גליצרול ב DEPC שטופלו H 2 O DEPC שטופלו H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את רכיבי התגובה מחייב צינור RNase חופשי microcentrifuge. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הצינור, להוסיף 5 μL של 10 מ&quot;מ BSA, 5 μL של 20 מ&quot;מ DTT, 5 μL של 10 mM שמרים tRNAs, 10 μL של הצפת 5x מחייב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חלבון לריכוז סופי של 250 ננומטר ב 50 μL. הוסף מים לנפח סופי של 45 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μL של המצע RNA שכותרתו fluorescently. השתמש מסחרי שנרכש 3 &#39;פלואורסצין שכותרתו 32 מצע נוקליאוטידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ו דגירה בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li></ol> 3. ניתוח של דוגמאות על הילידים אופקית Polyacrylamide ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תגובה, להוסיף 15 μL של גליצרול 50% ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CarefuLly להוסיף 30 μL של כל תגובה לג&#39;ל. כמות המדגם שניתן לטעון לתוך באר אחת משתנה בהתאם לעובי של ג &#39;ל ואת גודל הבארות. יש לנו כרכים טעון כמו μL 15 ו עד 45 μL לתוך באר אחת של ג&#39;לים שנוצרו עם מסרק 24 גם שפכו לעובי של 2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיבור ספק הכוח למתג הג &#39;ל על הכוח ולהתאים את המתח. הפעל את הג&#39;ל ב 4 ° C ב 120 V. הערה: עבור מכשיר ג&#39;ל אופקית, זה בסופו של דבר להיות כ 5 V / cm. עבור מכשיר ג&#39;ל אנכי, זה 16 V / cm. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע נזק או הלבנה של RNA שכותרתו fluorescently, לנהל אלקטרופורזה בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמים אלקטרופורזה משתנה בהתאם הפרטים של קומפלקס חלבון רנ&quot;א להיות מנותח. הערה: יתרון גדול של ניתוח אופקי EMSA הוא אלקטרופורזה ניתן לעצור, הג&#39;ל צילמו ולאחר מכן את geאני יכול להיות ממוקם בחזרה לתוך מנגנון אלקטרופורזה ניתן להמשיך עוד פעמים. </li></ol></li></ol> 4. הדמיה ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניתוח עם כל מכשיר המיועד לזיהוי וצילום פלואורסצנטי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הג&#39;ל על imager. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם הגדרות imager. עבור ligands RNA fluorescein שכותרתו, השתמש בהגדרות הבאות: FAM (אורך גל 473 ננומטר), 750 מתח מכפיל (PMT), 100 פיקסלים פיקסל גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הג&#39;ל כדי ללכוד תמונה. </li></ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li>
<li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386(2012).</li>
<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ג &#39;ל polyacrylamide הילידים הם כלי רב ערך לחקר אינטראקציות חלבון- RNA ו באופן מסורתי ג&#39;לים אלה electrophoresed אנכית 2 , 3 . השתמשנו שינוי של פרוטוקול מחליף ג &#39;ל polyacrylamide יליד נוצר electrophoresed אופקית 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . שינויים אלה משמשים ...

מבחני מעבר ניידות אלקטרופורטית (EMSAs) הוכיחו להיות כלי ביוכימי שלא יסולא בפז לנתח אינטראקציות ספציפיות לחלבון-חומצה גרעינית 1 , 2 , 3 . מבחני אלה יכולים לספק מידע חשוב לגבי זיקה מחייב של חלבונים ל- RNA או DNA 3 , stoichiometry מרכיב של מתחמי חומצה גרעין 1 ולספק תובנות חדשות חשובות על הייחודיות מחייב של חלבונים RNA מחייב באמצעות ניסויים בתחרות המצע 1 . ההגדרה הניסויית המסורתית עבור מבחני אלה מורכב ערבוב חלבון מטוהרים עם המצע RNA radiolabeled. מתחמי שהתקבלו לאחר מכן מנותחים עם הלא denaturing (יליד) ג &#39;ל polyacrylamide שפכו בין שתי צלחות זכוכית ואחריו electrophoresis מדגם במנגנון אנכי 3. בעוד גישה זו שימשה באופן ממצה כדי לספק תובנות חשובות במנגנונים הביוכימיים שבבסיס מחייב של חלבונים לחומצות גרעין, יש לה גם מספר מגבלות. לדוגמה, לאסטרטגיה בסיסית זו יש תפוקה נמוכה יחסית והיא אינה ניתנת להתאמה בקלות עבור יישומים הדורשים ניתוח של תגובות מחייבות רבות במקביל. בנוסף, עם המנגנון האנכי המסורתי זה מאתגר פוטנציאלי לפקח מתחמים במספר פעמים במהלך אלקטרופורזה 3 , 4 . כאן אנו מציגים הסתגלות של assay EMSA המשתמשת ג &#39;ל polyacrylamide יליד יצוק מכשיר שטוח, אלקטרופורזה אופקית ו fluorescently שכותרתו RNA מצעים 4 , 5 , 6 , 7 . שילובם של שינויים פשוטים יחסית אלהTegy מספק כמה יתרונות חזקים. בפרט, פורמט שטוח אופקי בקלות משאיל את עצמו לנתח עשרות דגימות בו זמנית 4 . כמו כן, עבור כמה מתחמי RNA חלבונים, כגון אלה שנוצרו בין החלבון Bicaudal-C ו אלקטרופורזה המצע RNA שלה בג&#39;ל אופקי מספק יכולת מוגברת כדי לפתור שונים RNA חלבונים מתחמי להפלות אלה ממצע רנ&quot;א מאוגד.

<table><tbody><tr><td>קופסת ג'ל אופקית</td><td>ינשוף</td><td>N/A</td><td>המוצר כבר לא מיוצר. קופסאות ג'ל דומות ניתן למצוא ב-Thermo Scientific, קופסאות ג'ל מסדרת A. מספר קטלוגי: A2-BP</td></tr><tr><td>24 בארות גדולות מסרקות אלקטרופורזה אופקית גדולה של ג'ל</td><td>ינשוף</td><td>N/A</td><td>המוצר כבר לא מיוצר. קופסאות ג'ל דומות ניתן למצוא ב-Thermo Scientific, מסרקי קופסאות ג'ל מסדרת A. מספר קטלוגי: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean II Electrophoresis Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40% 19:1 אקרילאמיד/ביס</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>שמרים tRNAs</td><td>אמביון</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין שכותרתו RNA</td><td>IDT</td><td>N /</td><td>A ניתן לבצע הזמנה בהתאמה אישית לאורך ולרצף הרצוי</td></tr><tr><td>EDTA טטרסודיום מלח הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס אולטרה-טהור</td><td>ארה"ב ביולוגי</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>פישר מדעי</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

ג &#39;ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ&quot;א קומפלקסים

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

יליד polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי של ביולוגיה מולקולרית אשר שימש בהרחבה לניתוח ביוכימי של אינטראקציות רנ&quot;א חלבון. אינטראקציות אלה ניתחו באופן מסורתי עם ג&#39;ל polyacrylamide שנוצר בין שתי צלחות זכוכית דגימות electrophoresed אנכית. עם זאת, ג &#39;ל polyacrylamide יצוק מגשים electrophoresed אופקית מציעה מספר יתרונות. לדוגמה, ג &#39;לים אופקי המשמש כדי לנתח מתחמי בין מצעים RNA פלואורסצנטי חלבונים ספציפיים ניתן הדמיה מספר פעמים כמו אלקטרופורזה מתקדמת. זה מספק הזדמנות ייחודית לפקח על מתחמי RNA חלבונים בכמה נקודות במהלך הניסוי. בנוסף, אלקטרופורזה ג&#39;ל אופקית מאפשרת לנתח דוגמאות רבות במקביל. זה יכול מאוד להקל על הניסויים כמובן כמובן, כמו גם ניתוח של מספר רב של תגובות בו זמנית להשוות רכיבים שונים ותנאים. הנה אנחנו יחסי ציבורOvide פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקית אלקטרופורזה הילידים אופקי לניתוח אינטראקציות RNA-Protein.

כדי להדגים את הכוח ואת צדדיות של אופקי הילידים ג &#39;ל אלקטרופורזה ניתחנו את הכריכה של Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) חלבון ל RNA שכותרתו fluorescently המכיל אתר מחייב Bicc1. חלבונים Bicc1 לתפקד כמו mRNA ספציפיים מדכאים translational לשלוט בתאי הגורל החלטות במהלך השלבים האימהיים של התפתחות בעלי חיים 9 , 10 , 11 , 12...

יליד polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי לניתוח אינטראקציות רנ&quot;א חלבון. באופן מסורתי רוב הניסויים השתמשו בג&#39;לים אנכיים. עם זאת, ג &#39;לים אופקית לספק מספר יתרונות, כגון הזדמנות לפקח מתחמי במהלך אלקטרופורזה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקי גלוקל אלקטרופורזה הילידים.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לנתח אינטראקציות בין RNA לחלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל טבעי (native gel) אופקי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביוכימיה של RNA, כגון הגדרת המאפיינים של אינטראקציות ספציפיות בין RNA לחלבונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניטור של היווצרות קומפלקסים מספר פעמים במהלך האלקטרופורזה.עבור מכשיר הג'ל האופקי, השתמשו בקופסת ג'ל עם מגש יציקה של 27 סנטימטר על 21 סנטימטר וקיבולת לשני מסרקי 24 בארות. הגדרה זו מאפשרת ניתוח סימולטני של סך כולל של 48 דגימות. הכינו שני ליטרים של תמיסת ריצה 1x TBE על ידי דילול של 400 מיליליטר של 5x TBE עם 1,600 מיליליטרים של מים וערבוב.העבירו את תמיסת ה-TBE לחדר הקירור להkירור. הכינו את הרכיבים הבאים לפי פרוטוקולים סטנדרטיים: 40% acrylamide ביחס של 19:1, TBE 5x, temed ו-10% ammonium per sulfate. להכנת ג'ל native acrylamide בריכוז של 10%, הוסיפו לבקרה בנפח של 500 מיליליטר את הרכיבים הבאים: 80 מיליליטר של TBE 5x, 100 מיליליטר של 40% acrylamide ומים עד לנפח סופי של 400 מיליליטר.הוסיפו ארבעה מיליליטרים של 10% ammonium per sulfate ו-400 מיקרוליטרים של temed וערבבו היטב. שפכו את התערובת לתבנית היציקה האופקית והניחו לג'ל להתפולימר במכסה העשן למשך 30 דקות. הג'ל המפוליימר יהיה בעובי של כשני סנטימטרים ושכבה דקה של נוזל תישאר על פני הג'ל.הניחו את הג'ל לתוך קופסת הג'ל והעבירו אותה לחדר הקר. לאחר מכן, שפכו את הנוזל החוצה ושטפו עם running buffer. הסירו את המסרקי השערות בזהירות, הוסיפו שני ליטרים של running buffer קר לקופסת הג'ל, ולאחר מכן השתמשו במזרק כדי לשטוף את הבארים עם running buffer.הריצו הרצה מקדימה של הג'ל במתח של 120 וולט למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחדר קר. בזמן ההרצה המקדימה של הג'ל, הכינו את תגובות הקישור. הוסיפו את רכיבי תגובת הקישור הבאים לכל מבחנה מיקרוצנטריפוגית נקייה מ-RNA, בסדר הבא: 5 µL של 10 mM BSA, 5 µL של 20 mM DTT, 5 µL של 10 mM yeast tRNAs, 10 µL של 5x binding buffer, חלבון bicaudal-c לריכוז סופי של 250 nM ב-50 µL, מים שעברו טיפול ב-DEPC לנפח סופי של 45 µL ו-5 µL של סבסטרט RNA מסומן פלואורסצנטית.סגרו את המבחנות ונערו בעדינות לערבוב, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה לזמן קצר והדגרימו בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. עם השלמת תגובות הקישור, הוסיפו 15 µL של 50% glycerol לכל תגובה וערבבו בעדינות. טענו בזהירות 30 µL מכל תגובה אל בארי הג'ל; כמות הדגימה שניתן לטעון לבאר בודדת משתנה בהתאם לעובי הג'ל ולגודל הבאריים.חברו את ספק הכוח למכשיר הג'ל, הפעילו את המתח, כווןו ל-120 volts והריצו את הג'ל בטמפרטורה של four degree celsius. כדי למנוע נזק או הבהרה של ה-RNA המסומן פלואורסצנטית, בצעו את האלקטרופורזה בחושך. זמני האלקטרופורזה ישתנו בהתאם למאפיינים הספציפיים של קומפלקס ה-RNA-חלבון הנבדק.יתרון מרכזי של ניתוח בדיקת הזחה של ניידות אלקטרופורטית אופקית הוא שניתן להפסיק את האלקטרופורזה בתמונת הג'ל לפני השלמת ההרצה. בצע את הניתוח באמצעות כל מכשיר המיועד לגילוי סובסטראטים פלואורסצנטיים בדימות. התאם את הגדרות הדומייזר; עבור ליגנדים המסומנים פלואורסצנטית, השתמש בהגדרות הבאות.אורך גל של פלואורסצאין של 473 nanometers, מתח פוטומולטיפליקטור של 750 volts וגודל פיקסל של 100 micrometers. סרקו את הג'ל כדי ללכוד את התמונה. לאחר הדמיה, ניתן להחזיר את הג'ל למכשיר ולהמשיך באלקטרופורזה למשך זמנים ממושכים יותר.הקישור של חלבון bicaudal-C או Bicc1 מה-xenopus ל-mRNA של Cripto1 המסומן פלואורסצנטית ומכיל אתר קישור ל-Bicc1, נותח באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל טבעי (native gel electrophoresis) הן בצורה אנכית והן בצורה אופקית. כביקורת שלילית, Bicc1 ערבב עם RNA מסומן פלואורסצנטית שנגזר מ-mRNA של CyclinB1. היה ברור במידה רבה, בשתי השיטות, כי Bicc1 נקשר ל-RNA של Cripto1 ויוצר קומפלקס ספציפי. עם זאת, קומפלקסי Bicc1-Cripto1 היו מובחנים באופן משמעותי יותר כאשר הם נותחו באמצעות הג'ל האופקי, דבר שהקל על זיהוيهم ואפשר את ההבחנה בין קומפלקסי חלבון-RNA לבין RNA שאינו קשור.לאחר הדמיה, הג'ל הוחזר למכשיר הג'ל, בוצעו אלקטרופורזה למשך שלוש שעות וחצי נוספות, והוא הודמיה שוב. כפי שמוצג כאן, הקומפלקסים נדדו למרחק רב יותר ועדיין ניתן היה לזהותם בקלות, דבר המעיד על יציבותם. לאחר רכישת מיומנות בשיטה זו, ניתן לבצעה בארבע עד חמש שעות, במידה שהיא מבוצעת כהלכה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ניתוח אינטראקציות בין RNA לחלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל native אופקי.

horizontal-gel-electrophoresis-for-enhanced-detection-protein-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מקור: סטנום, ט. ס. ואחרים. כימות השפע ורמות הטעינה של RNA מעביר באשרכיה קולי. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את השימוש באלקטרופורזה ג'ל ובלטינג צפוני לזיהוי והשוואת רמות הטעינה של RNA העברה ב-E. coli על ידי הפרדת צורות אמינואציליאטיות ודיאציליאטיות.

אלקטרופורזה ג'ל ו-Northern Blotting לזיהוי רמות טעינת tRNA ב-E. coli

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת שינוי הניידות האלקטרופורטית כדי לזהות אינטראקציות חלבון-דנ"א באמצעות בדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית אינפרא אדומה. כאשר החלבון נקשר לבדיקת הדנ"א, הוא יוצר קומפלקס גדול הנודד באיטיות ומופיע כרצועה מוסטת על הג'ל.

בדיקת Electrophoretic Mobility Shift לזיהוי קומפלקסים של פקטור שעתוק-DNA

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט ומהיר להערכת המצב האוליגומרי של חלבון GTPase MxA דמוי דינמין מליזאטים של תאים אנושיים באמצעות שילוב של PAGE שאינו דנטורציה עם ניתוח כתמים מערביים.

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

למדו את שיטת האלקטרופורזה האופקית בג'ל פוליאקרילמיד נייטיב לניתוח אינטראקציות RNA-חלבון. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי תהליך יצירת הקומפלקסים במהלך האלקטרופורזה.

ג 'ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ"א קומפלקסים

גלה סרטונים נוספים