שלב התנהגות של שלפוחית טעונה בתנאים פתרון סימטרי אסימטרי במעקב עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
24 באוקטובר 2017
ניסויים שלב מופרדים unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) לעתים קרובות להזניח את התנאים פיזיולוגית. עבודה זו מציג גישות לחקר השפעת מליחות גבוהה מאגר על נוזל-נוזל שלב ההפרדה בין האנשים שנגדם ל טעונה כפונקציה של טרנס-הממברנה לפתרון האסימטריה ואת הטמפרטורה.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להעריך כמותית את ההשפעה של סביבות המליחות הגבוהה ואסימטריית התמיסה הטרנסממברנית הנמצאת בתנאים פיזיולוגיים על מצבי פאזה של הממברנה. תמיסות בתוך התא ומחוץ לתאים שונות מאוד. השיטות שלנו עוזרות להבין את השפעת אסימטריית התמיסה על תכונות הממברנה והתנהגות הפאזה.
היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא שניתן להכין שלפוחיות בתנאי חיץ פיזיולוגיים וניתן להשתמש במכשיר המיקרופלואידי ליצירת תנאי חיץ אסימטריים. כדי להתחיל בהליך, יש לחספס צד אחד של צלחת PTFE עם נייר זכוכית עדין. שטפו את הצלחת, בקבוקון זכוכית של 15 מיליליטר ומיכל זכוכית אטום עם חומר ניקוי מסחרי לשטיפת כלים, אתנול וכלורופורם.
השתמש במזרק זכוכית של 25 מיקרוליטר כדי להפקיד 10 עד 15 מיקרוליטר של מלאי שומנים בכלורופורם על הצד המחוספס של צלחת ה-PTFE הנקייה והיבשה. מורחים את ציר השומנים בעזרת מחט המזרק ליצירת סרט שומנים אחיד. השתמש בפינצטה כדי להעביר את הצלחת לבקבוקון של 15 מיליליטר.
מחממים את הצלחת בחום של 60 מעלות צלזיוס ומייבשים במשך שעתיים כדי לאדות את הממס. לאחר מכן, הוסף מים נטולי יונים למיכל זכוכית לגובה של כסנטימטר אחד. הנח את הבקבוקון עם הצלחת במיכל, וודא שהוא יישאר יציב וזקוף ואטום את המיכל.
הניחו לשכבת השומנים להתנפח מראש ב-60 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר מכן, הוציאו את הבקבוקון מהמיכל. שואבים חמישה מיליליטר של תמיסת נפיחות למזרק פלסטיק ומחברים פילטר של 0.45 מיקרומטר לקצה המזרק.
הוסף את תמיסת הנפיחות המסוננת לבקבוקון כדי להרטיב את שכבת השומנים. מכסים את הבקבוקון ואוטמים את הבקבוקון בסרט פרפין מפלסטיק. אחסן את הבקבוקון בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לקבל את אגרגט ה-GUV.
מצננים את השלפוחיות לטמפרטורת החדר תוך שעה מהסרתם מהאש. חותכים את הקצה של קצה מיקרו-פיפטה מפלסטיק בנפח 200 מיקרוליטר, כך שניתן יהיה למשוך את אגרגט ה-GUV לקצה. השתמש בקצה הפיפטה הקצוץ כדי להעביר את האגרגט ו -50 מיקרוליטר של תמיסת נפיחות לבקבוקון נקי ויבש של שני מיליליטר.
הוסף לבקבוקון 950 מיקרוליטר של תמיסת נפיחות טרייה או תמיסה איזוטונית להשגת תנאי תמיסה סימטריים או אסימטריים בהתאמה. פיפטו את התערובת למעלה ולמטה ואז הפכו בעדינות את הבקבוקון מספר פעמים כדי להשעות מחדש את ה-GUVs. כדי להתחיל בהערכה, הנח מנה של תרחיף GUV במבודד סיליקון בשקופית מיקרוסקופ.
אטום את החדר בעזרת כיסוי. אפשר לדגימה להתאזן מחדש למשך חמש דקות. לאחר מכן, הנח את השקופית על שלב הדגימה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ורכוש תמונות של לפחות 30 GUVs לכל אצווה.
בדוק את התמונות כדי לקבוע את מצבי הפאזה של GUVs של התמונה. GUVs במצב פאזה נוזלית אחת יהיו כדוריים וחלקים עם תווית פלואורסצנטית המפוזרת באופן הומוגני בכל הממברנה. GUVs במצב דו-פאזי מסודר ובלתי מסודר יהיו כדוריים עם תווית פלואורסצנטית המחולקת בתחומים עם גבולות חלקים בתוך הממברנה.
ודא שהדומיינים חופשיים להתפזר על משטחי השלפוחית ויכולים להתלכד. GUVs במצב פאזה נוזלית מוצקה דו-פאזית או תלת פאזית יעוגלו עם כמה גבולות זוויתיים. דומיינים נוזליים על רקע מוצק לא צריכים להציג דיפוזיה, אך דומיינים מוצקים צריכים להתפזר בחופשיות על רקע נוזלי.
לאחר זיהוי מצב הפאזה של כל GUV של תמונה, קבע את מצב הפאזה הדומיננטי עבור האצווה. חזור על התהליך עם דגימות בלתי תלויות אם מצב הפאזה הדומיננטי הוא רוב צר. לפני השימוש במכשיר המיקרופלואידי, הכינו לפחות חמישה מיליליטר כל אחד מתמיסות סוכרוז ומלח.
מסננים כל תמיסה דרך פילטר של 0.45 מיקרומטר. לאחר מכן, חתוך את הקצוות של קצות פיפטה מפלסטיק של 200 מיקרוליטר והניח קצה פיפטה בכל תעלה של המכשיר. הוסף למאגר המכשיר 100 מיקרוליטר של תמיסת נפיחות מסוננת טרייה מאותו סוג המשמשת להכנת ה-GUVs.
הוסף חמישה מיקרוליטר מתמיסת הנפיחות לכל קצה פיפטה. צנטריפוגה של המכשיר ב-900 פעמים G למשך 10 דקות למילוי ערוצי המכשיר. לאחר מכן, מלאו מזרק זכוכית של מיליליטר באותה תמיסת נפיחות מסוננת.
חבר אורך צינור למזרק. דחוף את תמיסת הנפיחות דרך הצינור עד שהבוכנה מדוכאת לחלוטין והצינור מתמלא בתמיסה. לאחר מכן, חבר את הצינור לתעלת היציאה והרכיב את המזרק על משאבת מזרק.
לאחר מכן, חבר את יחידת בקרת הלחץ לכניסות התעלה המיקרופלואידית. ודא שהשסתומים סגורים ולאחר מכן הגדר את הלחץ לשלושה פסים. הנח את המכשיר המיקרופלואידי על שלב הדגימה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.
השתמש בפיפטה כדי להסיר את תמיסת הנפיחות ממאגר המכשיר עד שיישארו רק 25 עד 50 מיקרוליטר תמיסה. הוסף 150 מיקרוליטר של מתלה GUV למאגר וערבב את המתלה עם פיפטינג עדין. הפעל את משאבת המזרק במצב נסיגה במהירות של 10 מיקרוליטר לדקה למשך 20 דקות או עד שיותר מ-90% ממלכודות המכשיר תפוסות.
לאחר מכן, פתח את שסתומי יחידת בקרת הלחץ כדי לסגור את שסתומי הטבעת במכשיר המיקרופלואידי. עצור את משאבת המזרק ואפשר למכשיר לשבת במשך שעה לפני קבלת תמונות קונפוקליות של ה-GUVs במכשיר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להסיר את מתלה ה- GUV מהמאגר כדי להשאיר רק 25 עד 50 מיקרוליטר.
הוסף למאגר 150 מיקרוליטר מהסוג השני של תמיסת נפיחות מסוננת ופיפטה בעדינות את התערובת למעלה ולמטה. חזור על תהליך זה לפחות חמש פעמים כדי להחליף לחלוטין את התמיסה במאגר. הפעל את משאבת המזרק במצב נסיגה במהירות של 10 מיקרוליטר לדקה למשך 10 דקות כדי להחליף את התמיסה במיקרו-ערוצים.
לאחר מכן, הפחת את קצב הזרימה למיקרוליטר אחד לדקה. סגור את שסתומי יחידת בקרת הלחץ למשך שתי שניות ולאחר מכן פתח את השסתומים ועצור את משאבת המזרק. הניחו למכשיר לשבת שעה לפני הקלטת תמונות קונפוקליות.
כדי להתחיל בהכנת תא בקרת הטמפרטורה, חבר תחילה אביזרי צינור דוקרניים למכלול זרימת חום מאלומיניום עם חלונות כיסוי בעובי שני מילימטרים. חבר מרווח גומי לאחד מהחלקות הכיסוי ליצירת תא התצפית. טען 100 מיקרוליטר ממתלה ה- GUV לתא התצפית ואטום את החדר בעזרת כיסוי.
הפוך לאט את ההרכבה. חבר את תא האלומיניום לאמבט מים חיצוני. הרכיב את המכלול על שלב דגימת מיקרוסקופ.
הגדר את אמבט המים החיצוני לטמפרטורה הנמוכה ביותר הרצויה ואפשר למערכת להתאזן למשך 10 עד 15 דקות. רכוש תמונות של ה-GUVs וקבע את מצבי הפאזה בטמפרטורות שונות. GUVs הוכנו מיחסים משתנים של DOPG וספינגומיאלין ביצה וכולסטרול בתמיסות סוכרוז או מלח סימטריות.
מצבי הפאזה הדומיננטיים שלהם נקבעו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. קומפוזיציות נבחרות הועברו לאחר מכן לתנאים אסימטריים על ידי דילול כדי להעריך את תנאי הפתרון היעילים על התנהגות השלב. כדי להמשיך לחקור את התנהגות פאזת GUV בתמיסות אסימטריות, GUVs נלכדו במכשיר מיקרופלואידי, כדי לאפשר החלפה מלאה של התמיסה החיצונית.
ה-GUVs הלכודים הוערכו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לפני ואחרי חילופי הנוזלים. החלק של GUVs הומוגניים מופרדים פאזה נוטר על פני טווח טמפרטורות כדי להעריך את הטמפרטורה האפקטיבית על התנהגות שלב GUV. נצפה דפוס סיגמואידלי בנתונים, שהותאמו לאחר מכן למודל בולצמן.
הטמפרטורה שבה חלק ה-GUVs המופרדים פאזה היה 0.5 נקבע מהעקומה המותאמת. למרות ששיטות אלה יכולות לספק תובנה לגבי התנהגות פאזת הממברנה, היישומים יכולים לשמש גם לניסויים אחרים, כגון לחקר האינטראקציות בין ממברנות בביומולקולות בתנאים פיזיולוגיים.
סקירה
מחקר זה חוקר את ההשפעה של תנאי חיץ בעלי מליחות גבוהה על הפרדת פאזה נוזל-נוזל בווזיקולות חד-שכבתיות ענקיות טעונות (GUVs). המחקר מדגיש את החשיבות של אסימטריה של פתרון בין-ממברנלי וטמפרטורה בהבנת מאפייני הממברנה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביאופיזיקה
- ביולוגיה של ממברנות
רקע
- ווזיקולות חד-שכבתיות ענקיות (GUVs) הן מערכות מודל לחקר דינמיקה של ממברנות.
- תנאים פיזיולוגיים לרוב שונים משמעותית מהגדרות ניסוי.
- הבנת התנהגות הפאזה בממברנות היא חיונית להבנה של תהליכים תאיים.
- סביבות עם מליחות גבוהה יכולות לשנות את תכונות הממברנה ומצבי הפאזה.
מטרת המחקר
- להעריך באופן כמותי את ההשפעות של מליחות גבוהה ואסימטריה של פתרון בין-ממברנלי על מצבי פאזה של ממברנות.
- לפתח שיטות להכנת GUVs תחת תנאי חיץ פיזיולוגיים.
- לחקור את ההשפעה של אסימטריה של פתרון על מאפייני הממברנה והתנהגות הפאזה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת סרטי ליפידים על לוחות PTFE ואחריה הידרציה ליצירת GUVs.
- שימוש במכשירים מיקרופלואידיים ליצירת תנאי חיץ אסימטריים.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה להערכת מצבי פאזה של GUVs.
- ניתוח כמותי של מצבי פאזה על בסיס חלוקת הפלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- GUVs מציגות מצבי פאזה שונים על בסיס תנאי הפתרון.
- התנהגות הפאזה מושפעת הן ממליחות והן מאסימטריה בין-ממברנלית.
- השיטות שפותחו מאפשרות ניסויים מבוקרים בתנאים פיזיולוגיים.
- התוצאות מספקות תובנות על דינמיקה של ממברנות הרלוונטיות לסביבות תאיות.
מסקנות
- המחקר מדגיש את החשיבות של תנאים פיזיולוגיים במחקר ממברנות.
- הבנת הפרדת הפאזה ב-GUVs יכולה לסייע במחקרי ממברנות תאיות.
- מחקר עתידי יכול לבנות על השיטות הללו לחקר מערכות ביולוגיות מורכבות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding membrane phase behavior under physiological solution conditions is critical for de-risking target validation in membrane-associated drug discovery. This protocol enables assessment of how high-salinity and transmembrane asymmetry influence lipid domain stability, providing predictive confidence in early-stage mechanistic studies. By modeling physiologically relevant membrane environments, the approach supports translational continuity from discovery to preclinical evaluation of compounds targeting membrane proteins or lipid-dependent pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how solution conditions modulate lipid raft formation, informing hypotheses about membrane protein localization and signaling complex assembly.
- Operational Value: Enables controlled testing of transmembrane asymmetry effects, reducing false positives in target engagement assays conducted under non-physiological buffer conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates phase-separated GUVs as reproducible models for evaluating compound partitioning into liquid-ordered or liquid-disordered domains.
- Operational Value: Standardizes vesicle preparation under symmetric or asymmetric high-salinity conditions, improving assay robustness for fluorescence-based membrane interaction screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro phase behavior to physiological relevance, supporting risk-adjusted advancement of leads whose activity depends on membrane microenvironment.
- Operational Value: Provides a scalable method to assess temperature-dependent phase transitions, enabling correlation with preclinical efficacy or toxicity signals under varying physiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where membrane target validation requires mechanistic de-risking of lipid-dependent mechanisms, particularly for targets implicated in lipid raft-mediated signaling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding how solution asymmetry influences domain formation and protein recruitment to specific lipid phases.
- Screening: Delivers assay-ready GUV populations with quantifiable phase states, enabling reliable comparison of compound effects across solution conditions.
- Analytics: Produces fluorescence-based domain partitioning metrics that help teams compare compound behavior in ordered versus disordered membrane phases.
- Translational Research: Connects GUV phase stability to physiological temperature and salinity ranges, informing preclinical model selection for membrane-targeted interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for evaluating membrane microenvironment effects across multiple projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by revealing how ionic strength and gradient conditions alter membrane material properties relevant to drug binding.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized GUV formation and solution exchange protocols, minimizing variability in membrane-based assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying compounds whose activity is sensitive to physiological solution conditions, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of membrane-associated targets based on validated phase behavior under realistic extracellular and intracellular milieus.
Implementation Considerations
- Expertise in lipid film hydration, vesicle formation, and fluorescence microscopy interpretation is required to ensure accurate phase state assessment.
- Access to microfluidic systems and temperature-controlled chambers is necessary for implementing asymmetric solution conditions and thermal variation studies.
- Standardization across teams depends on consistent lipid composition, vesicle size selection, and imaging parameters to maintain comparability of phase state data.
- Adaptation to other model systems (e.g., different lipid mixes or protein-reconstituted vesicles) should consider potential alterations in phase transition temperatures and domain stability.
- Practical limitations include the need for careful avoidance of vesicle dilution during solution exchange and potential photobleaching during prolonged fluorescence imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Giant Unilamellar Vescicle (GUV) Preparation
3:02
Phase State Assessment with Fluorescence Microscopy
4:33
GUV Observation and Imaging with a Microfluidic Device
7:35
GUV Observations at Varying Temperatures
8:29
Results: GUV Phase Behavior
9:42
Conclusion
