השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית
1 בפברואר 2018
גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.
המטרה הכללית של שיטת הדילוג (leapfrogging) היא להקל על יצירת קווי מוטנטים עבור גנים החיוניים לעובר (embryogenesis). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בגנטיקה התפתחותית ובתחומים אחרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג מוטנטים בגנים חיוניים כבר בדור ה-F1.
כדי להתחיל בהליך זה, בצעו מיקרו-הזרקה לעוברי Xenopus בשלב התא הבודד עם קומפלקסים של Cas9-sgRNA כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. כאשר העוברים מגיעים ל-4.5 שעות לאחר ההפריה, בשלב בלאסטולה מוקדם תשע, הוציאו אותם מהאינקובטור בטמפרטורה של 25 degree Celsius כדי לאפשר להם להמשיך להתפתח בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל בהשתלה בחמש שעות לאחר ההפריה, השתמשו בפיפט פסטור כדי להעביר עוברי אחד שלא הוזרק לצלחת אגרוז של 60 millimeter המכילה שקעים, אשר תשמש כמקבל השבץ.
העבירו גם עובר תורם אחד של PGC לצלוחית. השתמשו בפינצטה כדי להסיר ידנית את המעטפות הוויטליניות (vitelline envelopes) מכל עובר. סובבו את שני העוברים כך שהקטבים הצמיחתיים (vegetal poles) שלהם יהיו גלויים ונגישים לניתוח.
בשלב הבא, תוך ייצוב העובר המקבל באמצעות לולאת השערה, הכניסו את הקצה החד של סכין שערת הגבה לקוטב הווגטלי, ממש מתחת לפני השטח. ובבתנועות חיתוך מהירות כלפי מעלה, בצעו ארבעה חתכים רדודים בצורת ריבוע, בתוך האזור שבו יתגבשו תאי הבקבוק העתידיים המסמנים את הבלסטופור. לאחר שארבעת צלעות הריבוע הוגדרו, השתמשו בסכין שערת הגבה כדי להעמיק כל חתך באמצעות תנועות חיתוך דומות, עד לעומק של כ-1/3 עד 1/2 מהמרחק לרצפת הבלסטוצלה.
שחררו את נתח הרקמה הצמחית (vegetal tissue explant) מהעובר המקבל על ידי ביצוע חתך אופקי אחד או יותר באזור הצמחי העמוק. לאחר מכן, בעבודת מהירות, חזרו על הליך זה בעובר התורם של ה-PGC כדי ליצור פיסת רקמה צמחית בגודל דומה להשתלה. ברגע שהרקמה המכילה PGCs הוסרה מהעובר התורם, השתמשו בסכין שיער הגבה ובלולאת שיער כדי למקם את הנתח בפתח שנוצר בעובר המקבל.
השתמשו במוט של סכין גילוח הגבות, כאשר הוא מוחזק במקביל לפני השטח של השתל, כדי ללחוץ בעדינות את השתל אל תוך הפתח שעל פני השטח הצמחוניים שלו שלו של העובר המקבל. השתמשו בלולאת השיער כדי להחליק בעדינות את גוף העובר התורם על פני שטח האגרוז אל תוך באר. ודאו שהפצע הפתוח בגוף פונה אל הנוזל.
החליקו את העובר המקבל לבאר סמוכה, ובדומה לכך, ודאו שרקמת הקוטב הווגטלי המושתלת פונה אל נוזל המצע. חזרו על השתלת ה-PGCs בעוברים נוספים כדי ליצור זוגות נוספים של תורם ומקבל, עד שהעוברים יגיעו לשלב גסטולציה מוקדם (שלב 10 בערך), תוך העברת העוברים לבארות ריקות עם ביצוע ההשתלות. לאחר שהשתלים יחלימו במקומם, בדרך כלל 30 עד 45 דקות לאחר ההשתלה, השתמשו בפיפט פסטור כדי להעביר בעדינות רבה את העוברים מהשקעים לבארות בודדות בלוחית של 24 בארות מצופה באגרוז.
סובב את העובריים כך שיהיו ממוקמים עם הקוטב הווגטלי כלפי מעלה, הפונה לעבר תמיסת המקור. מקם את גופות התורמים ואת מקבלי השתו Transplant בבארים סמוכות כדי לסייע במעקב אחר זוגות העובריים ורשום מידע זה. לאחר מכן, העבר את הפלטה בעלת 24 הבארים המכילה את העובריים לאינקובטור בטמפרטורה של 25 °C למשך לילה.
ביום למחרת, העבירו כל מקבל השתלה, הנמצא כעת בשלב ניצן הזנב המוקדם, לבאר בודדת בתוך פלטה חדשה בעלת שש בארות המצופה באגרגז. גדלו את העוברי ה-leapfrog ובצעו ניתוח של DNA התורם שהופק מהגופות בהתאם לפרוטוקול הכתוב. מכיוון ששיטת ה-leapfrogging מייצרת בעליים שבהם קו הנבט מוחלף ביעילות באללים מוטנטיים, ניתן לקבל פנוטיפים מוטנטיים כבר בדור F1.
כפי שמוצג בטבלה זו, Blitz et al. דיווחו כי רוב בעלי החיים מדור F0, ששוכו לאתר ה-tyrosinase, הדרוש לפיגמנטציה של מלאנוציטים והרטינה, הראו 100% מעבר בקו הנבט של גנומים מוטנטיים שמקורם בתורם, כפי שנמדד על ידי הכלאה עם בעלי חיים אלבינו עם tyr מינוס. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן השתלת תאי נבט ראשוניים של Xenopus.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
טכניקת ה-leapfrogging מקלה על יצירת קווי מוטציות עבור גנים חיוניים לאמבריוגנזה. שיטה זו מאפשרת יצירת מוטנטים הומוזיגוטים מסוג null בדור ה-F1, ובכך היא מתגברת על האתגרים שמציבות מוטציות קטלניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנטיקה התפתחותית
- הנדסה גנטית
- אמבריולוגיה
רקע
- גנים חיוניים (Essential genes) קריטיים להישרדות ומציבים אתגרים ביצירת קווי מוטנטים.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא להועיל עבור גנים הנדרשים במהלך התפתחות מוקדמת.
- שיטת ה-Leapfrogging משלבת עריכה גנומית עם השתלת תאי נבט.
- טכניקה זו מאפשרת את חקרם של גנים חיוניים ללא גרימת קטלנות.
מטרת המחקר
- להדגים את טכניקת ה-leapfrogging ליצירת שורות מוטנטיות.
- לספק שיטה למחקר של גנים חיוניים בתהליכי התפתחות.
- להקל על יצירה יעילה של מוטנטים הומוזיגוטים מסוג null.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה מיקרוסקופית של קומפלקסים של Cas9-sgRNA לעוברים של Xenopus.
- השתלה של תאי נבט מעוברים מוזרקים לעוברים מקבלים.
- ניטור התפתחות העוברים בשלבים שונים.
- שימוש בצלחות אגרוזה להשתכלות עוברים.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של בעלי חיים מסוג פרא (wild-type) הנושאים מוטציות בקו הנבט.
- ייצור יעיל של מוטנטים הומוזיגוטים חסרי תפקוד (null mutants) בדור ה-F1.
- הדגמה של שלב הש transplantation בתהליך ה-leapfrogging.
- תיקוף של יעילות השיטה בהתגברות על לטאליות.
מסקנות
- Leapfrogging היא טכניקה מבטיחה לחקר גנים חיוניים.
- שיטה זו מאפשרת לחוקרים לעקוף את הלתאליות של מוטציות בגנים חיוניים.
- יישומים נוספים של טכניקה זו עשויים לשפר את המחקר בתחום הגנטיקה ההתפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
דילוג (Leapfrogging) באמצעות השתלת תאי נבט ראשוניים מאיץ את יצירתם של קווי מוטציות המודuces על ידי CRISPR/Cas9 ב- Xenopus, ובכך נותן מענה ישיר לצווארי בקבוק בגנומיקה פונקציונלית של גנים חיוניים. גישה זו מאפשרת ניתוח פנוטיפי מהיר בדור F1, ובכך תומכת בתיקוף מוקדם יותר של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים במסלולי מחקר גנטיים והתפתחותיים. השיטה משפרת את הגמישות של פורטפוליו המחקר על ידי כך שהיא מאפשרת מחקר יעיל של גנים שבעבר לא ניתן היה לגשת אליהם בשל תמותה עוברית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה פונקציונלית של גנים חיוניים על ידי מעקיפה של קטלניות עוברית.
- תומך בהסרה של סיכונים מכניסטיים באמצעות ניתוח פנוטיפי ישיר של דור F1.
- מקל על בדיקה מהירה של השערות לגבי תפקוד גנים במסלולים התפתחותיים.
- משפר את רמת הביטחון החזויה לבחירת מטרות בשלבים מוקדמים של המחקר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק שורות נבט מוטנטיות שעברו תיקוף לצורך סריקת פנוטיפ המשך.
- מסטנדרט את הרקעים הגנטיים לצורך פיתוח בדיקות שחזירות.
- מאפשר ייצור בר-הרחבה של מוטנטים הומוזיגוטים או הטרוזיגוטים מורכבים.
- תומך בהערכה רבדית של תפקוד גנים במערכות מבוקרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם מחקרי תפקוד גנים הרלוונטיים למחלה במודלים של חוליתיים.
- מאפשר רציפות מגילוי גנטי ועד לאישור פנוטיפ פרה-קליני.
- מפחית סיכונים במחקר תרגומי על ידי הבהרה מוקדמת של חיוניות הגן.
- תומך בניתוח של גנים בעלי השפעה אימהית, ובכך מרחיב את התובנה התרגומית.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת בממשק שבין שלב הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת מעבר ישיר ממוטגנזה באמצעות CRISPR/Cas9 לאימות פנוטיפי בדור אחד.
- ביולוגיה של הגילוי: מאיצה את בדיקת השערת האפס ואת הבהרת המסלולים עבור גנים חיוניים.
- סריקה: מספקת עוברים הגדרתיים גנטית וניתנים לשחזור עבור בדיקות המשך.
- אנליזה: מספקת נתוני מעבר של קו הנבטה וקריאות פנוטיפיות כמותיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית עבור גנים בעלי השפעות התפתחותיות או אימהיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר ליצירה מהירה של קווי מוטסיינים עבור מגוון יעדי גנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החוזי ומפחית עמימות במחקרי תפקוד גנים.
- ערך תפעולי: מייעל את יצירת המוטציות, מסטנדרט את זרימות העבודה ומשפר את השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אפשור תיקוף תפקודי מוקדם של גנים חיוניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהזרקה מיקרוסקופית (microinjection), מניפולציות אמבריולוגיות ועריכה באמצעות CRISPR/Cas9.
- נדרש ציוד ייעודי לטיפול בעובריים ולהשתלה.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים להבטחת השחזוריות ושלמות הנתונים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- היעילות תלויה בתזמון מדויק ובטיפול נכון במהלך שלבי ההשתלה.
