Name: קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: חקור הפרדת חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאי תרבית באמצעות קוויטציית חנקן וצנטריפוגה דיפרנציאלית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק ללא שימוש במ detergents ומסייעת בחקר דינמיקת חלבונים תוך-תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי GM055279, CA116034 ו- CA163489.

1-מאגר וההכנות ציוד <ol><li>להירגע 45 מ ל תא הפרעה פצצות 15 מ"ל צינורות, צינורות ultracentrifugation ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>הכן ולהירגע 25 מיליליטר המגון מאגר לכל התאים 7 2 x 10-4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז מעכב טבליה אחת רק לפני השימוש. 
	הערה: מאגרי המגון מכילים אשלגן כלורי בדרך כלל יותר מאשר NaCl טוב יותר לשקף את הרכב מלח תאיים. מאגר המגון בשימוש פרוטוקול זה מורכב מ 10 מ מ HEPES ב- pH 7.4, 10 מ"מ אשלגן כלורי ו 1.5 מ"מ MgCl 2 (המכונים להלן מאגר המגון היפוטוניק). רוב מאגרי יכול להיות מותאם קוויטציה חנקן (ראה דיון).</li>
	<li>הכן ולהירגע 6 מ של 1 x Phosphate-Buffered מלוחים (PBS) מאגר עבור דגימה-4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז מעכב טבליות טריים לפני השימוש. 
	הערה: מאגר PBS בשימוש פרוטוקול זה מורכב מ 10 מ מ נה 2 HPO 4 ב- pH 7.4, מ מ 1.8 ח' 2 PO 4, 137 מ"מ NaCl ו 2.7 מ"מ אשלגן כלורי.</li>
	<li>הכן ולהירגע 4 מ"ל solubilization מאגר עבור דגימה על 4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז אחד מעכב לוח רק לפני השימוש. 
	הערה: מאגר Solubilization בשימוש פרוטוקול זה הוא 1 מאגר assay (ריפה) x Radioimmunoprecipitation, אשר מורכב של 25 מ מ טריס ב pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 0.1% מרחביות, 0.5% נתרן deoxycholate וב 1% NP-40. ראה הערה 4.6.</li>
</ol> 2. תא קציר <ol><li>לגדול 2 x 10 7-10 x 10 תרביות רקמה 9 תאים עם המומלץ תרבות המדיה עבור סוג התא. בדרך כלל, צלחת 15 ס מ אחת מניבה 2 x 10 7 תאים HEK-293 תרבותי ב- DMEM ב- 90% confluency ( איור 1).</li>
	<li>להסיר את מדיום הגידול על ידי ואקום.</li>
	<li>עבור תאים חסיד, למקם את הכלים תרבות על קרח, לשטוף את התאים ישירות על המנות תרבות בעדינות עם המגון צוננת מאגר פעמיים (10 מ ל מאגר לכל צלחת 15 ס מ לכל לשטוף), לקצור את התאים עם במגרדת תא גדול בתוך אמצעי אחסון המתאים של המגון המאגר; עבור תאים ההשעיה, לאסוף לשטוף בגדר תא במאגר המגון צוננת פעמיים (10 מ ל מאגר לכל 50-mL תרבות לכל לשטוף) עם ספין 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואתה resuspend בגדר תא שטף של אמצעי אחסון המתאים המגון מאגר על קרח. הערה: אמצעי האחסון צריך להיות מבוסס על הדרישות עבור ריכוז חלבון הניסויים המיועד, כמו גם את אמצעי האחסון מינימלי/מקסימלי מורשה להיכנס הפצצה הפרעה תא. קו מנחה כללי 2-10 x 10 7 תאים למ"ל, או גלולה בערך 10 כרכים של התא. פרוטוקול זה ממוטב עבור שלוש מנות 15 ס מ של תאים HEK-293 ב- 2 מ של מאגר המגון.</li>
</ol> 3. קוויטציה חנקן <ol><li>העברת התליה תא לפצצה צונן ונקי באמבט קרח למהומה צלחת- 
	התראה: הפצצה יש בלחץ גבוה, טמפרטורה נמוכה, גז חנקן &#8211; לענוד הגנה אישית המתאימה .</li>
	<li>מקום בר מיקרו מערבבים מגנטי בתוך הפצצה והפעל את הצלחת מערבבים כדי לשמור על הומוגניות ההשעיה.</li>
	<li>להוסיף טבליה אחת של מעכבי פרוטאז ההשעיה ולסגור את הפצצה לכל יצרן &#39; הוראה s.</li>
	<li>בהדרגה לדחוס את הפצצה עם מיכל גז חנקן לכל יצרן &#39; s הוראה עד מד הלחץ פצצה קורא psi 300 עד 600. סגור שסתומים ונתק את מיכל החנקן. 
	הערה: הלחץ הנדרש עשוי להשתנות עם סוג התא. כאן ביצענו קוויטציה בבית 350-400 psi עבור תאים HEK-293, NIH-3T3, Jurkat.</li>
	<li>לחכות 20 דקות לאפשר את החנקן להמיס ולהגיע שיווי משקל בתוך התאים.</li>
	<li>להסיר את עודף המים בסביבת שסתום פריקה באמצעות מגבת בד. פתח את שסתום פריקה בעדינות כדי להשיג פרסום dropwise של homogenate לאסוף צינור טרום מקורר 15 מ"ל. 
	הערה: לקראת סוף אוסף יהיו כמה טיפות שם של homogenate, גז להגיח עם צליל השריקה. ודא כי הגז אינה סיבה שנאספו בעבר cavitate לירות מתוך הצינור (ומכאן השימוש 15 מ"ל צינורות במקום 1.5 mL צינורות). ברגע פרץ מתחיל, סגור את השסתום השחרור ופתח את שסתום כניסת חנקן בפתאומיות כדי להפחית לחץ הפצצה ולהשיג קוויטציה של התאים הנותרים הפצצה. פתח הפצצה על cavitate ניקוי יסודי ושחזור. 
	הערה: cavitate הסופי צריך להיות מראה חלבי עם קצף על העליונה. מערבבים בעדינות עם טיפ פיפטה כדי לאפשר את הקצף תתארך לפני צנטריפוגה. 
	הערה: לבחון את cavitate על ידי ניגודיות שלב מיקרוסקופ כדי לקבוע את היעילות המגון. להוסיף טיפה 15 µL של cavitate על פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ וכן כיסוי עם coverslip. וחזור על שלב מספר תאים רצופה 3.4-3.6 רק אם רבים מדי מזוהים עם יעד X 20- 
	הערה: אם מאגר המגון אינה מכילה EDTA או EGTA, להוסיף את שנאספו cavitate-ריכוז סופי של 1 מ מ בתוך 5 דקות אחרי השחרור.</li>
</ol> 4. הפרדת ממברנה שברים Cytosolic <ol><li>צנטריפוגה cavitate-500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר תאים רצופה ואת הגרעינים. 
	הערה: חזור על השלב צנטריפוגה עד אין גלולה גלוי מופק ולאסוף את הפוסט גרעיני Supernatant (מערכת העצבים ההיקפית) תוך הימנעות הקצף שצף מעל. Centrifuge מחדש את הקצף נוספות לאסוף, לשלב מערכת העצבים ההיקפית, במידת הצורך ( איור 1).</li>
	<li>לעבד את מערכת העצבים ההיקפית לפי הצורך כדי לקבל שברים של עניין. לצורך הפרדת cytosolic ממברנה שברים, להעביר את מערכת העצבים ההיקפית צינור ultracentrifuge ולבצע ultracentrifugation לפי הצורך. פרוטוקול זה מיטבית &#60; מ ל 3.5 מדגם צינור ultracentrifuge פוליקרבונט ועבור ultracentrifugation-350,000 g x עבור h 1-4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע (השבר S) באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף היטב את גלולה עם 3 מ"ל של PBS קר מבלי להפריע זה. הסר את PBS על ידי ואקום. 
	הערה: אם זיהום של השבר הממברנה על ידי חלבונים cytosolic היא דאגה גדולה יותר מאשר אובדן הדגימה, resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של PBS, re-ultracentrifuge כמו שלב 4.2 קר. הסר את PBS על ידי ואקום.</li>
	<li>Resuspend בגדר מלאה של אמצעי אחסון מתאים המכילים חומרי ניקוי solubilization מאגר של בחירה. כדי להשיג שקילות תא, להשתמש באותו אמצעי אחסון של מאגר solubilization השבר cytosolic. 
	הערה: אנו מציעים באמצעות מאגר x RIPA 1 כמו מאגר solubilization להפקת חלבון ממברנה יעיל. אם אין assay במורד הזרם נדרשת עבור ממברנה שבר, השתמש מאגר מדגם x laemmli 1 לחילוץ חלבון ממברנה מקסימלי. 
	הערה: אנו מציעים הם מוציאים והעברת בגדר במאגר solubilization על צינור נקי על שפופרת מסובב ב 4 ° C לחילוץ חלבון ממברנה מקסימלי. 
	הערה: אם בגדר הוא דביק מדי (מדי שומנים) ביעילות יוסרו מ- thהרכבת התחתית במאגר solubilization e ultracentrifuge, אנו מציעים snap קפוא בגדר חנקן נוזלי, במהירות מוציאים בגדר מהצינור ultracentrifuge עם מרית מתכת מיני לפני בגדר מפשירה. 
	הערה: לחלופין, ממברנה כדורי יכול להיות רק resuspended, לא solubilized במאגר המכילה אבקת לייצר חלקיק P קרום שלפוחית ההשעיה, שבו במקרה צנטריפוגה מקומו 4.6 אינה נדרשת. שברים כאלה P שימושיים בחקירת פונקציות כגון פעילות האנזים התלויות ממברנה האגודה-</li>
	<li>Centrifuge התליה גלולה באופן מלא solubilized מהשלב 4.5 ב g 20,000 x ומפרידה שולחן 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאסוף את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של 1 מ"ל (השבר P) ולמחוק בגדר (ליפידים קשי תמס).</li>
	<li>לבצע מבחני הרצוי כגון סופג המערבי עם שברים cytosolic ו/או קרום, או לשמור אותם ב- 80 ° C לשימוש עתידי.</li>
</ol>

<ol><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+on+the+move%3A+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li>
<li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).</li>
<li>Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+plasma+membranes.+I.+High-yield+purification+of+human+neutrophil+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation+and+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation.</a> J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).</li>
<li>Philips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+molecular+weight+GTP-binding+proteins+in+human+neutrophil+granule+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).</li>
<li>Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospholipides+of+Ehrlich+ascites+carcinoma+cells%3A+composition+and+intracellular+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution.</a> Cancer Res. 20, 397-402 (1960).</li>
<li>Hunter, M. J., Commerford, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+homogenization+of+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Pressure homogenization of mammalian tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).</li>
<li>Wallach, D. F., Kamat, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+Cytoplasmic+Membrane+Fragments+from+Ehrlich+Ascites+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).</li>
<li>Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).</li>
<li>Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+5-lipoxygenase+to+the+nucleus+of+unstimulated+rat+basophilic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells.</a> J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).</li>
<li>Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li>
<li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1-interacting+adapter+molecule+%28RIAM%29+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li>
<li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li>
<li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li>
<li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li>
<li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature%2C+tubulin+concentration%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

היתרונות של חנקן קוויטציה על פני שיטות אחרות של שיבוש מכני הן מגוונות. אולי היתרון המשמעותי ביותר הוא היכולת שלה בעדינות אך ביעילות homogenize דגימות. העקרונות הפיזי של דגימות מתקרר הלחץ במקום ביצירת הנזק חימום מקומי כמו אולטרה סאונד, חיכוך/הטיה המבוסס על טכניקות. קוויטציה הוא גם יעיל מאוד-שיבוש קרום פלזמה. מכיוון חנקן נוצרות בועות בתוך כל תא בודד על ביטול דחיסה, תהליך קוויטציה מוגבל פחות לפי גודל התא, לטעום גודל או לטעום ריכוז. לכן הוא מציע יתרונות נוספים על פני דאונס מבוסס-אישור או מחט מעבר המגון. חנקן קוויטציה מציע גם...

החלבונים ניתן לחלק לשתי קבוצות: אלה המשויכות ממברנות ואלה שאינם. Non-הממברנה חלבונים הקשורים נמצאים ציטוזול, נוקלאופלזמה, לומינה של organelles כגון תוך-פלזמית (ER). ישנם שני סוגים של חלבונים הקשורים ממברנה, נפרד ואת היקפי. חלבוני ממברנלי אינטגרלי מכונים גם חלבונים transmembrane כי אחד או יותר חלקי פוליפפטיד משתרע על הקרום, בדרך כלל בתור מורכב של חומצות אמינו הידרופוביות סליל α. חלבונים transmembrane co-translationally מוכנסים לתוך ממברנות במהלך ביוסינטזה שלהם ולהישאר שתצורתו נקבעה כל כך עד שהם אינם catabolized. חלבוני ממברנה פריפריאלי מונעים בגיחות לממברנות, בדרך כלל בעקבות השינוי post-translational עם מולקולות הידרופוביות כגון שומנים. בניגוד ממברנלי אינטגרלי חלבונים, השיוך של חלבוני ממברנה פריפריאלי ממברנות הסלולר הוא הפיך, יכול להיות מוסדר. פונקציית חלבוני ממברנה פריפריאלי רבים איתות המסלולים וחופש ההתאגדות מוסדר עם ממברנות הוא אחד למנגנון הפעלה או מעכבים שביל. דוגמה אחת של מולקולה איתות הוא חלבון ממברנה פריפריאלי היא GTPase קטן, ראס. לאחר סדרה של שינויים post-translational הכוללות שינוי עם ליפופרוטאין farnesyl, מוסיף ששונה קרבוקסילי של חלבון RAS בוגרת העלעל cytoplasmic של הממברנה התאית. באופן ספציפי, קרום פלזמה היא איפה RAS עוסקת שלה אפקטור במורד הזרם RAF1. כדי למנוע הפעלה המכונן של חלבון מופעל mitogen קינאז (MAPK) מסלול, מספר רמות של שליטה של ראס נמצאים במקום. חוץ עיבוד ראס לא פעיל על-ידי hydrolyzing GTP ל- GDP, ראס הפעיל גם יכול להשתחרר מן קרום פלזמה על-ידי שינויים או אינטראקציות עם solubilizing גורמים כדי לעכב איתות. למרות פלורסנט הדמיה חיה מעניקה תא ביולוגים את ההזדמנות כדי לבחון את ההתאמה subcellular של חלבוני ממברנה פריפריאלי מתויג החלבון הניאון1, נותר צורך קריטי כדי להעריך את קרום התאחדות חלבונים אנדוגני באופן כמותי למחצה עם גישות ביוכימיים פשוטים.
הערכת הביוכימי נאות חלבון מחיצות בין קרום ושברים מסיס הוא ביקורתי תלויה בשני גורמים: המגון הסלולר והפרדה יעיל של קרום ושברים מסיסים. למרות פרוטוקולים מסוימים, כולל ערכות ממוסחר הנפוצה ביותר, תלוי המגון תא מבוססי דטרגנט, שיטות אלה ניתן לערפל ניתוח על-ידי חילוץ קרום חלבונים לתוך מסיסים שלב2. בהתאם לכך, שיטות המבוסס, מכני ללא חומרי לשבירת תאים לספק תוצאות הניקוי. ישנן מספר שיטות של שיבוש מכני של תאים גדלו בתרבות או שנקטפו דם או איברים. אלה כוללים דאונס המגון, הפרעה מחט בסדר, המגון תנודה, sonication קוויטציה חנקן. כאן נוכל להעריך חנקן קוויטציה להשוות אותו בשיטות אחרות. חנקן קוויטציה מסתמך על חנקן אשר התפרקה בציטופלסמה של התאים בלחצים גבוהים. לאחר equilibration, התליה תא חשוף בפתאומיות הלחץ האטמוספרי כך נוצרות בועות חנקן בציטופלסמה זה כשהבנו את התא כתוצאה בתסיסת שלהם. אם הלחץ הוא מספיק גבוה, חנקן בתסיסת יכול לשבש את גרעין3 , ממברנה מאוגדים organelles כמו lysosomes4. עם זאת, אם הלחץ נשמרת נמוכה מספיק, הלחץ ישבש קרום פלזמה ו אר אבל לא organelles אחרים, ובכך לשפוך ציטוזול והן organelles cytoplasmic בשלמותם לתוך homogenate המיועד cavitate5. מסיבה זו, חנקן קוויטציה היא השיטה של בחירה עבור בידוד organelles כמו lysosomes והמיטוכונדריה.
עם זאת, זה גם דרך מצוינת של הכנת homogenate כי ניתן להפריד בקלות לתוך קרום ושברים מסיסים. הספינה לחץ (נקרא מעתה ואילך "הפצצה") ששימש קוויטציה מורכב מעטפת פלדה אל חלד עבה זה עומד בלחץ גבוה, עם מעין שקע בחופו עבור משלוח של הגז חנקן טנק ויציאת שקע עם שסתום פריקה מתכוונן.
חנקן קוויטציה שימש עבור תא המגון מאז שנות ה-606. בשנת 1961, צייד ו Commerfold7 נוסדה קוויטציה חנקן כמו אפשרות מעשית עבור רקמות יונקים השיבוש. מאז, חוקרים יש להתאים את הטכניקה כדי תאים ורקמות שונים עם הצלחה, חנקן קוויטציה הפך למרכיב ביישומים מרובים, כולל ממברנה הכנה8,9, גרעין, אברון הכנה10,11, חילוץ הביוכימי יציב. כעת, ביולוגים תא לעתים קרובות יותר להעסיק בשיטות אחרות של התא המגון כי היתרונות של חנקן המגון יש לא היה נרחב מפורסם, פצצות חנקן יקרים יש תפיסה מוטעית זו מספר גדול יחסית של תאים נדרש. פורסמו הפרוטוקולים עבור חנקן קוויטציה להשגת homogenates נטול תאים עם גרעינים שלמים, הערכות שפורסמו ביותר שימשו כרכים של 20 מ"ל של התא השעיה. להסתגל טכניקה קלאסית זו כדי להתאים לדרישות הנוכחי של עבודה עם דוגמאות בקנה מידה קטן, אנו מציגים פרוטוקול שונה של חנקן קוויטציה שתוכננה במיוחד עבור תאים בתרבית. לאחר קוויטציה חנקן, homogenate מחולק מסיסים (S) ושברים ממברנה (P) על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, תחילה עם ספין במהירות נמוכה כדי להסיר גרעינים ותאים רצופה, ולאחר מכן עם ספין במהירות גבוהה (&#62; g 100,000 x) כדי להפריד בין ממברנות של השבר מסיסים. לנו לנתח את יעילותו של ההפרדה עם immunoblots ולהשוות קוויטציה חנקן עם טכניקות טיפול נוספות שיבושים מכניים. אנחנו גם osmotic חיקרו את השפעת העלאת מאגר המגון במהלך קוויטציה חנקן.

<table><tbody><tr><td>כלי שיבוש תאים (45 מ"ל)</td><td>מכשיר Parr</td><td>4639</td><td>הומוגנייזר פצצת קוויטציה חנקן</td></tr><tr><td>(2 מ"ל)</td><td>קונטס</td><td>885300-0002</td><td>עלי וצינור Dounce</td></tr><tr><td>U-100 מזרק אינסולין 28G&frac12;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>329461 Needle</td></tr><tr><td>Atg12 נוגדן</td><td>Santa Cruz</td><td>271688</td><td>נוגדן עכבר, השתמש ב-1:1000 דילול</td></tr> <tr><td>ובטא;-נוגדן אקטין</td><td>Santa Cruz</td><td>47778</td><td>נוגדן עכבר, השתמש ב-1:1000 דילול</td></tr> <tr><td>ובטא;-נוגדן טובולין</td><td>DSHB</td><td>E7-s</td><td>נוגדן עכבר, השתמש ב-1:5000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן Calnexin</td><td>Santa Cruz</td><td>23954</td><td>נוגדן לעכבר, שימוש בדילול 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן Calregulin</td><td>Santa Cruz</td><td>373863</td><td>נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000</td></tr><tr><td>דילול נוגדן קטלאז</td><td>Santa Cruz</td><td>271803</td><td>נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן CIMPR</td><td>Abcam</td><td>124767</td><td>נוגדן ארנב, שימוש ב-1:1000 דילול</td></tr><tr><td>EEA1 נוגדן</td><td>Santa Cruz</td><td>137130</td><td>נוגדן לעכבר, שימוש בדילול 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן EGFR</td><td>Santa Cruz</td><td>373746</td><td>נוגדן עכבר, שימוש בדילול 1:1000</td></tr><tr><td>F0-ATPase נוגדן</td><td>Santa Cruz</td><td>514419</td><td>נוגדן עכבר, שימוש בדילול 1:1000</td></tr><tr><td>F1-ATPase נוגדן</td><td>Santa Cruz</td><td>55597</td><td>נוגדן עכבר, שימוש בדילול 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן</td> <td>פיברילריןנוגדן עכבר סנטה קרוז</td><td>374022</td>, <td>שימוש ב-1:200 דילול</td></tr><tr><td>גולג'ין 97 נוגדן</td><td>סנטה קרוז</td><td>59820</td><td>נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000</td></tr><tr><td>דילול נוגדן HDAC1</td><td>סנטה קרוז</td><td>81598</td><td>נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000</td></tr><tr><td>דילול Hexokinase 1 נוגדן</td><td>איתות תאים</td><td>2024S</td><td>נוגדן ארנב, שימוש ב-1:1000</td></tr><tr><td>דילול Lamin A/C נוגדן</td><td>נוגדן עכבר סנטה קרוז</td><td>376248</td>, <td>השתמש בדילול 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן LAMP1</td><td>DSHB</td><td>H4A3-c</td><td>נוגדן עכבר, השתמש בדילול 1:1000</td></tr><tr><td>Na+/K+ נוגדן ATPase</td><td>Santa Cruz</td><td>48345</td><td>נוגדן עכבר, השתמש בדילול 1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן Rab7</td><td>Abcam</td><td>137029</td><td>Rabbit, השתמש בדילול 1:1000</td></tr><tr><td>Rab9 נוגדן</td><td>Thermo</td><td>MA3-067</td><td>נוגדן לעכבר, שימוש ב-1:1000 דילול</td></tr><tr><td>RCAS1 נוגדן</td><td>Santa Cruz</td><td>398052</td><td>נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000</td></tr><tr><td>דילול נוגדן RhoGDI</td><td>Santa Cruz</td><td>360</td><td>נוגדן ארנב, שימוש ב-1:3000</td></tr><tr><td>דילול חלבון ריבוזומלי S6 נוגדן</td><td>Santa Cruz</td><td>74459</td><td>נוגדן עכבר, שימוש ב-1:1000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן Sec61a</td><td>Santa Cruz</td><td>12322</td><td>נוגדן עיזים, שימוש ב-1:1000 דילול</td></tr> צינור <tr><td>אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט עבה דופן</td><td>בקמן קולטר</td><td>349622</td><td>צינור לדוגמא לאולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>רוטור TLK-100.3</td><td>רוטור 349481 בקמן קולטר</td><td></td><td>לאולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>אופטימה MAX אולטרה-צנטריפוגה אישית בעלת קיבולת גבוהה</td><td>בקמן קולטר</td><td>364300</td><td>אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>cOmplete מעכב פרוטאז טבליות קוקטייל</td><td>מעכבי פרוטאז</td><td>Roche</td><td>11697498001</td></tr><tr><td>מגרדי תאים עם ידית 25 ס"מ ולהב 3.0 ס"מ</td><td>קורנינג</td><td>353089</td><td>מגרד תאים גדול</td></tr><tr><td>מגנטי Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57SIX</td><td>מיקרו ערבוב בר</td></tr><tr><td>קרמיקה-למעלה בוחש מגנטי</td><td>פישר S504501AS</td><td></td><td>מערבל מגנטי</td></tr></tbody></table>

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

תאים בתרבית שימושיים ללימוד ההתפלגות subcellular של חלבונים, כולל ממברנה פריפריאלי חלבונים. גנטית מקודד fluorescently חלבונים מתויג מהפכה בחקר התפלגות חלבון subcellular. עם זאת, קשה לכמת את ההתפלגות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, במיוחד כאשר חלבונים הם cytosolic חלקית. יתר על כן, חשוב תדירות ללמוד חלבונים אנדוגני. מבחני ביוכימיים כגון immunoblots נשארים תקן הזהב על כימות של חלבון הפצה אחרי subcellular fractionation. למרות שיש קיטים מסחריים שואפים לבודד cytosolic או שברים קרום מסוימים, רוב ערכות אלה מבוססים על חילוץ עם דטרגנטים, אשר עשויים להיות מתאימים ללמוד חלבוני ממברנה פריפריאלי בקלות שחולצו מן ממברנות. כאן אנו מציגים עבור הסלולר המגון פרוטוקול ללא חומרי ניקוי על-ידי חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מכורך מאת ultracentrifugation. אנחנו לאשר את ההפרדה של organelles subcellular ב מסיסים ושברים גלולה בכל סוגי התאים, והשווה חלבון החילוץ בין מספר שיטות מקובלות שאינן מבוססות על חומרי ניקוי המגון מכני. בין מספר יתרונות של חנקן קוויטציה הוא יעילות מעולה של שיבוש הסלולר עם מינימום נזק פיזי וכימי organelles עדין. בשילוב עם ultracentrifugation, חנקן קוויטציה זו שיטה מצוינת לבחון את השינוי של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין cytosolic ושברים ממברנה.

איור 2 מציג את חלוקת החלבונים של מערכת העצבים ההיקפית לתוך שבר cytosolic מסיסים (S) או שבר צניפה ממברנה (P). בדקנו שלוש שורות תאים נציג מכל סוגי תאים שונים: HEK-293 (אפיתל) NIH-3T3 (פיברובלסט), Jurkat (לימפוציטים). רו גואנין דיסוציאציה מעכב (RhoGDI), ללא תלות הקטיון מנוז-6-פוספט קולטן (CIMPR) שימשו בקרים חיוביים ל cytosolic ושברים ממברנה, בהתאמה. אישרנו את ההפרדה יעיל של ציטוזול ואת קרום לאחר חנקן קוויטציה ב ~ 350 psi במאגר היפוטוניק ואחריו ultracentrifugatio...

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור ללא דטרגנט המגון בתרבית תאים בתרבית של מבוסס על חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מאוגד על-ידי ultracentrifugation. שיטה זו היא אידיאלית עבור ניטור חלוקה למחיצות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין מסיסים ושברים ממברנה.

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה ניסיונית זו היא לבצע הומוגניזציה אופטימלית של תאים בתרבית ולנתח את החלוקה של חלבונים תאיים בין מקטעי ממברנה למקטעים מסיסים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לאחד האתגרים המרכזיים בביולוגיה של התא, והוא המיקום התת-תאי של חלבונים היקפיים של הממברנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לזהות באופן רב-שחזור חלוקה של חלבונים אנדוגניים בין מקטעים מוצקים למקטעי ממברנה, בדיוק רב וללא שימוש בדטרגנטים.כדי להתחיל, גדלו תאי HGK293 עד להגעה ל-90% confluency, כך שהתנובה לכל צלחית אחת בקוטר 15 סנטימטרים תהיה כ-2 x 10⁷ תאים כאשר הם גודלים ב-DMEM בטמפרטורה של 37 °C, עם 5% carbon dioxide. לאחר מכן, שאבו את מצע הגידול באמצעות ואקום. בשלב הבא, הניחו את צלחיות התרבית על קרח ושטפו בעדינות את התאים פעמיים בתוך צלחיות התרבית בעזרת 10 milliliters של באפר הומוגניזציה קר לכל צלחית.לאחר השטיפה, השתמשו במגרדת תאים גדולה כדי לקצור את התאים, תוך שימוש בנפח מתאים של בופר הומוגניזציה. כעת, העבירו את סספנסיית התאים למכשיר פירוק תאים (homogenizer) נקי ומקורר מראש, המוצב בתוך אמבט קרח על פלטת ערבול. כדי לשמור על הומוגניות הסספנסיה, הכניסו למכשיר מדמגנט מיקרוסקופי והפעילו את פלטת הערבול.לאחר מכן, הוסיפו טבליות מעכבת פרוטאז אחת לתמיחה וסגרו את הבומבה בהתאם להוראות היצרן, כולל שלב קריטי של דחיפת

nitrogen-cavitation-differential-centrifugation-allows-for-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים את פעולת הנימים הרדיאלית הדיפרנציאלית של בדיקת ליגנד - טכניקה לסינון שיטתי בתפוקה גבוהה של נוקלאוטיד תוך-תאי חלבונים קושרי שליח שני. טכניקה זו מאפשרת קשירה ישירה של השליחים לחלבון המטרה בעל ביטוי יתר בליזט התא – תוך עקיפת הצורך בטיהור חלבונים.

פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של בדיקת ליגנד: טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי נוקלאוטיד חיידקי חלבונים תוך-תאיים קושרי שליח שני

כאן אנו מתארים שיטה חזקה לחלוקה של ממברנות פלזמה צמח לקרומים מסיסים עמידים וחומרי ניקוי חומרי ניקוי המבוססת על תערובת של ללא תווית וin vivo באופן מלא 15 N תרביות תאי thaliana ארבידופסיס שכותרתו. ההליך מיושם ללימודי proteomic השוואתיים להבין תהליכי איתות.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

כאן, פותחה בדיקת פלואורסצנציה כמותית חדשה כדי למדוד שינויים ברמת חלבון במיוחד בצנטרוזומים על ידי נורמליזציה של עוצמת הקרינה של החלבון לזו של תקן פנימי מתאים.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את קרום פלזמה, הציטופלסמה ואת המיטוכונדריה U937 תאים ללא שימוש צנטריפוגה במהירות גבוהה. טכניקה זו ניתן לטהר שברים subcellular הבאים בחינת לוקליזציה חלבון באמצעות immunoblotting.

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

מאמר זה מציג שיטות ליצירה, טיהור ובדיקת כימות של שלפוחיות. Caenorhabditis...

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

פרוטוקול פיצול זה יאפשר לחוקרים לבודד חלבונים ציטופלסמיים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות מתאי יונקים. שני השברים התת-תאיים האחרונים מטוהרים עוד יותר באמצעות שיפוע צפיפות איזופיקני.

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של bioreactor NMR כדי לשמור על תאים אנושיים אנקפסולציה קיימא עבור עד 72 שעות, ואחריו זמן נפתר בתוך התא NMR נתונים וניתוח. המתודולוגיה מוחלת כדי לפקח על אינטראקציות חלבון-ליגנד תאיות בזמן אמת.

ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי NMR כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות Bioreactor צפיפות תאים גבוהה

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים להכנת מדגם, הפחתת נתונים וניתוח נתונים במחקרי הד ספין נויטרונים (NSE) של ממברנות השומנים. תיוג דיטריום נבון של שומנים מאפשר גישה לדינמיקה שונה של ממברנה על קשקשי אורך וזמן מזוסקופיים, שעליהם מתרחשים תהליכים ביולוגיים חיוניים.

ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים כגשוש ייחודי לדינמיקה של קרום השומנים ואינטראקציות בין חלבון ממברנה

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

חקור הפרדת חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאי תרבית באמצעות קוויטציית חנקן וצנטריפוגה דיפרנציאלית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מדויק ללא שימוש במ detergents ומסייעת בחקר דינמיקת חלבונים תוך-תאית.

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

גלה סרטונים נוספים