באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לחקור את היווצרות דפנות אבי העורקים העוברי וסביב הלידה במהלך התפתחות תקינה וכן הפרעות בתהליך זה במהלך המחלה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות כלי הדם כגון, מהו מקור התאים התורמים למדיום כלי הדם העוברי והפרינטלי. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא בכך שהן מאפשרות להעריך את הפתוגנזה והמורפוגנזה של השריר החלק המתרחשים בשלבי ההתפתחות העובריים והפרינטליים.

ההשלכות של טכניקות אלו נובעות לטיפול במחלות כלי דם כגון, היצרות אבי העורקים העל-וולוולרי של מחלה תקופתית הגורמת לייצור יתר של תאי סומו. הליך הצבת המשאבה המיני יבוצע על ידי ד"ר ג'יאשנג ז'אנג, מדען מחקר המנהל ליבת מיקרו-כירורגיה ואוניברסיטת ייל. התחל בהגדרת זוגות הזדווגות בין עכברים בני חודשיים עד שישה חודשים עם Cre ER ועכברים עם כתב Cre

בעזרת בדיקה מתכתית, בדוק אם יש פקקים בנרתיק בכל בוקר, המפריד בין הנקבה לזכר כאשר מתגלה פקק. לזירוז עוברי מוקדם, יש להזריק טמוקסיפן תוך צפקי ללחות ההריונית. כדי לסמן תאים באמצע עד סוף תקופת ההריון וכדי להתחקות אחר גורלם או שיבוטם בעכבר שלאחר הלידה, הזריק פרוגסטרון לחלל התוך צפקי של הלחות ההרה באופן לא מיומן עם טמוקסיפן ביחס של מנה אחת לשתיים.

כדי לקצור את העוברים בתאריך העוברי המתאים, יש לנקות את הבטן מהלחות ההריונית עם אתנול 70% ולהשתמש במספריים כדי לפתוח את הבטן כדי להסיר את הרחם. אסוף את העוברים מהרחם באמצעות מלקחיים ומיקרוסקופ סטריאו כדי להפריד אותם בזהירות מהשליה ושק החלמון. תקן את העוברים ב-4% פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן שלוש שטיפות ב- PBS כדי להסיר את הקיבוע העודף. לאחר השטיפה השלישית, דגרו את העוברים ב-30% סוכרוז ב-PBS, בצינורות בודדים של 15 מיליליטר עד שהעוברים שוקעים. לאחר מכן, מלאו תבניות הקפאה מפלסטיק בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית עד שני שליש מהנפח המרבי והניחו עובר אחד אנכית בכל תבנית.

לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, הקפיאו את הרקמות זקופות באמבט קרח יבש 70% אתנול והגדירו את טמפרטורת הקריוסטט ל-22 מעלות צלזיוס. חתכו את גושי הרקמה כדי ליצור פרוסות רקמה רוחביות בעובי של 10 עד 20 מיקרומטר דרך כל אבי העורקים, ולוכדים כל קטע על שקופית מיקרוסקופ זכוכית כפי שהם מתקבלים. לאחר שכל הדגימות נרכשו, יבש את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני אחסון של 80 מעלות צלזיוס.

כדי להכתים את דגימות הרקמה, יש להפשיר את השקופיות בטמפרטורת החדר, להגן עליהן מפני אור כדי למנוע הלבנת פלואורופור ולשטוף את השקופיות ב-0.1% PBS twin 20. לניתוח משובט, צבעו את הרקמות בצבע גרעיני מתאים ודמו ישירות את הפלרופורים האחרים של מדווח הקשת בענן, במיקרוסקופ פלואורסצנטי. למיפוי גורל, עם מדווח ה-mTmG cre, דמיין את ביטוי ה-GFP על ידי הדמיה ישירה עם או בלי צביעה חיסונית.

כדי לתרבית ולשתול אבי העורקים העוברי, הנח את העובר במצב שכיבה ואבטח את הגפיים המורחבות ללוח דיסקציה תחת מיקרוסקופ סטריאו. בעזרת מספריים, בצע חתך אנכי מהבטן דרך עצם החזה לבית החזה העליון. נתח את ריאות קנה הנשימה, הוושט, הכבד והמעיים העדינים ביותר.

השתמש במלקחיים כדי למשוך בעדינות את הלב בגחון, השתמש במספריים כדי לנתח את אבי העורקים הרחק מההיבט הגבי של חללי בית החזה והבטן. חותכים את אבי העורקים בשורש הפרוקסימלי ובמיקומי הבטן הדיסטליים כדי לשחרר אותו ולהניח את אבי העורקים שנקטף ב-PBS קר קר כקרח סטרילי במכסה המנוע של תרבית תאים. לאחר שטיפה קצרה, העבירו את אבי העורקים לבאר אחת של צלחת 24 בארות, המכילה מדיום DMEM בתוספת 0.5% PBS והניחו את הצלחת באינקובטור תרבית תאים עד 24 שעות.

בתום הדגירה יש לשטוף את אבי העורקים פעמיים עם PBS ולתקן את הרקמה ב -4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות. לאחר שלוש שטיפות PBS נוספות, העבירו את אבי העורקים לשפופרת של 1.5 מיליליטר המכילה 30% סוקרוזין PBS עד שהרקמה שוקעת. לבידוד תאי שריר חלק של אבי העורקים סביב הלידה, השתמש במחט בגודל 23 כדי לנקב את החדר השמאלי של עכבר 0.5 יום לאחר הלידה והשתמש בצינורות פלסטיק כדי לחבר את המחט למזרק סטרילי המכיל PBS, המוחזק אנכית במצב מוגבה, כך שה-PBS זורם לחדר השמאלי על ידי כוח הכבידה.

כאשר הכבד מסמין, השתמש במלקחיים כדי להסיר את הרקמה האדוונטיציאלית בחלק החיצוני של אבי העורקים ולקצור את אבי העורקים כפי שהודגם זה עתה. נתק את רקמת אבי העורקים ב -500 מיקרוליטר של תמיסת עיכול עם ניעור ידני כל חמש עד 10 דקות. לאחר 45 דקות, העבירו את הצינור למכסה תרבית תאים סטרילי והשתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשלש את תמיסת הרקמה עד לקבלת תרחיף תא בודד.

העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ולאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של DMEM ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של מדיום תרבית תאי שריר חלק וזרעו את התאים על צלחת תרבית של 35 מילימטר. לאחר מכן, הכניסו את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, ורעננו את מדיום תרבית התאים כל שלושה ימים.

כדי למקם משאבה מיני אוסמוטית תת עורית, התחל בגילוח הגב התחתון של עכבר מורדם בעזרת קוצץ והנח את העכבר במצב נוטה על צלחת כירורגית מחוממת. שפשפו את הגב בבטדין ואלכוהול איזופרופיל והניחו את העכבר מתחת למיקרוסקופ סטריאו. לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לבצע חתך עור אופקי של 0.5 עד סנטימטר אחד כשלושה עד חמישה סנטימטרים לבסיס הזנב, מבלי לפגוע בשריר הבסיסי.

הכנס המוסטט לחתך ופתח וסגור את לסתות המוסטט ליצירת כיס תת עורי. הכנס לכיס משאבה מיני אוסמוטית מלאה בחומר המעניין והשתמש ב-6 תפרים שאינם נספגים כדי לסגור את החתך. לאחר מכן, אפשר לעכבר להתאושש עם ניטור עד להשגת שכיבה חזה

עוברים מוטנטיים עבור הגן המקודד את חלבון המטריצה החוץ-תאית, אלסטין צוברים עודפי תאי שריר חלק בשכבות הפנימיות של אבי העורקים, החל מהיום העוברי 15.5. ניתוח שיבוט של תאי השריר החלק עם מדווח ה-cre הרב-צבעוני במהלך תהליך זה, מצביע על כך שהתאים הם במספר צבעים ולכן הם רב-שבטיים. צביעה חיסונית מגלה כי אבי העורקים העובריים המוטנטיים של אלסטין ביום 15.5 הופכים להיפר-שריריים וסטנודיים תוך 18 שעות מהתרבית, תהליך המוחלש על ידי הוספת נוגדן חוסם אנטי אנטגרין בטא 3.

תאי שריר חלק שבודדו מאבי העורקים של עכברים מסוג בר שלאחר יום הלידה 0.5 מבטאים סמני תאי שריר חלק אך לא CD31. עירוי רציף של מעכב אינטגרין בטא 3 ללחות בהריון החל מהיום העוברי 13.5, מחליש משמעותית את היצרות אבי העורקים ושרירי יתר בעכברים מוטנטיים לחלבון המטריצה החוץ-תאית, אלסטין. אבל אל תשנה את אבי העורקים של עכברים מסוג בר.

לאחר השליטה, ניתן להשלים את טכניקת מיקום המשאבה המיני האוסמוטית תוך פחות מ-10 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליכים אלה, ניתן גם להפיק אקסטרפולציה של גישות אלה כדי לחקור שרירים חלקים מקודדים, שאינם כלי דם כגון רקמת מערכת העיכול או אזורי הריאות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מיפוי התאמה עוברית in-vivo וניתוח משובט, אבי העורקים העוברי שהושתלו בתרבית, תאי שריר חלק אבי העורקים סביב הלידה ומשאבות מיני אוסמוטיות תת עוריות.

אל תשכח שעבודה עם עכברים, טמוקסיפן ומפחית קבוע עלולה להיות מסוכנת וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וחלוק מעבדה ונקיטת זהירות יתרה בעת ביצוע הליכים אלה.