ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible
25 באוקטובר 2017
פולימרים semiflexible להציג תכונות מכניות ייחודי המוחלות בהרחבה על ידי מערכות החיים. עם זאת, מחקרים שיטתיים על biopolymers מוגבלות מאז מאפיינים כגון הפולימר קשיחות אינם נגישים. כתב יד זה מתאר איך מגבלה זו הוא מצויין לתכנות צינוריות דנ א, הפעלת ניסיוני מחקרים על ההשפעה של פילמנט קשיחות.
המטרה הכוללת של מערכת מודל חדשה זו מבוססת DNA היא להבין את התכונות הבסיסיות של סוג של פולימרים גמישים למחצה, המתאר גם את ההתנהגות של סוג חיוני של ביופולימרים. שיטה חדשה זו מאפשרת לנו לחקור שאלות מפתח בתחום המטאפיזיקה הרכה, באופן ספציפי, היא מאפשרת לחקור את התנהגותם של חוטים גמישים למחצה וסידוריהם לרשתות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתכונות המכניות של חוטים תוך-חזותיים נגישות באופן ניסיוני וניתנות לכוונון מדויק.
פולימרים גמישים למחצה מוגדרים על ידי התכונות המיוחדות של החוטים שטופלו בעבר רק במסגרת התיאורטית בשל היעדר מערכות ניסוי מתכווננות. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי הכמות המגדירה של פולימרים גמישים למחצה, ניתן ליישם אותה גם כהידרוג'ל חדש לחקר נדידת תאים במטריצות בעלות קשיחות שונה מבלי לשנות את גודל הרשת שמתחת להנחה. ניתן לחשוב על היחידה החוזרת על עצמה הקטנה ביותר בננו-צינורית כעל טבעת יחידה.
כמה מטבעות היחידות הללו נערמות במהלך הכלאה. זה מוביל להיווצרות ננו-צינורות מוארכים. כדי להתחיל, השעו מחדש אוליגונוקלאוטידים ליופיליים במים מטוהרים ובצעו את שלבי ההשעיה מחדש הנוספים המפורטים במדריך המתאים של החברה.
התאם את כמות המים לקבלת ריכוז סופי של 200 מיקרומולר. קבע את הריכוז של גדילי ה-DNA הבודדים כדי לאמת את הערכים שניתנו על ידי המפיץ מכיוון שהסטוכיומטריה המדויקת חיונית לתהליך ההרכבה. בעזרת מיקרופיפטה, מערבבים את גדילי ה-DNA כל אחד מאותו ריכוז במיכל המתאים לתרמו-ציקלר ליצירת צינורות ה-DNA והסליל הרצויים.
הכלאה של צינורות ה-DNA והסליל בתרמו-סייקלר באמצעות הפרמטרים המצויים בפרוטוקול הטקסט. אחסן את צינורות ה-DNA והסליל ההיברידיים עד 3 שבועות ב-4 מעלות צלזיוס ללא השפלה ניתנת לזיהוי. לפני ביצוע ריאולוגיה, יש לדלל בזהירות את הדגימה לריכוז הסופי הרצוי באמצעות מאגר הדגימה במידת הצורך.
בחר גיאומטריה מתאימה לריאומטריון ההטיה הדינמי. לאחר מכן, טען את הדגימה על הריאומטר. כדי למנוע השפעות אידוי פוטנציאליות, הפציבו את ממשק האוויר והמים של הדגימה והסביבה באמצעות 1 מתוך 3 טכניקות.
או להקיף את הדגימה ב-2.5 מיליליטר של אמבט המאגר של הדגימה. לחלופין, הוסף חומר פעילי שטח ממש מתחת לריכוז המיצלה לדגימה. לחלופין, השתמש במזרק המילטון כדי להקיף את הדגימה בשומנים כדי למנוע מגע ישיר של הדגימה עם אוויר.
אטום את תא הדגימה בעזרת מכסה המצויד בספוגים רטובים. ואם אפשר, השתמש באמבט מים נוסף כדי לדכא עוד יותר את האידוי. התחל את המדידה באמצעות התוכנה הספציפית לראומטר בטמפרטורת החדר המאפשרת לדגימה להתאזן למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
זמן שיווי המשקל הוא קריטי כדי לאפשר למערכת התרמופלקט למצב אקראי איזוטרופי שלם מכיוון שזהו האישור היחיד המאפשר השוואה בין המדידות השונות. לאחר המדידה, עבד את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן 8 ציטוטים של 12 מיקרוליטר לכל דגימה באמצעות 1 עד 4 DNA מיקרומולרי לכל גדיל, 12.5 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד וצבע ג'ל חומצת גרעין 1x.
כמו כן, בצע בקרה שלילית ללא DNA, אך כלול את כתם הג'ל של חומצת הגרעין. העבירו את הקצבאות לצלחת PCR בזמן אמת ואטמו עם סרט דבק. צנטריפוגה את הצלחת ב 100 פעמים G למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר את בועות הגז.
זה קריטי להסיר את בועות הגז מכיוון שהוא יכול להתרחב במהלך המדידות ולא ניתן לנתח את הדגימות. לאחר צנטריפוגה, טען את הצלחת האטומה למערכת PCR כמותית בזמן אמת. תכנת תוכנית חישול לדנטורציה של ה- DNA בתשעים מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והורדת הטמפרטורה במהירות לשבעים ושתיים מעלות צלזיוס.
ואז הטמפרטורה צריכה לרדת לאט ב -0.5 מעלות צלזיוס כל שלושים דקות. לאחר שהאות דעך, האץ את רמפת הטמפרטורה. ודא שהמכסה של המחזורי מתחמם לפחות למאה מעלות צלזיוס כדי למנוע עיבוי של דגימה מאודה על סרט הדבק.
במהלך ההרכבה, עורר את הדגימות עם לייזר יון ארגון בארבע מאות שמונים ושמונה ננומטר וגלה את הקרינה בחמש מאות חמישים ננומטר בעת שימוש בצבע CY3. עבור צבעים אחרים, בחר שילוב פליטת עירור מתאים. מדוד את אות הקרינה בתדירות גבוהה ככל האפשר כדי להגביר את איכות האות הכוללת באמצעות המצלמה המובנית.
מוצגים נתונים גולמיים מייצגים של מדידה ריאולוגית החושפים את גמישות הרשת. מוצג כאן סחף הזמן בזמן שיווי משקל. תרשים זה חושף את ההתנהגות התלויה במתח של הרשת.
בתרשים זה ניכרת ההתנהגות התלויה בתדר של הרשת. בשלב זה נבחרים הערכים בתדירות מסוימת. הערכים עבור אוכלוסיית צינור סליל ה-DNA הספציפית שורטטו כנגד הריכוז.
תהליך זה חזר על עצמו עבור כל צינורות הדנ"א והסלילים. לאחר מכן חולץ המדרון בחלקת עץ עצומה שהניבה את מעריך חוק ההספק. לבסוף, הערכים הותוו מחדש כנגד האורך המתמשך עבור כל ריכוז שנמדד.
גרפים אלה מאפשרים חילוץ קנה המידה של מודול הרמה האלסטית ביחס לריכוז ואורך ההתמדה. לאחר הפיתוח, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום החומר הרך ופיזיקת הפולימרים לחקור את השפעת קשיחות החוטים על פולימרים גמישים למחצה. בעקבות הליך זה, ניתן לטפל בהשפעות נוספות כגון דקלום הרשתות הסבוכות, חציית רשתות באופן כללי ותהליך היווצרות מבנה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכליא ננו-צינורות DNA וכיצד למדוד את התכונות הריאולוגיות של הרשתות שלהם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מערכת מודל מבוססת DNA לבחינת פולימרים חצי-גמישים (semiflexible polymers), שהם חיוניים להבנת התנהגותם של ביו-פולימרים. השיטה מאפשרת גישה ניסיונית לתכונות המכניות של פולימרים אלו, ובכך מספקת תובנות לגבי הקשיחות שלהם והסידורים הרשתיים שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביו-פולימרים
- פיזיקה של חומר רך
- תכונות מכניות של פולימרים
רקע
- לפולימרים חצי-גמישים יש תכונות מכניות ייחודיות.
- מחקרים קודמים על פולימרים אלו היו בעיקר תיאורטיים.
- הבנת הנוקשות שלהם חיונית ליישומים ביולוגיים שונים.
- ננו-צינורות DNA ניתנים לתכנות מספקים גישה ניסיונית חדשה.
מטרת המחקר
- לבחון את התנהגותן של חוטים (filaments) גמיחים למחצה.
- לחקור את סידורם לרשתות.
- לספק מערכת ניסויית הניתנת לכוונון לצורך חקר תכונות מכניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח של ננו-צינורות DNA הניתנים לתכנות.
- כוונון ניסיוני של קשיחות הסיבים.
- יישום של המערכת לחקר הגירה של תאים בתוך הידרוג'לים.
- ניתוח של תכונות מכניות בהקשר של יצירת רשת.
תוצאות עיקריות
- ננו-צינורות ה-DNA מאפשרים בקרה מדויקת על קשיחות הסיב.
- הושגו תובנות לגבי התכונות המכניות של פולימרים גמישים למחצה.
- ניתן ליישם את השיטה כדי לחקור התנהגות תאים במטריצות בעלות קשיחות משתנה.
- תוצאות ניסיוניות תומכות בתחזיות תיאורטיות לגבי התנהגות פולימרים.
מסקנות
- מחקר זה מספק מסגרת חדשה להבנת פולימרים חצי-גמישים.
- ננו-צינורות DNA תכנוניים הם כלי בעל ערך עבור ביולוגיה ניסוית.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל שיטה זו ליישומים רחבים יותר בביופיזיקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
ננו-צינורות DNA תכנותיים מספקים מערכת ניסויית ניתנת לכיוונון לחקר פולימרים חצי-גמישים, ובכך נותנים מענה למגבלה מרכזית במידול מכניקה של ביו-פולימרים. הדבר מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף המטרה על ידי קישור קשיחות הסיבים להתנהגות הרשת הרלוונטית לסביבות תאיות. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים של אינטראקציות במטריקס חוץ-תאי ומערכות להובלת תרופות מבוססות הידרוג'ל.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר לבחון כיצד אורך התמדה (persistence length) משפיע על מכניקת הסיבים ועל היווצרות רשתות.
- ערך תפעולי: מספק מערכת יציבה וניתנת לכיוונון לאורך שבועות, ובכך מפחית את השונות בבדיקת השערות בשלבים מוקדמים.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף מטרות תפקודיות באמצעות מידול של ביופולימרים חצי-גמישים כגון actin בפורמט שניתן לשלוט בו.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטיים ראולוגיים כמותיים (מודול פלטאו אלסטי) המתואמים עם אורך התמדה וריכוז.
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה סטנדרטית של סיבים באורך מיקרוני עם קינטיקה של פולימריזציה הניתנת לשחזור.
- ערך מדעי: מקל על פיתוח בדיקות לסריקת תרכובות המשנות את המכניקה של רשת פולימרים חצי-גמישה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממדל את המכניקה של המטריצה החוץ-תאית כדי לחקור נדידת תאים בתוך הידרוג'לים בעלי קשיחות ניתנת לכיוונון, מבלי לשנות את גודל הרשת.
- ערך תפעולי: מאפשר אחסון לטווח ארוך (עד 3 שבועות ב-4°C) ללא התפרקות, מה שתומך בניסויים פרה-קליניים הנמשכים מספר ימים.
- ערך מדעי: מגשר בין מדידות של אורך התמדה של מולקולה בודדת לבין המכניקה של הרשת הכוללת (bulk network) לצורך רציפות תרגומית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, באמצעות אספקת פלטפורמה ניתנת לכיוון להערכת האופן שבו קשיחות הסיבים משפיעה על תוצאות ביולוגיות במבחנים תלויי-מטריצה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על התנהגות של פולימרים גמישים למחצה באמצעות כיוון ניסיוני מדויק של הקשיחות.
- סריקה: מספק מדדים ראולוגיים כמותיים וניתנים לשחזור המאפשרים סריקה אמינה של תרכובות במטריצות של הידרוג'ל.
- אנליטיקה: מפיק מעריכי חוק חזקה ויחסי קנה מידה בין המודול האלסטי, הריכוז ואורך ההתמדה לצורך השוואות מבוססות נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין קשיחות בקנה מידה מולקולרי למכניקה ברמת הרשת הרלוונטית להנדסת רקמות ולמחקרים על הגירה של תאים.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לחקר מכניקה של פולימרים גמישים למחצה לאורך פרויקטים מרובים בביופיזיקה ובחומרי ביולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי פולימרים חצי-גמישים על ידי אספקת מערכת מודל יציבה וניתנת לכיוונון.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של היברידיזציה, דילול וריאומטריה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות גו/נו-גו (go/no-go) בתכנון חומרי ביו-חומרים על ידי חיזוי מכניקת הרשת מתוך פרמטרי תכנון מולקולריים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום של פורמולציות הידרוג'ל מותאם-סיכון, המבוסס על קשרי מבנה-תכונה מתוקפים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהיברידיזציה של DNA, רהומטריה וכמותיות מבוססות פלואורסצנציה.
- נדרשת גישה לטרמוסייקליר, רהומטר גזירה דינמי ומערכת real-time PCR לצורך הרכבה ותיקוף.
- נדרש סטנדרטיזציה של ריכוזי אוליגונוקלאוטידים ותנאי מגנזיום כלוריד בין הצוותים.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת המכניקה של ננו-צינורות למערכות ביופולימר טבעי או הידרוג'ל.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך למנוע התאיידות במהלך רהומטריה ולהסיר בועות גז לפני אנליזת qPCR.
