בחיי עיר איפיון חלקיקים Boehmite במים באמצעות נוזלי SEM
27 בספטמבר 2017
אנו מציגים שגרה עבור הדמיה בזמן אמת וניתוח הרכב היסודות של חלקיקים boehmite במים יונים על-ידי בחיי עיר נוזלי מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה.
המטרה הכללית של הליך דימוי זה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) בנוזל in situ היא לספק ידע טכני לדימוי וניתוח יעילים של חלקיקים בנוזלים ב-SEM רגיל בוואקום גבוה, תוך שימוש במודול מיקרופלואידי תואם-ואקום. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המיקרוסקופיה והמיקרו-אנליזה, כגון כיצד לאפיין גודל ומורפולוגיה משתנים של חלקיקים המגיבים לשינויים סביבתיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להדמיות ישירות של חלקיקים פולי-דיספרסיביים בנוזל ללא ייבוש או הקפאה של הדגימה במצב של ואקום גבוה, וכן ללא צורך בשימוש ב-SEM סביבתי (environmental SEM).
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על ניתוח יעיל של חומרים נוזליים שונים ודגימות ביולוגיות באמצעות SEM, מכיוון שרבים מהם פועלים או קיימים רק במצב נוזלי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי ההרכבה הפשוטה והדימות in situ קשים ללמידה מכיוון שהם שונים מאלו של דגימות מוצקות רגילות. התחילו הליך זה בציפוי פחמן של המערכת לניתוח בממשק הוואקום הנוזלי, מכשיר ה-SALVI, כפי שמתואר בפרוטוקול הטכני.
קיבוע ההתקן המיקרופלואידי על במה ה-SEM הוא קריטי להצלחת ניתוח SEM של נוזלים in situ. ודאו שההתקן מקורקע כראוי ומאובטח כדי למזער את אפקט הטעינה לפני הניסוי. כדי לקבע את התקן ה-SALVI על במה ה-SEM, פתחו תחילה בזהירות את דלת תא הדגימות של ה-SEM לאחר השלמת תהליך הפריקה (venting).
בחרו את מחזיק הדגימות עבור ה-SEM. קבעו את המחזיק במרכז הבמה באמצעות הבורג והמפתח המשושה המתאימים. הניחו שני רצועות של סרט פחמן דו-צדדי על מחזיק הדגימות.
לאחר מכן, הדביקו את מכשיר ה-SALVI לסרט הפחמן שהונח על התומך, כאשר צד ממברנת הסיליקון ניטריד פונה כלפי מעלה. קיבעו את ה-SALVI בחוזקה לתומך הדגימה באמצעות שני רצועות נוספות של סרט נחושת בעל צד דביק אחד, כדי לקשור את בלוק ה-PDMS של ה-SALVI לתומך דגימות ה-SEM. בנוסף, השתמשו בסרטי הנחושת כדי לחבר את מסגרת הסיליקון ניטריד לתומך הדגימה המתכתי.
יש לוודא שהסרט לא מכסה לחלוטין את ממברנת הסיליקון ניטריד. כדי לבצע פינוי אוויר בתא הדגימה, סגרו את דלת תא הדגימה, בחרו במצב ואקום גבוה (high vacuum mode) בממשק המשתמש של תוכנת ה-SEM תחת דף בקרת הקרן (beam control page), ולחצו על כפתור השאיבה (pump) בדף בקרת הקרן כדי להתחיל את השאיבה. הפעילו לחץ ידני על דלת התא עד להשגת רמת הוואקום הרצויה.
בשלב הבא, צרו פתחים בממברנת הסיליקון ניטריד באמצעות קרן יונים ממוקדת (focused ion beam), או FIB, כפי שמתואר בפרוטוקול של הטכנאי. לאחר סיום הפרולגיה, כבו הן את קרן האלקטרונים והן את קרן היונים כדי לאפשר ניתוץ של התא, על ידי לחיצה על beam on כאשר אזור הדמיית הקרן המתאים מופעל. לחצו על vent בדף בקרת הקרן כדי לנקז את תא הדגימה.
פתחו בזהירות את דלת תא ה-SEM לאחר שפרוק לחלוטין מהוואקום, והשאירו את מכשיר ה-SALVI כפי שהוא על הבמה. שאבו מיליליטר אחד של מים דאיוניים למזרק סטרילי וחברו את המזרק לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי באמצעות מחבר צינור polytetrafluoroethylene. הזריקו את הנוזל באיטיות במשך שלוש עד חמש דקות.
חזור על תהליך זה שלוש פעמים תוך שימוש ב-1 ml של aluminum oxyhydroxide בריכוז 10 µg/mL כדי להבטיח שריכוז הדגימה לא ידולל על ידי המים הדאיוניים שהוטענו מראש. לאחר ההזרקה, הסר את המזרק. חבר את הכניסה והיציאה של SALVI באמצעות מחבר polyether ether ketone.
ייבשו כל נוזל שנשפך מחוץ ל-SALVI באמצעות מגבונים למעבדה. אם קיימות בועות בתוך הצינוריות או במיקרו-ערוץ, חזרו על הזרקת הדגימה עד שלא נראות בועות בתוך הצינוריות. לצילום תמונות באמצעות ה-ETD ובמצב אלקטרונים משניים, סגרו תחילה את דלת תא הדגימה.
לאחר יצירת הוואקום הרצוי בדלת התא כפי שבוצע קודם לכן, הפעילו את אזור דימות קרן האלקטרונים על ידי לחיצה על סמל ההפסקה (pause) בסרגל הכלים. הפעילו את קרן האלקטרונים על ידי לחיצה על כפתור beam on בדף בקרת הקרן. בחרו את ה-ETD ואת מצב האלקטרונים המשניים (secondary electron mode) לצורך הדימות מתוך התפריט הנפתח של הגלאי.
בבחירת התנאים האופטימליים, חשוב מאוד להיות מסוגלים להשיג תמונות באיכות גבוהה. בעבודה זו, נציג סט של תנאים המתאימים לדימות אלקטרונים משניים של יסודות קלים כגון אלומיניום וסיליקון. בעת ניתוח יסודות אחרים כגון ברזל וניקל, יש לשנות את תנאי ההפעלה כדי למטב את דימות האלקטרונים המשניים.
הגדירו את מתח ההאצה ל-8 keV ואת זרם האלומה לכ-0.47 nA באמצעות תיבות הבחירה המתאימות המוצגות בסרגל הכלים של ממשק המשתמש (GUI) באזור דימוי אלומת האלקטרונים. הגדירו את מרחק העבודה ל-7 mm על ידי הקלדת המספר 7 בתיבת הטקסט של קואורדינטת Z בדף הניווט כאשר המרחק בפועל נבחר. הגדילו את התכונה לפי 1,000 X וסובבו את כפתורי הניגודיות, הבהירות, הכיוון הגס והכיוון העדין בממשק המשתמש הידני כדי למטב את תמונת החלקיק.
מרכזו את החור הראשון בתמונה החיה של אזור דימוי אלומת האלקטרונים באמצעות סיבוב כפתורי ההזזה X ו-Y בלוח ממשק המשתמש הידני, והגדילו את התמונות עם החלקיקים להגדלה של 200, 000 X באמצעות סיבוב כפתור ההגדלה בלוח ממשק המשתמש הידני. בחרו ברזולוציית מסך של 1, 024 על 884 מתוך תיבת הרשימה בסרגל הכלים. לאחר מכן, הגדירו את קצב הסריקה ל-30 microseconds מתוך תיבת הרשימה בסרגל הכלים.
לחצו על מקש F4 כדי לצלם תמונה של התמונה הנוכחית המוצגת באזור הדמיון של קרן האלקטרונים. לחצו על מקשי Ctrl ו-S כדי לשמור את התמונה כקובץ TIF במיקום הרצוי עם שם הקובץ שהוגדר, כולל מספר רץ. הגדילו את שדה הראייה על ידי סיבוב כפתור ההגדרה כדי לאתר את החור הסמוך הבא.
חזור על פעולות אלו כדי לדמות את חלקיקי האלומינום אוקסיהידרוקסיד בשאר החורים. כדי לבצע אנליזה אלמנטרית באמצעות ספקטרוסקופיה של קרני X עם פיזור אנרגיה, או EDX, הכנס את גלאי הספקטרוסקופיה לפיזור אנרגיה אל תוך התא. בחר ב-ETD במסך הבקרה של המיקרוסקופ.
לאחר מכן, בחרו במצב אלקטרונים משניים לצפייה בדגימה באזור הדמיית קרן האלקטרונים והגדירו את הפרמטרים כפי שנעשה קודם לכן. הגדילו את חלקיקי האלומיניום אוקסיהידרוקסיד בכל חור בהגדלה של 200,000 X על ידי סיבוב כפתור ההגדלה בלוח ממשק המשתמש הידני. לאחר מכן, פתחו את תוכנת ה-EDAC הרלוונטית.
לחצו על start recording new spectra בממשק המשתמש כדי לאסוף את ספקטרום ה-EDX. בחרו ב-peak ID כדי לבחור את היסודות הסבירים בספקטרום. לאחר מכן, הקלידו את היסודות שנצפו לשדה היסודות.
לחצו על add כדי להחיל את האלמנט על הספקטרום. לחצו על file ולאחר מכן על save as. שמרו את נתוני הספקטרום בפורמט CSV תחת שם הקובץ הרצוי לצורך שרטוט באמצעות תוכנת גרפים.
לאחר סיום הצילום והקלטת הספקטרום עבור כל אחד מהחורים, כבה את קרן האלקטרונים על ידי לחיצה על כפתור ה-beam on בדף בקרת הקרן כאשר אזור צילום קרן האלקטרונים פעיל. פתח את תא ה-SEM על ידי לחיצה על vent באותו דף. הסר בזהירות את הדגימה מהבמה על ידי הסרת כל הסרטיים לאחר שדלת התא נפתחה.
חזור על הפרוצדורה לביצוע ניסויי הביקורת באמצעות מים דה-יוניזציה ומיקרו-תעלה ריקה. לבסוף, שרטט את ספקטרום ה-EDX כפי שמתואר בפרוטוקול הטכנאי. באמצעות ממשק המיקרו-פלואידיקה של SALVI, קרן האלקטרונים יכולה להפציץ ישירות את הפתח הקטן, שגודלו בסדרי גודל של מיקרומטרים, כאשר הנוזל נמצא תחתיו.
חלקיקי בוהמיט (Boehmite) במים דה-יוניים הושוו לבקרת מים דה-יוניים ולבקרת תעלה ריקה בתמונות האלקטרונים המשניים שלהם. הדבר מספק ראיה ישירה לדימות באלקטרונים משניים של חלקיקי בוהמיט בנוזל. ויזואליזציה של החלקיק במים דה-יוניים בתוך חור בקוטר מיקרומטר אחד מדגימה את ההיתכנות של תצפית על חלקיקים בנוזל in situ.
בדגימת ה-Boehmite נצפה פיק אלומיניום חזק. לעומת זאת, בדגימת המים המזוקקים נצפה רק פיק חמצן חזק, המעיד על נוכחות של מים. בערוץ הריק נראים שאריות של קרן יוני הגליום הממוקדת (gallium-focused ion beam).
פיס החמצן קטן למדי כיוון שאין בפנים מים. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצע אותה בתוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בה, כיוון שקשה להדמיות ישירות של נוזלים ב-SEM בוואקום גבוה.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן אפיון חלקיקים בנוזל באמצעות in situ liquid SEM עם SALVI. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב מאוד לזכור כי המיקרו-ריאקטור חייב להיות ללא דליפות לפני התסבכו לבמה של ה-SEM. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון TOF-SIMS או NMR כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון הרכב מולקולרי ומיפוי שדה פלואידי.
לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי מדעי החומרים, ההנדסה הכימית והנדסה גרעינית לבחון שינויים בגודל החלקיקים ובמורפולוגיה בסביבה של נוזל קורוזיבי. זכרו כי בעת עבודה בניתוח פני שטח באמצעות SEM, יש להשתמש בכפפות ובמשקפי מגן במהלך ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוצדורה לדימיון בזמן אמת ולניתוח הרכב אלמנטרי של חלקיקי בוהמייט במים דה-יוניים באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת (SEM) של נוזלים in situ. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה של חלקיקים בנוזל ללא צורך בייבוש או בהקפאה, ובכך עונה על שאלות מרכזיות במיקרוסקופיה ובמיקרו-אנליזה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוסקופיה
- מיקרו-אנליזה
- מדע החומרים
רקע
- טכניקות דימות in situ הן קריטיות ללימוד חלקיקים בסביבות הנוזליות הטבעיות שלהם.
- שיטות SEM קונבנציונליות בואקום גבוה מחייבות לעיתים קרובות הכנה של הדגימה המשנה את מצבה.
- הבנת התנהגות חלקיקים בנוזלים היא חיונית לתחומי מדע שונים.
- טכניקה זו עושה שימוש במודול מיקרופלואידי תואם ואקום לצורך ניתוח משופר.
מטרת המחקר
- מתן שיטה אמינה להדמיה ולניתוח של חלקיקים בנוזל.
- אפיון גודל ומורפולוגיה של חלקיקים בתגובה לשינויים סביבתיים.
- הקלה על חקר דגימות ביולוגיות הנמצאות בנוזל.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש במודול מיקרופלואידי תואם ואקום עבור SEM.
- ציפוי פחמן של המערכת לצורך ניתוח בממשק נוזל-ואקום.
- דימוי בזמן אמת של חלקיקים פולידיספרסיים במים דאיוניים.
- הדגמה של שלבי דימוי in situ ללמידה אפקטיבית.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של חלקיקי boehmite בנוזל ללא שינוי של הדגימה.
- אפיון של גודל החלקיקים והמורפולוגיה המשתנים.
- הוכחת יעילות בניתוח של חומרים נוזליים שונים.
- מתן פרוטוקול ברור המאפשר לחוקרים לשחזר את השיטה.
מסקנות
- טכניקת ה-SEM הנוזלי in situ מהווה התקדמות משמעותית בניתוח חלקיקים.
- שיטה זו פותחת נתיבים חדשים לחקר חומרים ביולוגיים ונוזליים.
- הדגמות חזותיות משפרות את ההבנה ואת היישום של הטכניקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת SEM בנוזל in situ מאפשרת ויזואליזציה ישירה ואנליזה אלמנטרית של חלקיקים במצבם הנוזלי הטבעי, ובכך היא נותנת מענה לפער קריטי במיקרוסקופיה בוואקום גבוה עבור דגימות מהידרטריות או רגשיות. יכולת זו תומכת באפיון חומרים בשלבים מוקדמים של פיתוח פורמולציות פרמצבטיות, שבהם גודל החלקיקים, המורפולוגיה והכימיה של הפני השטח משפיעים על היציבות, הזמינות הביולוגית וביצועי התהליך. על ידי מניעת ארטיפקטים הנובעים מייבוש או הקפאה, השיטה משפרת את רמת הביטחון החזויה בסינון פרה-קליני של חומרי עזר, חלקיקי תרופות ומערכות קולואידליות בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות הנוגעות לחלקיקים בפורמולציות נוזליות ללא הפרעות הנובעות מערטיילי הכנה של הדגימות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של אינטראקציות בין חומרים מסייעים (excipients) לחלקיקים בסביבות מימיות הרלוונטיות למערכות להובלת תרופות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק נתונים מורפולוגיים והרכביים כמותיים לסריקת מערכות חלקיקיות תחת תנאי הידרציה טבעיים.
- ערך תפעולי: מאפשר תהליכי דימות סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור בדיקות מבוססות נוזלים תוך שימוש בממשקים מיקרופלואידיים התואמים לוואקום.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר רצף מהגילוי להערכה פרה-קלינית על ידי שמירה על שלמות הדגימה במהלך ניתוח של תרחיפים, אמולסיות או חומרים ביולוגיים במצב נוזלי.
- ערך תפעולי: מפחית עמימות מכניסטית בהפחתת סיכונים של פורמולציות על ידי קישור התנהגות החלקיקים לביצועים התפקודיים בתמיסה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים, שבהם ניתוח חלקיקים במצב נוזלי מספק מידע לתכנון הפורמולציה ולהערכת יציבות לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על אינטראקציות ביולוגיות המתווכות על ידי חלקיקים במיקרו-סביבות נוזליות.
- סריקה: מספקת דימות חלקיקים ומיפוי אלמנטרי הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה עבור ספריות פורמולציות.
- אנליטיקה: מייצרת תמונות של אלקטרונים משניים וספקטרום EDX המאפשרים ניתוח השוואתי של גודל החלקיקים, המורפולוגיה וההרכב האלמנטרי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין אפיון חלקיקים מוקדם לרצף פרה-קליני על ידי שימור תכונות המצב הנוזלי הטבעי.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור ניתוח חלקיקים בנוזל לאורך מחקרי פורמולציה, יציבות ותאימות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בסריקת פורמולציות על ידי ביטול ארטיפקטים הנגרמים מההכנה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של ניתוח דגימות נוזליות ב-SEM בוואקום גבוה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) בפיתוח פורמולציות באמצעות נתוני חלקיקים מדויקים השומרים על מצבם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לתרופות בהתבסס על אפיון אמין של חומרים בשלב הנוזלי.
שיקולי יישום
- מומחיות בטיפול בהתקני מיקרופלואידיקה, תפעול SEM וניהול מערכות ואקום.
- גישה לפלטפורמות SEM תואמות SALVI, FIB להסרת חרירי פתח (aperture milling) וגלאי EDX.
- סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הזרקת נוזלים, הסרת בועות והארקה בין הצוותים.
- שיקולי התאמה עבור צמיגויות נוזלים, חוזקים יוניים וריכוזי חלקיקים משתנים.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות ליציבות לחץ התא והשפעות פוטנציאליות של הקרן על דגימות מהוהרות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Mount the device and Use SEM/Focused Ion Beam (FIB) to Make Apertures on the SALVI Silicon Nitride Membrane Using FIB
3:46
Load SALVI with Liquid Samples
9:30
Results: In Situ Imaging of Beohmite Particles in Liquid Using SEM
10:39
Conclusion
4:58
Conduct Liquid SEM Imaging and Element Analysis
