Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

המטרות הכוללות של הליך ביו-פאנינג זה הן לבודד במהירות סוכני לכידת פפטידים ליעד חלבון ספציפי בעל עניין ולחסל במהירות וביעילות את המועמדים הלא ספציפיים מניתוח נוסף במורד הזרם. ניתן להשתמש בשיטה זו לגילוי ריאגנטים חזקים של זיקה לפפטידים למגוון יישומים, החל מזיהוי איומים ביולוגיים ועד לאבחון מחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד במהירות את ריאגנטים של זיקה פפטידית תוך כשבוע ללא כמות משמעותית של אימון.

למרות שניתן להשתמש בשיטה זו לגילוי ריאגנטים של זיקה לפפטידים לשימוש מחוץ לתא, הפפטידים יכולים לשמש גם כחומרים חיים. באופן כללי, ההיבט הקשה ביותר עבור אנשים חדשים בשיטה זו יהיה ניתוח הרצף במורד הזרם של המועמדים, אשר משתלב במידה רבה עם פרוטוקולי הניסוי המוצגים כאן. ספריות תצוגה חיידקיות ביו-פאנינג הן תהליך מחזורי שמתחיל במיון שלילי כנגד החרוזים המגנטיים עצמם כדי להסיר קלסרים לא ספציפיים לחומר החרוז או כל חלבוני לכידה מחוברים.

יש לשמור על השבר השלילי שאינו קושר את החרוזים המגנטיים. ניתן לבצע מיון שלילי נוסף כנגד כל מטרות חלבון צולבות פוטנציאליות, והחלק השלילי שאינו קושר את החרוזים המגנטיים נשמר שוב. שלבי המיון החיוביים הבאים דומים מאוד למיון שלילי כנגד יעד חלבון, אך הפעם נשמר השבר החיובי הקשור לחרוז המגנטי.

למיון חיובי של ספריית התצוגה החיידקית, יש לחסן תחילה 500 מיליליטר של Luria Broth Miller בתוספת כלורמפניקול, או LBCM-25, עם בערך פי 10 עד 11 תאים של ספריית מיון תצוגה חיידקית מגוונת שהתרוקנה מראש מפפטידים לא רצויים על ידי מיון שלילי. דגרו את הספרייה ב-37 מעלות צלזיוס ב-225 סל"ד עד שהתרבות תגיע ל-OD 600 של 0.5 עד 0.55. לאחר מכן יש לגרום לביטוי פפטיד עם 0.04% L-arabinose למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול.

בתום תקופת האינדוקציה, הניחו את התרבות על קרח. ולאסוף פעמיים עשר עד תאי חיידק 11 על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב -1.5 מיליליטר PBS עם מערבולת עדינה.

ולפצל את החיידקים למספר צינורות מיקרו צנטריפוגות לפי הצורך לצנטריפוגה שנייה. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS בתוספת יעד הביוטינילציה המעניין למשך 45 דקות דגירה בארבע מעלות צלזיוס על פלטפורמה מסתובבת. בינתיים, שטפו 100 מיקרוליטר של חרוזים מקודדים סטרפטווידין במילימטר אחד של PBS בתוספת אלבומין בסרום בקר, או BSA, על ידי צנטריפוגה.

הנח את החרוזים השטופים במפריד חלקיקים מגנטי עליון והסר בזהירות את הסופר שקע, תוך הקפדה לא להפריע לגלולה. בסוף הדגירה המסתובבת, צנטריפוגה את התאים כדי לאסוף כל מטרה לא קשורה בסופר נדנט ולהשעות מחדש את כדור תאי החיידקים הקשורים לחלבון המטרה במיליליטר אחד של PBS בתוספת BSA. השתמש בכל נפח תאי החיידקים כדי להשעות מחדש את כדור החרוז.

דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על פלטפורמה מסתובבת למשך 30 דקות. לאחר מכן הניחו את תמיסת החרוזים והחיידקים על קרח. הפעל את מכשיר המקסימום האוטומטי כדי לאתחל את המערכת ובחר שטוף כעת, שטוף והפעל בתפריט ההפרדה כדי למלא את הקווים עם מאגרי הכביסה וההפעלה של היצרן בהתאמה.

בתום הכביסה, הפעילו את הקווים פעם נוספת באמצעות PBS בתוספת מאגר BSA. כאשר המכשיר מוכן, העבירו את החיידקים ותערובת החרוזים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ושטפו את הצינור עם 500 מיקרוליטר נוספים של PBS טרי בתוספת BSA. משוך את הכביסה עם תערובת החיידקים והחרוזים והנח את הצינור לתוך חריץ הדגימה של מתלה צינור חרוטי של ארבע מעלות צלזיוס.

הנח צינורות איסוף ריקים של 15 מיליליטר לתוך חריצי הבחירה החיובית והשלילית של המתלה והעביר את המתלה לפלטפורמת המכשירים. הקצה תוכנית הפרדה לכל דגימה על המתלה, תוך הוספת שלב שטיפה בין כל דגימה ואחרי הדגימה האחרונה. בחר הפעל כדי להתחיל את הפרדת התאים ואישור או המשך כדי לאשר שיש מספיק מאגר זמין.

בסיום התוכנית, הסר את המתלה והניח את החלק החיובי המכיל גם את החיידקים וגם את החרוזים על קרח. לאחר הכנת הקווים כפי שהודגם זה עתה, עם מאגרי ההפעלה והכביסה של היצרן, בחר כוח וכן כדי לכבות את המכשיר ולאשר שיש 70% אתנול בבקבוק תמיסת האחסון לטיהור. לאחר השלמת כיבוי המערכת, הבקבוקים יהיו סגולים.

ניתן לכבות את המכונה. לאחר מכן השתמש בכל מקטע המיון החיובי כדי לחסן ליטר אחד של LBCM25 בתוספת גלוקוז D לתרבית לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור. כדי לנתח את הצלחת בידוד מגיב הזיקה לאחר כל סבב מיון, בסוף השראת הפפטיד שלאחר המיון, הוסף חמישה מיקרוליטר של תאים מושרים ל-25 מיקרוליטר של התמיסות כפי שמוצג בטבלה.

לאחר דגירה של 45 דקות על קרח, אספו את החיידקים בכל תמיסה על ידי צנטריפוגה ושאבו את הסופר נדנט מכל דגימה. כשצינורות הדגימה על הקרח, בחר מנהל בתוכנת מכשיר הפקס ופתח את תיקיית הניתוח המתאימה. לחצו על ניסוי חדש.

לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לשנות את שם הניסוי ולחץ על גליונות עבודה כלליים. לחץ על סמל התוויית הנקודות בגיליון העבודה הכללי כדי ליצור תרשים פיזור חדש. לאחר מכן בחר את גרף עלילת הנקודות עצמו ובחר את סמל המפקח.

לחץ על התיבות לצד צירי X ו- Y בחלון הפתוח כדי להתאים את הצירים לתצוגה דו-מעריכית ולסגור את חלון הסוקר. לחץ על הניסוי וצור דגימה חדשה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לשנות את שם הדגימה בהתאם לניסוי. לאחר מכן לחץ על סימן הפלוס כדי להרחיב את הדגימה ולשנות את שם הדגימה.

כדי להריץ דגימת בקרה שלילית, השעו מחדש את גלולת ה-PBS בלבד ב-500 מיקרוליטר של פקס קר כקרח ערבוב היטב על ידי צנרת. העבירו את הדגימה לצינור פקס, תוך תנועה כדי לשמור על התאים בתמיסה, וטענו את הדגימה על צינור הזרקת הדגימה או SIT של המכשיר. לחץ פעמיים על צינור הדגימה הנוכחי ולחץ על נתונים שנרכשו.

לאחר מכן הצג את האירועים באזור הפיזור הצדדי שהוכן בעבר לעומת עלילת הנקודות של אזור הפיזור קדימה, והתאם את סף המתח של צינור מכפיל הצילום מתחת ללשונית הסף לפי הצורך כך שתאי הבקרה השליליים ייפלו ליד המרכז. כאשר המדגם קורא כראוי, התאם את קצב הזרימה כך שיציג 200-2,000 אירועים בשנייה ולחץ על נתוני רשומה כדי ללכוד מינימום של 10,000 אירועים. לאחר שכל האירועים נרכשו, הסר את צינור הדגימה מה-SIT.

בחר בסמל שער המצולע וצייר שער סביב רוב אוכלוסיית התאים בתרשים הפיזור. לחץ לחיצה ימנית על עלילת הנקודות כדי לבחור הצג היררכיית אוכלוסייה ולחץ על P1 בהיררכיית האוכלוסייה וצור עלילת נקודות חדשה כדי להציג את אוכלוסיית P1. לחץ לחיצה ימנית על כל ציר כדי לשנות את ציר ה-Y לאזור FITC ואת ציר ה-X כדי להעביר את אזור הפיזור קדימה ולהתאים את הצירים לתצוגה דו-מעריכית.

השתמש בשער המצולע כדי לשער את תאי הבקרה השליליים בצורה הדוקה ככל האפשר סביב הצד העליון והשמאלי של האוכלוסייה, ובחר P2 בהיררכיית האוכלוסייה, תוך לחיצה ימנית כדי לבחור שער הפוך. פחות מ-1% מהאוכלוסייה צריכים להיות מחוץ לשער. לחץ לחיצה ימנית על תרשים הנקודות עם שער P2 כדי לבחור להציג אוכלוסיות ולבחור את אוכלוסיות P2 ולא P2 לתצוגה.

לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תרשים הנקודות עם שער P2 כדי לבחור צור תצוגת סטטיסטיקה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על חלון תצוגת הסטטיסטיקה כדי לבחור עריכת תצוגת סטטיסטיקה. תחת לשונית האוכלוסיות, הוסף או הסר את האוכלוסיות לפי הצורך, כולל אוכלוסיית האב P1. P2 ולא P2 כבר צריכים להיות מוצגים.

לאחר מכן, תחת הכרטיסייה סטטיסטיקה, הוסף מדיום אזור FITC וכל סטטיסטיקה אחרת שמעניינת ולחץ על אישור כדי לסגור את החלון. לחץ לחיצה ימנית על עלילת הפיזור P2 ובחר שכפול כדי ליצור גרף עלילת נקודות דומה עבור אזור PE לעומת אזור FSC. התאם את ציר ה-Y והשתמש במדגם PBS בלבד כדי לשער את אוכלוסיית P3.

ואז הפוך את השער. ולהציג את האוכלוסיות המתאימות. לאחר הגדרת כל השערים המתאימים, השתמש בגיליון האלקטרוני כדי להריץ את כל הדגימות המתעדות כ-10,000 אירועים בכל צינור.

כמו בניסוי מייצג זה, קשירת Ypet Mona לפפטיד בקרה חיובי קבוע יכולה לעזור לנטר את רמת הביטוי של ספריית הפפטידים המושרה בתוך האוכלוסייה. תאים חסרי פפטידים המוצגים על פני השטח מסולקים בדרך כלל במהלך תהליך המיון כפי שנצפה בסבבים השלישי והרביעי. העשרת הספרייה עבור פפטידים הנקשרים ליעד הספציפי של העניין מושגת בדרך כלל תוך שלושה סבבי מיון חיוביים.

המשך לסבב מיון רביעי יכול להועיל מכיוון שרצפי הפפטידים בעלי הזיקה הגבוהה ביותר שכבר קיימים בסיבוב השלישי צפויים להיות מועשרים עוד יותר בסיבוב הרביעי, מה שיסייע בבחירה נמוכה של מועמדים פוטנציאליים. הספציפיות מוערכת על ידי השוואת קשירה למטרה המיועדת לקשירה לכל מטרות צולבות פוטנציאליות כגון אלה ששימשו למיון שלילי. ניתוח רצפים מסבב מיון רביעי חושף בדרך כלל רצפים חוזרים המהווים נקודות התחלה מצוינות לניתוחי זיקה וספציפיות.

ניתן להשתמש בניתוח יישור רצפים של הרצפים החוזרים כדי לחשוף את נוכחותו של רצף קונצנזוס שיכול לסייע בבחירת המועמדים. לאחר מכן ניתן לנתח מושבה מייצגת מכל רצף חוזר על ידי עובדות של זיקה וספציפיות על התא כדי להעריך את קשירת הפפטידים לחלבוני מטרה וחלבונים תגובתיים. לאחר השליטה, ניתן לבצע ניסוי ביולוגי מלא עם ניתוח הזיקה והספציפיות הראשוני תוך פחות משבועיים אם הוא מבוצע כראוי.

בעת ביצוע ההליך המלא, חשוב לזכור שייתכן שתצטרך לסירוגין בין הערכת הכריכה לניתוח הרצף מספר פעמים כדי להבין היטב את המעבר הכרוך בזיקה המחייבת. כללנו קובץ מאקרו משלים שפיתחנו כדי להפוך חלק גדול מניתוח הפפטידים לאוטומטי ולייעל עוד יותר את בחירת המועמדים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד במהירות סוכני לכידת פפטידים מספריית תצוגה חיידקית וכיצד לחסל מועמדים לא ספציפיים מניתוח נוסף במורד הזרם.

לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ALIZA כדי לאשר זיקה וספציפיות של קשירת תאים.