קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את תכולת הגליקוגן בציאנובקטריה באמצעות הידרוליזה ובדיקה סלקטיבית מבוססת אנזים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הציאנובקטריה, כגון פיזיולוגיה, גנטיקה מולקולרית וביו-הנדסה של זני ציאנובקטריה שונים הנחקרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מותאמת לקנה מידה קטן, היא קלה לביצוע, רגישה מאוד וספציפית לגליקוגן.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ציאנובקטריה, ניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים שצוברים גליקוגן או עמילן, כגון E.Coli, שמרים, מיקרו-אצות ומיקרואורגניזמים הטרוטרופיים ופוטוטרופיים שונים. התחל פרוטוקול זה בהכנת תרביות ציאנובקטריאליות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. העבירו מיליליטר אחד של תרבית ציאנובקטריאלית או תרחיף תאים לצינור של 1.5 מיליליטר.

ואז צנטריפוגה בטמפרטורה של 6, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט לפני השעיית הגלולה במיליליטר אחד של 50 מילי-מולרי Tris-HCL pH שמונה. צנטריפוגה את הגלולה המושעה כמו קודם.

השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את כדור התא פעם שנייה במאגר Tris-HCL. צנטריפוגה את הצינורות כמו קודם והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן השעו היטב את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי Tris-HCL pH שמונה.

חיוני שהגלולה תהיה תלויה היטב לליזה יעילה. שמור את ההשעיה בקרח. ליזה את התאים התלויים בארבע מעלות צלזיוס על ידי 30 מחזורי אולטרסאונד כאשר כל מחזור מורכב מ -30 שניות בתדר של 20 קילוהרץ עם משרעת מקסימלית, ואחריה 90 שניות בלי.

צנטריפוגה את הצינור המכיל את הליזאט בטמפרטורה של 6,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, הגלולה צריכה להיות בעיקר פסולת תאים גדולה, והסופרנטנט משמש לניתוח נוסף. בשלב זה, קבע את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת החלבון.

הסר כלורופיל a מהליזאט של התא על ידי ערבוב של 900 מיקרוליטר אתנול ו -100 מיקרוליטר של הסופרנטנט המתקבל בצינור מכסה בורג של 1.5 מיליליטר. לאחר סגירת המכסה, מחממים את הצינור בחום של 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, באמצעות בלוק חימום מעבדה רגיל. לאחר מכן, דגרו את הצינור בקרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב 20, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט. הגלולה מכילה גליקוגן.

יבש קלות את הגלולה באוויר כדי להסיר עודפי אתנול. אין לייבש את הגלולה יתר על המידה כדי למנוע המסה קשה. מדוד את הספיגה ב-666 ננומטר של הסופרנטנט המתקבל כדי לקבוע את תכולת הכלורופיל A.

ניתן להשתמש בערך כדי לנרמל את תכולת הגליקוגן. ממיסים את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי נתרן אצטט pH חמש. מערבבים היטב את החומרים הללו בעזרת מערבולת.

ערבוב על ידי פיפטינג אינו מומלץ מכיוון שהתערובת צמיגה. הוסף גם 50 מיקרוליטר של שמונה יחידות למיליליטר עמילוגלוקוזידאז ו -50 מיקרוליטר של שתי יחידות למיליליטר אלפא-עמילאז. לאחר מכן, דגרו את התערובת בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס בבלוק חימום למשך שעתיים כדי לאפשר עיכול של גליקוגן למולקולות גלוקוז.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה ב-20,000 פעמים גרם למשך חמש דקות והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. מדוד את ריכוז הגלוקוז בסופרנטנט לאחר הידרוליזה אנזימטית, באמצעות מגיב GOD-POD. העבירו 100 מיקרוליטר של הסופרנטנט משלב משקעי הגליקוגן לבאר בצלחת של 96 בארות.

כבקרה שלילית, השתמש ב-100 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי נתרן אצטט pH חמש. ליצירת עקומת הכיול, מדוד גם את התמיסות הסטנדרטיות של הגלוקוז. הוסף 150 מיקרוליטר של מגיב GOD-POD לכל דגימה וערבב במהירות על ידי פיפטינג.

דגרו את הצלחת בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, רשום את ערך הספיגה ב-510 ננומטר, באמצעות קורא צלחות. חשב את כמות הגליקוגן כשווה ערך לגלוקוז, באמצעות עקומת כיול המתקבלת מתקני הגלוקוז.

תכולת הגליקוגן בסינכוציסטיס מוצגת כאן. שני הזנים המוטנטיים, דלתא pmg A ודלתא pmg R, הידועים כצוברים יתר על המידה גליקוגן, הושוו לזן מסוג פראי. כצפוי, הזנים המוטנטיים הראו רמות גבוהות של גליקוגן.

לעומת זאת, מוטציה חסרת גליקוגן סינתאז לא צברה גליקוגן. הזנים המשמשים כאן תוכננו לייצר מניטול. יש לציין כי מוטנט הגליקוגן סינתאז ייצר יותר מניטול מזן הביקורת, מה שמצביע על כך שהפחמימה המסונתזת על ידי פוטוסינתזה מופנית למניטול בזן המוטנטי חסר היכולת לסנתז גליקוגן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לקבוע כמותית את תכולת הגליקוגן בציאנובקטריה תוך חמש שעות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשעות מחדש את התאים ביסודיות ולהמיס כדורי גליקוגן כדי להשיג תוצאות אמינות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות פעילות אנזים מטבולי באמצעות הליזטים הנותרים של התאים על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו כיצד חילוף החומרים של פחמימות מווסת בציאנובקטריה.