Name: קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: למדו לכמת תוכן גליקוגן בקיאנובקטריה באמצעות הידרוליזה אנזימטית סלקטיבית. השיטה פשוטה, רגישה ומתאימה לזנים פראיים ומהונדסים גנטית לחקר פיזיולוגיה והנדסה מטבולית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים במחקר Nordic Energy (AquaFEED, פרויקט מס &#39;24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, פרויקט מס&#39; 12-131844) וווילום פונדן (פרויקט מס &#39;13363)

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות Cyanobacterial <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Synechocystis sp. PCC 6803 ב 30 מעלות צלזיוס BG11 בינוני 8 , עם אספקה ​​קבועה של אוויר בתוספת 1% (V / V) CO 2 . להאיר את התרבויות ברציפות עם אור בכל צפיפות השטף הפוטוסינתזה פוטון של פוטון 50 μmol / m 2 / s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Synechococcus sp. PCC 7002 בנוזל A + בינוני 23 (בינוני BG11 יכול לשמש גם), עם אספקה ​​קבועה של אוויר בתוספת 1% (V / V) CO 2 . הטמפרטורה צריכה להיות 37 ° C. להאיר את התרבויות ברציפות עם אור בכל צפיפות השטף הפוטוסינתזה פוטון של 150 μmol פוטון / m 2 / s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של התרבות ב 730 ננומטר באמצעות קובט עם נתיב אור של 1 ס&quot;מ. אם הערך OD הוא מעל 0.8, לעשות דילולים מתאימים כדי להשיג מדידות OD כי הם פרופורציונליים לריכוז התא. הערה: הפרוטוקולים המוצגים להלן מתאימים לתרבויות נוזליות, עם צפיפות תאים המתאימה לערך של 730 ננו-מטר של 2 או יותר. כאשר תרבויות בשלב הצמיחה מעריכי הרצוי, אשר בדרך כלל יש ערך 730nm OD מתחת 1, לרכז את צפיפות התאים על ידי צנטריפוגה resuspension במאגר או בינוני להשיג ערך 730nm OD של 2 ומעלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגרים וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 50 מ&quot;מ טריס HCL חיץ ב pH 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 50 מ&quot;מ סודיום אצטט המאגר ב pH 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון מלאי של 8 U / mL amyloglucosidase ב 50 מ&quot;מ מאגר אצטט אצטט, pH 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון המניות של 2 U / מ&quot;ל ​​α-amylase ב 50 מ&quot;מ מאגר אצטט אצטט, pH 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במים מזוקקים, פתרונות סטנדרטיים Makeglucose בריכוזים הנעים בין 0 ל 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​,. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מגיב אלוהים- POD מן D- גלוקוז Assay Kit (פורמט GODPOD), fOllowing ההוראה של היצרן. </li></ol></li></ol> 2. קביעת התא יבש משקל (אופציונלי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2 מ&quot;ל של תרבות או resuspension התא (ראה שלב 1.1) לצינור 2.0 מ&quot;ל ו צנטריפוגה ב XG 6,000 ו 4 ° C במשך 5 דקות. מחק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מים צנטריפוגות ב XG 6000 ו 4 ° C במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה התא 0.5 מ&quot;ל של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה למגש אלומיניום שקול מראש. מעבירים את המגש לתנור ייבוש ב 105 ° C לייבוש לילה (כ 18 שעות). קריטי: חשוב שהמגש יטופל במלקחיים כדי למנוע העברת חומר מהאצבעות. יבש מגש אלומיניום ריק מראש, שקול תחת אותם תנאים כדי לקבוע כל ירידה במשקל המגשים במהלך ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הייבוש, הוציאו את המגש מהתנור ואפשרו לו לאזן את הקונדיטיעל 5 דקות לפני שקילתו עם דיוק של 0.0001 גרם. הערה: ניתן להשתמש בערך כדי לנרמל את תוכן הגליקוגן על בסיס משקל תא יבש. </li></ol> 3. תמוגה של תאים Cyanobacterial <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ&quot;ל של תרבות או resuspension התא (ראה שלב 1.1) לצינור 1.5 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב XG 6,000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מחק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של 50 מ&quot;מ Tris-HCl, pH 8, ו צנטריפוגות ב XG 6000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מחק supernatant ו resuspend תא גלולה ב 1 מ&quot;ל של חיץ Tris-HCl. חזור על התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend גלולה μL 500 של 50 מ&quot;מ טריס HCL חיץ, pH 8. קריטי: Resuspend גלולה היטב עבור תמוגה התא יעיל. שמור על resuspension בקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים resuspended ב 4 מעלות צלזיוס על ידי ביצוע 30 מחזורים של ultrasonication, כל מחזור בהיקף של 30 שניות בתדר של 20 קילוהרץ עם משרעת מקסימלית,ואחריו 90 s ללא. הערה: שיטה זו יכולה ביעילות lyse Synechococcus sp. PCC 7002. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להעביר resuspension התא כדי צינור בורג שווי ולהוסיף חרוזי תחמוצת זירקוניום לצינור, בעקבות הוראות היצרן. הגדר את הצינור homogenizer רקמות lyse התאים על 4 מעלות צלזיוס על ידי ביצוע 2 מחזורים של מכות, כל מחזור המורכב של 5 דקות בהגדרת תדר של 5. הערה: שיטה זו יכולה ביעילות lyse Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור המכיל lysate למשך 10 דקות ב XG 6,000 ו 4 ° C. הערה: גלולה צריך בעיקר מורכב פסולת התא גדול. אם יש מספר משמעותי של תאים רצופים, חזור על שלב 3.4. שמור את supernatant על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות מסחרי BCA assay Protein Kit. הערה: ניתן להשתמש בערך כדי לנרמל את תוכן הגליקוגןעל בסיס תוכן חלבון. </li></ol> 4. גליקוגן משקעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר chlorophyll א lysate התא על ידי ערבוב 900 μL של 96% (V / V) אתנול ו 100 μL של supernatant משלב 3.5 ב 1.5 מ&quot;ל צינור בורג מכסה. לאחר סגירת מכסה, לחמם את הצינור על 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמצעות בלוק חימום במעבדה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינור על קרח במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב XG 20,000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בזהירות להסיר את supernatant; גלולה מכיל גליקוגן. לייבש קלות את גלולה באוויר כדי להסיר אתנול עודף. קריטי: ייבוש מוגזם של גלולה יש להימנע, אחרת זה הופך להיות קשה solubilize בשלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: מדוד את הספיגה של supernatant שהושג בשלב 4.3 ב 664 ננומטר, כדי לקבוע את כלורופיל תוכן. השתמש במקדם ספיגה של 84.6 ליטר / גרם / ס&quot;מ 24 . הערה: הערך יכול לשמש לנורמליזציהתוכן הגליקוגן. </li></ol> 5. הידרוליזה אנזימטית וקביעת גליקוגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize גלולה שהתקבלו בשלב 4.3 μL 100 של חומצה אצטט 50 מ&quot;מ, pH 5, ולהוסיף 50 μL של 8 U / mL amyloglucosidase ו 50 μL של 2 U / mL α-amylase. מערבבים חומרים אלה היטב באמצעות מערבולת. הערה: ערבוב על ידי pipetting אינו מומלץ כי גלולה הגליקוגן הוא צמיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת על 60 מעלות צלזיוס על בלוק חימום עבור 2 שעות כדי לאפשר את העיכול של הגליקוגן לתוך מולקולות הגלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב XG 10,000 במשך 5 דקות ולהעביר supernatant לצינור 1.5 מ&quot;ל חדש. </li></ol> 6. קביעת תוכן גלוקוז הכולל באמצעות מגיב אלוהים- POD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של גלוקוז supernatant שהושגו בשלב 5.3 באמצעות מגיב אלוהים- POD. העברת 100 μL של supernatant מ 5.3 שלב היטב בצלחת 96-היטב. כבקרה שלילית,השתמש 100 μL של חומצה אצטט 50 מ&quot;מ, pH 5. ליצירת עקומת כיול, גם למדוד את הפתרונות הסטנדרטיים גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μL של אלוהים מגיב POD לכל מדגם במהירות לערבב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת סטטי על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הקלט את הערך absorbance ב 510 ננומטר באמצעות קורא צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הריכוז של גלוקוז באמצעות עקומת כיול המתקבל סטנדרטים הגלוקוז. הערה: ריכוז הגליקוגן בתאי התא מתבטא בריכוז הגלוקוז (μg / mL). </li></ol>

<ol><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li>
<li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717602902260">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li>
<li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li>
<li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li>
<li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li>
<li>Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64(2014).</li>
<li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://aem.asm.org/content/82/14/4180.long">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li>
<li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Non-coding+RNA+Ncr0700%2FPmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li>
<li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li>
<li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li>
<li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60111a017">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li>
<li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+group+2+%7Bsigma%7D+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li>
<li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Letters%22%5BJournal%5D)">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li>
<li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/242624484_Activation_and_pathway_of_glucosylglycerol_synthesis_in_the_cyanobacterium_Synechocystis_sp_PCC_6803">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li>
<li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004(2015).</li>
<li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li>
<li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li>
<li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+and+antagonistic+effects+of+%CE%B1-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li>
<li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li>
<li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+%28H2O2%29+scavenging+activity+of+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li>
<li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria%3A+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth+Res%22%5BJournal%5D)">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0076687987480361">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li>
<li>López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li>
<li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li>
<li>Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%3A+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li>
<li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA%2C+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li>
<li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

צעדים קריטיים בפרוטוקול הם משקעים גליקוגן resuspension. לאחר צנטריפוגה לאחר משקעים אתנול, גליקוגן יוצר גלולה שקוף כי באופן רופף דבקות קירות microcentrifuge צינורות. לכן, בעת הסרת supernatant, תשומת לב מיוחדת צריך להינתן כדי לא להסיר את גלולה. גליקוגן גלולה הוא דביק, solubilization יכול להיות קשה אם הוא מתייבש. שים לב כי solubilization מלא של גלולה גליקוגן חשוב משום solubilization חלקית יוביל לעיכול אנזימטי יעיל ולכן יהיה ליצור וריאציות גדולות בין משכפל טכני. היישום של sonication ל...

Cyanobacteria לצבור גליקוגן כחנות פחמימות הגדולות של פחמן מ CO 2 קבוע באור באמצעות פוטוסינתזה. גליקוגן הוא גליקן המורכב של גלוקן ליניארי α-1,4 מקושר עם סניפים שנוצרו על ידי α-1,6 המקושרים גלוקוזיל קישורים. גליקוגן ביוסינתזה ב cyanobacteria מתחיל עם ההמרה של גלוקוז -6 פוספט לתוך ADP גלוקוז דרך פעולה רציפה של phosphoglucomutase ו- ADP גלוקוז pyrophosphorylase. מחצית הגלוקוז ב- ADP-glucose מועברת לקצה הלא-מפחית של עמוד השדרה α-1,4-glucan של הגליקוגן על-ידי סינתזה של גליקוגן אחת או יותר (GlgA). לאחר מכן, אנזימים מסתעפים להציג את הקישור α-1,6 מקושר גלוקוזיל, אשר המורחבת נוספת כדי ליצור את החלקיקים גליקוגן. בחושך, גליקוגן מחולק על ידי גליקוגן phosphorylase, אנזים גליקוגן זיוף, α-glucanotransferase, ו- malto-dextrin phosphorylase לתוך גלוקוז phosphorylated גלוקוז חינם. הזנות אלה intO מסלולים קטבוליים, כולל מסלול פוספט חמצון, מסלול Embeden-Meyerhof-Parnas (glycolysis), ואת מסלול Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 . מטבוליזם גליקוגן ב cyanobacteria יש צבר עניין הולך וגובר בשנים האחרונות בגלל הפוטנציאל של cyanobacteria להתפתח מפעלים תא חיידקים מונע על ידי אור השמש לייצר כימיקלים ודלקים. מטבוליזם גליקוגן יכול להיות שונה כדי להגדיל את התשואה של המוצרים, כי הגליקוגן הוא מאגר פחמן גמיש הגדול ביותר בחיידקים אלה. דוגמה לכך היא cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, אשר כבר מהונדסים גנטית לייצר mannitol; הפרעה גנטית של סינתזת הגליקוגן מגדיל את התשואה מניטול 3 פי 5 . דוגמה נוספת היא ייצור של ביואתנול מ-גליקוגן נטען wildtYe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . תוכן גליקוגן תא wildtype עשוי להיות עד 60% מהמשקל היבש של התא במהלך רעב חנקן 6. ההבנה שלנו של מטבוליזם גליקוגן ורגולציה התרחבה גם בשנים האחרונות. בעוד גליקוגן ידוע לצבור באור להיות catabolized בחושך, קינטיקה מפורטת של מטבוליזם הגליקוגן במהלך מחזור דיל היה רק ​​לאחרונה התגלה Synechocystis sp. PCC 6803 7 . יתר על כן, כמה גנים המשפיעים על הצטברות של גליקוגן זוהו. דוגמה בולטת היא התגלית כי pingA histidine histidine ואת הלא קידוד RNA PmgR1 טופס אשד פיקוח ולשלוט על הצטברות של גליקוגן. מעניין, את pmgA ו pmgR1 מחיקת מוטציות לצבור פעמיים כמו גליקוגן כמו זן wildtype של Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . אלמנטים רגולטוריים אחרים ידועים גם להשפיע על הצטברות של גליקוגן, כולל אלטרנטיבה גורם סיגמא E גורם תעתיק CyAbrB2 10 , 11 . כמו עניין גליקוגן הרגולציה ומטבוליזם לגדול, פרוטוקול מפורט המתאר את קביעת התוכן הגליקוגן הוא מוצדק. מספר שיטות משמשות בספרות. חומצה hydrolysis ואחריו קביעת התוכן monosaccharide באמצעות ניתוח בלחץ גבוה אניון כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם גלאי amperometric פעמו או קביעת ספקטרומטריים בעקבות טיפולים עם חומצה פנול נמצאים בשימוש נרחב שיטות כדי משוער תוכן הגליקוגן 9 , 10 , 12 , 13 . עם זאת, בלחץ גבוה אניון החלפת chromatographi נוזלימכשיר C הוא יקר מאוד ואינו להפלות גלוקוז נגזר גליקוגן מן הנגזר אחרים glycoconjugates המכילים גלוקוז, כגון סוכרוז 14 , glucosylglycerol 15 , תאית 16 , 17 , 18 , אשר ידועים לצבור כמה מינים cyanobacterial. השיטה חומצה פנול ניתן לבצע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. עם זאת, הוא משתמש ריאגנטים רעילים מאוד אינו מבחין גלוקוז נגזר glycoconjugates שונים, וגם לא להבחין גלוקוז מ monosaccharides אחרים המהווים חומרים סלולריים, כגון גליקוליפידים, lipopolysaccharides, מטריצות תאיים 12 . יש לציין כי חומצה חמה-פנול assay משמש לעתים קרובות לקביעת התוכן הכולל פחמימות ולא על הקביעה הספציפית של תוכן גלוקוז 12 . אנזימטיתDrolysis של גליקוגן לגלוקוז על ידי α-amyloglucosidase ואחריו זיהוי של גלוקוז באמצעות assay אנזים מצמידים מייצר readout colorimetric כי הוא רגיש במיוחד ספציפיים גלוקוז נגזר גליקוגן. הספציפיות יכולה להיות משופרת נוספת עם משקעים מועדפים של גליקוגן מ lysates התא על ידי אתנול 5 , 8 , 19 . כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור assay מבוסס אנזים של תכולת הגליקוגן בשני מינים cyanobacterial הנחקרים ביותר, Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, ב wildtype ו זנים מוטציה. על מנת להבטיח הידרוליזה יעילה, קוקטייל של α-amylase ו α-amyloglucosidase משמש 8 . Endo משחק α-amylase hydrolyzes את α-1,4-linkages ב glucans שונים לתוך dextrins, אשר hydrolyzed נוספתO גלוקוז על ידי exo משחק α-amyloglucosidase 20 . ההשפעות הסינרגיסטיות של אנזימים אלה ידועות היטב, ואנזימים אלה משמשים באופן שגרתי להידרוליזה סלקטיבית של עמילן, שהוא גלוקן מקושר ל- α כמו גליקוגן, מבלי להשפיע על גליקוקונג&#39;נטים אחרים, כגון תאית, ביומסה הצמחית 21 . גלוקוז משוחרר מזוהה כמותית לאחר assay אנזים מצמידים המורכב oxidase גלוקוז, אשר מזרז את הפחתת חמצן מי חמצן ואת חמצון של גלוקוז ל lactone ו peroxidase, אשר מייצרת צבע quinoneimine בצבע ורוד מי חמצן, תרכובת פנולית, ו- 4-aminoantipyrine 22 .

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 קורא מיקרופלייט&nbsp;</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td></td><td>NA אלייזה קורא צלחות</td></tr><tr><td>כדור בלנדר סערה</td><td>הבא מתקדם</td><td>BBY24M-CE</td><td>מקצף חרוזים</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro UV / ספקטרופוטומטר גלוי</td><td>אמרשם ביוסיינסס</td><td>NA</td><td>ספקטרופוטומטר</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>תוספת pH</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>32319</td><td>בופר</td></tr><tr><td>עמילוגליקוזידאז (Rhizopus sp.)</td>אנזים <td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>לדה-פולימריזציה של גליקוגן</td></tr> <tr><td>ואלפא;-עמילאז, עמיד בחום (Bacillus licheniformis)</td>אנזים <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>לדה-פולימריזציה של גליקוגן</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>תקן לבדיקת גלוקוז</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>לקביעת ריכוזי חלבון</td></tr><tr><td>מגשי ייבוש אלומיניום, חד פעמיים</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>לקביעת משקלים יבשים של תאים</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת D-Glucose (פורמט GODPOD)</td> <td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>לקביעת ריכוזי גלוקוז</td></tr><tr><td>לחמי תחמוצת זירקוניום, 0.15 מ"מ</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>חרוזים לליזה תאים ב </td></tr><tr><td>צינורות RINO</td> של Bullet Blendar Storm צינורות <td>NA</td><td>מתקדמים הבאים</td><td>לליזה תאים בסערה של Bullet Blendar</td></tr></tbody></table>

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Cyanobacteria לצבור גליקוגן כמו פחמן תאיים הגדולות ואנרגיה אחסון במהלך פוטוסינתזה. ההתפתחויות האחרונות במחקר הדגישו מנגנונים מורכבים של מטבוליזם גליקוגן, כולל מחזור diel של biosynthesis ו catabolism, רגולציה רגולציה, ואת מעורבותם של RNA לא קידוד. במקביל, נעשים מאמצים להפנות פחמן מגליקוגן למוצרים רצויים בקיאנובקטריות מהונדסות גנטית כדי לשפר את תפוקת המוצרים. כמה שיטות משמשות כדי לקבוע את תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria, עם משתנות משתנה המורכבות הטכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לקביעת אמין של תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria כי ניתן לבצע במעבדה סטנדרטית מדעי החיים. הפרוטוקול כרוך משקעים סלקטיבי של גליקוגן מן lysate התא ואת deolymerization אנזימטי של גליקוגן לייצר מונומרים גלוקוז, אשר מזוהים על ידי גלוקוז שורIdase-peroxidase (GOD-POD) אנזים מצמידים אנזים. השיטה יושמה על Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, שני מינים cyanobacterial מודל כי נמצאים בשימוש נרחב בהנדסה מטבולית. יתר על כן, השיטה בהצלחה הראו הבדלים בתכולת הגליקוגן בין wildtype לבין מוטנטים פגומים ברכיבים רגולטוריים או גליקוגן biosynthetic גנים.

10 מ&quot;ל של wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 גדלו בתנאים photautotrophic עד הערך 730nm OD הגיעו כ 0.8. התאים נקצרו resuspended ב 50 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8. ערך 730nm OD הותאם 2-3. תכולת הגליקוגן נותחה בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל. תכולת הגליקוגן לכל 730 ננו-מטר היה 13 ± 1.8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​/ OD 730 ננומטר ( N = 12). קרוב המשפחה תוכן הגליקוגן לתוכן חלבון היה 0.24 ± 0.03 מיקרוג...

כאן, אנו מציגים assay אמין וקל למדידת תוכן הגליקוגן בתאי cyanobacterial. ההליך כרוך משקעים, דה פולימריזציה לבחירה, ואיתור של שאריות גלוקוז. שיטה זו מתאימה הן wildtype והן זנים מהונדסים גנטית והוא יכול להקל על ההנדסה המטבולית של cyanobacteria.

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את תכולת הגליקוגן בציאנובקטריה באמצעות הידרוליזה סלקטיבית מבוססת אנזימים ובדיקה (assay). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הציאנובקטריה, כגון פיזיולוגיה, גנטיקה מולקולרית והנדסה ביוטכנולוגית של זני ציאנובקטריה שונים הנחקרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מותאמת לקנה מידה קטן, קלה לביצוע, ובעלת רגישות וספציפיות גבוהות לגליקוגן.אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ציאנובקטריה, ניתן להחילה אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים המצבירים גליקוגן או עמילן, כגון E.Coli, שמרים, מיקרואצות ומיקרואורגניזמים הטרוטרופיים ופוטוטרופיים שונים. התחילו את הפרוטוקול זה בהכנת תרביות ציאנובקטריה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. העבירו 1 ml של תרבית ציאנובקטריה או תרחיף תאים לשפופרת של 1.5 ml.לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-6,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) לפני השעיה מחדש של המשקע ב-1 mL של 50 mM Tris-HCL pH 8. סבבו את המשקע שהושעה מחדש בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן.שפכו את העליון (supernatant), ותלה את משקע התאים פעם שנייה בבופר Tris-HCL. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן ושפכו את העליון. לאחר מכן, תלה את המשקע באופן יסודי ב-500 µL של בופר Tris-HCL בריכוז 50 mM וב-pH 8.חשוב לוודא שהמשקע תלוי היטב כדי להבטיח

determination-of-the-glycogen-content-in-cyanobacteria

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר בדיקה ספקטרופוטומטרית להערכת פעילות גליקוגן סינתאז. השיטה מסתמכת על ירידה בספיגת NADH עם הזמן ומצביעה על פעילות גליקוגן סינתאז.

בדיקה ספקטרופוטומטרית לקביעת פעילות גליקוגן סינתאז

בסרטון זה אנו מתארים בדיקה ספקטרופוטומטרית איכותית כדי לקבוע את מידת ההסתעפות בדגימת גליקוגן בעלת מבנה לא מאופיין. השוואת מקסימום הספיגה של המדגם הלא מאופיין לזה של פוליסכרידים עם מבנים מסועפים ידועים מצביעה על נוכחות של הסתעפות במדגם הלא מאופיין.

בדיקת הסתעפות גליקוגן למדידת מידת הסתעפות הגליקוגן

אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן כמותי phycobiliprotein בתוכן cyanobacterium Synechocystis באמצעות שיטת spectrophotometric. ההליך החילוץ היה הוחלו בהצלחה גם זנים אחרים כחוליות ואצות; עם זאת, בשל הבדלים ב ספקטרום בליעה פיגמנט, יש צורך לבחון את המשוואות spectrophotometric עבור כל זן בנפרד.

קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis

כאן, פרוטוקולים עבור בידוד של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות ובידוד של exoproteomes שלהם מתוארים. שני ההליכים לגלם שלבים מרכזיים כדי להשיג פולימרים או חלבונים עם דרגות טוהר גבוהה, כי ניתן להשתמש לניתוח נוסף או יישומים. הם יכולים גם להיות מותאמים בקלות בהתאם לצרכים ספציפיים של המשתמש.

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

טכניקות למדידת הפעילות של אנזימי מפתח של מטבוליזם גליקוגן מוצגות, באמצעות ספקטרופוטומטר פשוט הפועל בטווח הנראה לעין.

שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

ריכוז סוכרוז אופטימלי נקבע למיצוי גליקוגן בכבד באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. תוספת של שלב רתיחה של 10 דקות לעיכוב אנזימים מפרקים גליקוגן הוכחה כמועילה.

מיצוי מולקולות גליקוגן בכבד לקביעת מבנה הגליקוגן

הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד של phycobililisomes מציאנובקטריה על ידי צנטריפוגציה באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז בלתי פוסק. השברים של phycobilisomes שלמים מאושרים על ידי ספקטרום פליטה פלואורסצנטי 77K וניתוח SDS-PAGE. שברי הפיזיקוביליוזום המתקבלים מתאימים להכתמה שלילית של TEM וניתוח ספקטרומטריית מסה.

בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

בפרוטוקול הנוכחי, טכניקת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) משמשת לקביעת התפלגות אורך השרשרת (CLD) ואורך השרשרת הממוצע (ACL) של גליקוגן.

קביעת התפלגות אורך שרשרת גלוקאן של גליקוגן באמצעות שיטת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE)

ספיחה של פפטידים לכלי פלסטיק במהלך דילולים סדרתיים מסורתיים מבוססי קצה יכולה להשפיע באופן משמעותי על קביעת העוצמה ולבלבל את ההבנה של קשרי מבנה-פעילות המשמשים לזיהוי עופרת ושלבי אופטימיזציה של עופרת בגילוי תרופות. כאן מתוארות שיטות לדילול סדרתי אקוסטי אוטומטי ללא מגע של דגימות פפטיד.

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

למדו לכמת תוכן גליקוגן בקיאנובקטריה באמצעות הידרוליזה אנזימטית סלקטיבית. השיטה פשוטה, רגישה ומתאימה לזנים פראיים ומהונדסים גנטית לחקר פיזיולוגיה והנדסה מטבולית.

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

גלה סרטונים נוספים