מיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה (HREM) - פרוטוקולים פשוטים ורב-עוצמה לעיבוד והדמיה של חומרים אורגניים

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור נתוני נפח דיגיטליים של חומרים אורגניים. דוגמאות לכך הן עוברים ורקמות עובריות של אורגניזמים במודל ביו-רפואי, גושי רקמות שנקטפו מבעלי חיים בוגרים ובני אדם, כולל ביופסיות עור או שרירים וחומרים כמו נייר לא מצופה ותחליפי עור. HREM מסייע לענות על שאלות יסוד בתחומי הרפואה והמחקר הביו-רפואי.

הוא מאפשר ניתוח תלת מימדי והדמיה של איברים ורקמות של, למשל, עוברי עכברים מהונדסים גנטית או עוברי אפרוחים שעברו מניפולציה. זה גם מאפשר ניתוח של מודלים של סרטן כמו גם ביופסיות שנלקחו מרקמות אנושיות או בעלי חיים. היתרון העיקרי של HREM הוא שהוא מספק דרך פשוטה ליצור ערימות של תמונות באיכות כמעט היסטולוגית.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על חקר ריפוי פצעים באמצעות מודלים של בעלי חיים, כמו גם ספינינג ותיקון פתולוגיות רקמות בבני אדם. מי שידגים את ההליך יהיו BMR מרלן רודלר ויוהנס גונתר. שניהם מהאוניברסיטה הרפואית של וינה, המחלקה לאנטומיה.

התחל עם עוברים קבועים או רקמה עוברית של לא יותר מ-5 x 5 x 5 מיליליטר מעוקב. הסר את הקיבוע. ולהוסיף PBS.

יש לשטוף בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה מתמדת למשך 24 שעות. הוסף 70% אתנול לצינורות המכילים את הרקמה והנח את הדגימות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים-שלוש המשיכו לייבש את הדגימות בתמיסות אתנול בריכוז הולך וגדל במשך שעתיים-שלוש בכל פעם.

בזמן שהדגימות מתייבשות, הכינו תמיסת הסתננות על ידי הוספת 0.3125 גרם בנזואיל פרוקסיד ו-0.1 גרם ESN ל-25 מיליליטר תמיסה A בכוס. מערבבים על צלחת ערבוב מגנטית בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש עד שה-ESN והזרז מומסים במלואם. הנח את הדגימות בתמיסת הסתננות.

ולנענע או לסובב את הדגימות במשך 12 עד 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. התחל בהכנת תמיסת הטמעה. הוסף מיליליטר אחד או תמיסה B ל-25 מיליליטר של תמיסת הסתננות טרייה.

לאחר הכנת מגשי כוסות הדפוס, מלאו את החלל העמוק של התבניות בתמיסת הטבעה. מעבירים את הדגימות לתבניות בעזרת כף. ודא שהדגימה מכוסה במלואה בתמיסת הטבעה כדי למנוע לכידת אוויר.

כוון את הדגימה בתוך התבנית באמצעות מחטים או מלקחיים. זה קריטי לייעל את כיוון המדגם במהלך ההטבעה ולסמן את מיקומו המדויק על משטח הבלוק. בדרך זו ניתן לשמור על אזור העניין קטן ולהשתמש במטרה עם ההגדלה הגבוהה ביותר האפשרית.

ברגע שתמיסת ההטבעה מתחילה להיות צמיגה, הנח מחזיק בלוק על גבי התבנית והוסף תמיסת הטבעה דרך החור המרכזי של מחזיק הבלוק עד שתמיסת ההטבעה עולה למילימטר עד שניים מעל בסיס מחזיק הבלוק. אטמו את מגש כוסות הדפוס על ידי כיסויו בשעוות פרפין נוזלית והמתינו עד שיתקשה לפני המעבר. אפשר לבלוקים לסיים את הפילמור על ידי אחסון מגשי כוסות הדפוס האטומים למשך יום עד יומיים בטמפרטורת החדר.

לעיבוד לאחר פילמור, הכניסו את מגשי כוסות הדפוס עם הבלוקים המפולימרים לתנור מעבדה רגיל ואפו בחום של 70 עד 80 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים לפחות. הסר את הבלוקים מהתבניות. לאחר מכן זהה את שדה הראייה על ידי הפניית אור לבן באלכסון למשטח הבלוק.

עקוב אחר הצל של הדגימה עם הסמן השחור על משטח הבלוק. התקן את בלוק השרף עם שדה הראייה המצוין על המיקרוטום וכדי להזיז את מחזיק הבלוק למצב העצירה שלו. הפעל את המצלמה הדיגיטלית ותוכנת יצירת הנתונים ורכוש תמונה חיה.

בחר מטרה עם הגדלה מתאימה כדי לכסות את אזור העניין. הזז את האופטיקה למעלה ולמטה ואת המיקרוטום לרוחב עד שאזור העניין תואם את שדה הראייה המוצג על מסך המחשב. חתך את הבלוק עד שהמבנים הראשונים של הדגימה נראים לעין.

הזז את המיקרוטום כדי לסדר את משטח הבלוק במישור המוקד של האופטיקה. בחר עובי חתך בין 0.5 לחמישה מיקרון. לאחר מכן, לאחר הגדרת התוכנה לפי הוראות היצרן, הפעל את התוכנה והתחל בלכידת נתונים.

תמונה זו של קטע HREM מציגה חתך סגיטלי דרך עובר עכבר שנקצר ביום העוברי 9.5. מודל תלת מימד זה מעובד בנפח מראה את פני השטח של העובר הזה. תמונה זו מציגה חתך סגיטלי וירטואלי באמצעות מודל עיבוד נפח של צוואר עובר העכבר שנקצר ביום העוברי 15.5.

מודל פני השטח מדגיש את הלומינה של מערכת הלב וכלי הדם בעיבוד נפח של כל הרקמות של עובר אפרוח, המבורגר המילטון שלב 18 התפתחותי. תמונה זו מציגה קטע HREM דרך עצב אנושי. השיבוץ מגדיל את החלק של תמונה זו.

תמונה זו מציגה חלק מתמונה של מדור HREM דרך כבד חזיר. תמונה זו מציגה מודל תלת-ממדי של ביופסיה שנלקחה מכרית אגודל אנושית. תמונה זו מציגה את המודלים המעובדים על פני השטח של עורקי עור, ורידים ועצבים מול כריתה וירטואלית באמצעות נתוני HREM.

אנימציה זו מציגה דגם מעובד בנפח של עור עבה של כרית אגודל אנושית. ספים שונים ומכאן מבני עור שונים, כגון כלי דם, סיבי עצב, בלוטות זיעה וצינורות בלוטות הזיעה. HREM מאפשר הדמיה מהירה של הארכיטקטורה של חומר סיבי.

תמונה זו מציגה דגם מעובד בנפח של חומר תחליף עורי מקורי. אנימציה זו מציגה את הדגם המעובד בנפח של חומר תחליף עור. שימו לב לצורה השונה ולקליבר הסיבים.

יש לייבש דגימות ולהטמיע אותן בשרף כך שכל ההליך יכול להימשך עד מספר ימים אך כולל רק שעתיים-שלוש של עבודות תפעוליות להכנת פתרונות, החלפת פתרונות וכן הלאה. הפקת הנתונים עצמה היא אוטומטית לחלוטין במנגנון HREM וניתן להפיק 1000 תמונות תוך שעתיים-שלוש. לאחר פיתוחו, HREM סלל את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לדרג במדויק את הפנוטיפ של עוברי עכברים מוטנטיים.

דוגמה אחת היא מנגנוני הפענוח של הפרעות התפתחותיות או פרויקט DMDD שבו נעשה שימוש בפנוטיפ של עוברי עכברים קטלניים מבחינה עוברית בפירוט שעדיין לא ידוע. התברר ש-HREM היא גם אלטרנטיבה מצוינת למיקרוסקופ אור מיקומי לבחינת ארכיטקטורת כלי דם, עצבים או סיבים בדגימות רקמות אנושיות.