Name: השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות PVDF-TrFE לגשר עכברוש Transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: חקור שיטה ניתוחית ליצירת גשר בעזרת תעלה פולימרית המכילה תאי שוואן ומטריקס ניתן להזרקה בחוט השדרה של עכברוש. טכניקה זו מקדמת התחדשות אקסונים ושיקום תפקודי לאחר פציעת חוט שדרה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות את וקטור ויראלי ואת חיה ליבות בפרויקט מיאמי תרופה לשיתוק בהפקת הטיפול בבעלי חיים lenti-GFP-וירוס ומספקת, בהתאמה, היסטולוגיה ואת ליבות הדמיה לשימוש של cryostat, מיקרוסקופ קונפוקלי, והוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם החוקר סטריאו. מימון סופק על ידי NINDS (09923), משרד ההגנה (W81XWH-14-1-0482) ואת ה-NSF (DMR-1006510). מ ב בונחה הוא כריסטין E לין נכבדים פרופסור של מדעי המוח.

חולדות פישר למבוגרים נקבות (180-200 גרם משקל) שוכנות על פי הנחיות משרד החקלאות ו- NIH. המוסדיים חיה אכפת שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי אישר כל ההליכים בבעלי חיים-
 1. הכנה לפני השתלת <ol><li>הכנה Conduit-
	<ol><li>לחתוך לצינור 5 מ"מ אורך באמצעות סכין #10 תחת מיקרוסקופ ויבתר. 
		הערה: הקוטר הפנימי של הצינור הוא בין 2.4-2.7 מ"מ; הקוטר החיצוני הוא בין 2.5-2.8 מ מ.</li>
		<li>מקפלים הצינור בעדינות לאורך הצד האורך ( איור 1 א'). חותכים ארבעה חתכים קטנים אודות 0.4 מ"מ לפחות 1 מ מ הפתחים של הצינור אותם על 1 מ מ בנפרד באמצעות שוליים ישרים Vannas מספריים ( איור 1B).
		<ol><li>נפרשים הצינור ( איור 1C) וחותכים בין שני חתכים לאורך באותו הצד יצירת שני חלונות זה לצד זה ( איור 1D). להבטיח כי החלונות יכול להיות נפתח ונסגר כראוי לאורך הצד נימולים.</li>
		</ol></li> <li>לחטא המוליכים 75% אתנול במשך 25 דקות בצלחת פטרי 10-ס מ. לשטוף מתים פעם אחת במשך 4 דקות עם 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ולהעביר המוליכים עם מלקחיים עקר פטרי ס מ-10 החדש. לשטוף את המוליכים פעמיים עם PBS 1 x 25 דקות כל אחד.</li>
		<li>לאחסן המוליכים ב- PBS 1 x עד הניתוח. 
		הערה: תעלות רבים יכולים להיות מעוקר בבת אחת. לאחסן המוליכים mL 1.5 סטרילי נפרד צינורות צנטריפוגה כדי לשמור על סטריליות.</li>
	</ol></li> <li>ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP)-הכנה תאי שוואן (SC) <ol><li>להכין את תרבויות SC מטוהרים מן העצבים בשוקה של פישר נקבה בוגרת חולדות כפי שתואר לעיל 43. בסיום שלב זה, לוח ה-SCs-פולי-L-ליזין (PLL)-מצופה ס מ-10 פטרי ולתחזק במדיום D10/3 מ'; SCs אלה מוגדרים מעבר 0- 
		הערה: D10/3 מ' בינוני מורכב מהפעולות הבאות: 10% עוברית שור סרום (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/דלקת), יותרת המוח µg/mL 20 לחלץ, forskolin 2 מיקרומטר, 2.5 ננומטר heregulin ב Dulbecco &#39; s ששינה הנשר &#39; s בינוני (DMEM).</li>
		<li>לחדש D10/3 מ' טריים בינונית (7 מ ל/10-ס מ פטרי) כל 3-4 ימים.</li>
		<li>תרבות פיצול SC ברגע שהוא מגיע למפגש 70-80%.
		<ol><li>בינוני להסיר ולשטוף פעמיים עם האנק &#39; s מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) ללא סידן או מגנזיום.</li>
			<li>להוסיף 5 מ של 0.25% טריפסין/EDTA כל ס מ-10 פטרי, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
			<li>הוסף 5 מ של D10 בינוני (10% FBS ו 1% עט/דלקת ב- DMEM) לתוך שפופרת צנטרפוגה 50-mL לנטרל טריפסין.</li>
			<li>בעדינות pipet טריפסין/EDTA פתרון לתוך פטרי צלחת מספר פעמים להתנתק SCs. להסיר את המתלים תא מתוך קערה ולמקם אותו לתוך הצינור צנטריפוגה מוכן בשלב הקודם. לשטוף את הצלחת עם 5 מיליליטר D10 בינוני ומניחים אותו לתוך הצינור צנטריפוגה כדי למקסם את הקציר תא.</li>
			<li>Centrifuge התאים ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C. הסר תגובת שיקוע, resuspend את התאים במדיום D10/3 מ מ ל 4 עבור כל פיצול פטרי.</li>
			<li>לוותר על 1 מ"ל של השעיה SC ו 6 מ של בינוני D10/3 מטר לתוך צלחת פטרי 10-ס מ; כל פיצול פטרי תגרום 4 צלחות פטרי. SCs אלה מוגדרים מעבר 1.</li>
			<li>לחדש D10/3 מ' טריים בינונית היום לאחר ציפוי, כל 3-4 ימים לאחר ציפוי.</li>
			<li>פעם ה-SCs להגיע למפגש 70-80%, חזור על שלבים כ- 1.2.3.1 כדי 1.2.3.6. ה-SCs נמצאים על המעבר 2.</li>
		</ol></li> <li>מגלי ה-SCs פעם להגיע למפגש 50%, עם וקטור lentiviral קידוד GFP ב- D10/3 מ' בינוני בן לילה-ריבוי של זיהום של 30 כאמור תיאר 44 , 45 .</li>
		<li>לחדש בינונית טרייה-D10/3 מ' יום למחרת, כל 3-4 ימים לאחר ציפוי.</li>
		<li>לאחר ה-GFP-SCs להגיע למפגש 70-80%, חזור על שלבים כ- 1.2.3.1 כדי 1.2.3.5 אבל resuspend ה-GFP-SCs ב 6 מ של בינוני D10 במקום. לוותר על µL 15 של השעיה GFP-SC לתוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 מ"ל ולהוסיף µL 15 של 0.4% trypan blue פתרון. קפיצי הצינור צנטריפוגה בעדינות, לוותר על 10 µL של התערובת לתא של השקופית ספירת תאים.
		<ol><li>מקום השקופית לתוך מונה הניתן תא אוטומטיות ולקבוע את צפיפות תא.</li>
		</ol></li> <li>Centrifuge התאים ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C. הסר תגובת שיקוע, resuspend 1.5 מ של מדיום מקפיא עבור כל 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispense 1.5 מ ל GFP-SC השעיה לתוך המבחנה קריוגני, הקפאת ב-80 o C עבור פחות 24 שעות לפני העברת חנקן נוזלי לאחסון. 
		הערה: הקפאת בינוני: 25% FBS ו- 8% דימתיל סולפוקסיד ב- DMEM.</li>
		<li>להפשיר GFP-SCs שבוע לפני הניתוח.
		<ol><li>להוסיף 10 מ"ל D10 בינוני לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל.</li>
			<li>להפשיר צלוחיות של GFP-SCs קפוא באמבט מים-37 o C עד חלקית הקרת.</li>
			<li>להסיר את המתלים GFP-SC המבחנה קריוגני ולמקם אותו לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ ל בכיכר 1.2.8.1. בעדינות pipet הפתרון למעלה ולמטה שוב ושוב.</li>
			<li>Centrifuge התאים ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C. הסר תגובת שיקוע, resuspend את התאים במדיום D10/3 מ מ ל 4 עבור כל בקבוקון הקרת.</li>
			<li>לוותר על 2 מ"ל של השעיה GFP-SC ו- 5 מ של מדיום D10/3 מטר לתוך צלחת פטרי 10-ס מ; כל בקבוקון יביא 2 צלחות פטרי. ה-GFP-SCs מוגדרים מעבר 3. 
			הערה: צלחת פטרי ס מ-10 שמשפר בדרך-כלל בסביבות 8 x 10 6 GFP-SCs אחרי שבוע אחד.</li>
		</ol></li> <li>ביום של הניתוח, חזור על שלב 1.2.6. השתמש צפיפות התאים שחושבו בצעד 1.2.10.</li>
		<li>Dispense aliquots של 3 x 10 6 GFP-SCs לתוך צנטריפוגה mL 1.5 סטרילי צינורות בהתבסס על צפיפות תא מחושב מהשלב 1.2.9. Centrifuge את aliquots GFP-SC ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C ולהסיר את תגובת שיקוע. להוסיף 1 מ"ל של DMEM/F12 בינוני לכל aliquot ולכל צנטריפוגה-370 x g... 
		הערה: כל בעל חיים מקבל 3 x 10 6 GFP-SCs-בינוני עם הנסיוב נמצא בשימוש עם GFP-SCs עד שלב זה.</li>
		<li>SCs GFP לשמור בקירור עד הזמן של השתלת.</li>
	</ol></li></ol> 2. להשלים את חיתוך בשמונה רמת בית החזה (T8) <ol><li>בעלי חיים הכנה לניתוח <ol><li>Anesthetize פישר נקבה לעכבר (180-200 גרם) עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לפקח העומק של הרדמה לפני שתמשיך לשלב הבא על ידי בדיקת הבוהן צובט, עין תגובות מהבהב.</li>
		<li>לגלח האחורי של העכברוש עם קוצץ חשמלי ונגב את העור עם 70% אתנול. חומר סיכה אופטלמולוגיות חלות על שתי העיניים. להעביר את החיה אל שולחן הניתוחים על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף כ 37 o C. המקום החיה על הגל, אז החוליות ניתנים לגישה בקלות. 
		הערה: ניתן לבצע את הגליל מגבת נייר או 2 ב x2 הבנתם זה יכולים להיות מעוקר. לחמניות גדולות מומלץ כאשר T7-T9 צריך להיות מונח שטוח מעל לגלגל את.</li>
	</ol></li> <li>T7 כדי T9 laminectomy <ol><li>לאתר את הציון עבור התהליכים קוצניים T9-T11. 
		הערה: הפערים בין T9, T10 T11 קטנים בהשוואה מקטעים אחרים אניn באזור. לאחר הנחת העכבר על הסליל, תהליכים קוצניים T9-T11 תרגיש בליטה משולש קטן דרך העור.</li>
		<li>עושים חתך קו האמצע 4 עד 5 ס מ של העור בעזרת סכין #10 מ- T4 כדי T11. עושים חתך קטן בשכבת שומן שטחית עם מספריים מעוגלים עם קצוות קהים לנתח את השומן. 
		הערה: סוגים אחרים של כלי נגינה ניתן להשתמש כדי להפריד את השומן אך מספריים מעוקל, עם קצוות קהים לאפשר השיטה היעילה ביותר, לפחות פולשני עבור הפרדת השמן.</li>
		<li>לאתר את T7 לתהליכים קוצניים T9 באמצעות גב הלהב #10. . תחזיק את השריר-על T4 עם מלקחיים בוטה, לבצע חתך בשריר לאורך כל צד של החוליות T6-T10. . תחתוך כמה שיותר קרוב החוליות ככל האפשר לעשות חור נקי, תגרום לפגיעה מינימלית החיה.</li>
		<li>לבודד כל בודדים תהליכים קוצניים מ- T7 T9 על ידי חיתוך של השרירים והרצועות בין T6, T7, T7 ו T8, T8 T9, ושל T9 T10 עם להב #10-</li>
		<li>השתמש rongeur כדי להסיר כל השרירים והרצועות על שנבזזו T7 כדי T9. להסיר את השרירים והרצועות רוחבית ככל האפשר עד הפערים בין התהליכים רוחבי של T7 כדי T9 גלויים.</li>
		<li>להסיר תהליך קוצניים T9 עם rongeur. להחזיק את תהליכים קוצניים T8 עם מלקחיים בוטה ולהרים בעדינות כדי לרומם את הנדן T9 בפתח קטן בין התהליכים T9, T10-</li>
		<li>להסיר את הנדן החל מפתיחת ונע rostrally עם rongeur-T9. להסיר את הנדן רוחבית ככל האפשר; שורשי העץ יהיו גלויים לאחר laminectomy.</li>
		<li>ברגע הנדן מוסר, חזור על התהליך עבור T8 ו- T7. 
		הערה: במהלך laminectomy, להשתמש הקליטה ספירס להסיר דם בעוד בהמשך laminectomy. אם עודף דימום מתרחשת, למקם ספוג דחוס באתר דימום ולהוסיף מלח כדי לעזור עם קרישת הדם-</li>
	</ol></li> <li>חיתוך-T8 <ol><li>למקם את המדחק סביב T7 כדי T9. לאחר כל שנבזזו מוסרות, ודא כי הפערים בין התהליכים רוחבי גלויים, במיוחד בזמן T8. גם לבחון את העצמות לאורך שני הצדדים בין T7 כדי T9 כדי להבטיח ישנם אין שברי עצמות בולטות כלפי חוץ. 
		הערה: את הפער הזה-T8 חשוב עבור ביצוע של חיתוך מלאה. החוליות לאורך להסירם עבור הכניסה צינור קל יותר.</li>
		<li>לחתוך את הגבי ו הגחוני / שורשים מעל ומתחת T8 שימוש בזווית מעיין מספריים. הוסף תמיסת מלח בחוט השדרה ולחכות על הדם הקריש. הערה: השלב זה חשוב להכנסה צינור מתאים.</li>
		<li>למקם את המספריים האביב בזווית מעל חוט השדרה הפערים בין התהליכים רוחבי-T8 ולעשות אחד1 לנתק לחלוטין את חוט השדרה. מניחים חתיכה קטנה של קצף דחוס לתוך הפער שנוצר 2-2.5 ממ ולהוסיף את תמיסת מלח לאזור מיד.</li>
	</ol></li></ol> 3. צינור הכניסה <ol><li>בעת המתנה גדמי כבל קטועה להגיע hemostasis, להוציא את צינור מהערוץ 1 x. לחתוך את המשולשים הקליטה לחתיכות ארוך דק, למקם אותם לתוך הצינור כדי להסיר עודפי PBS. בדוק כי החלונות חתוכות מראש פתוחות.</li>
	<li>להסיר את תמיסת מלח ודם באמצעות דק פיסות הקליטה משולשים. הרם את שני העצים הגדועים של חוט השדרה באמצעות microspatula כדי להבטיח הפרדה טובה. בעדינות הרם את הגדם rostral עם microspatula, להחליק את הצינור על הגדם עם החלונות הפונים עצמו. להבטיח הגדם כולו מוכנס אין עודף דימום לתוך הצינור.</li>
	<li>בעדינות הרם את הגדם סימטרית, להחליק את הקצה השני של התעלה על הגדם. ודא כי הגדם כולו מוכנס, החלונות הם על המשטח הגבי ( איור 2 א).</li>
</ol> 4. תאי שוואן / מטריקס להזרקה (ראה טבלה של חומרים) הכנה, הזרקת <ol><li>בעת המתנה חוט קטועה להגיע hemostasis, להסיר את המדיום מעל בגדר GFP-SC (להכין בשלב 1.2). Resuspend ה-GFP-SCs ב 10 µl של DMEM קר/F12. להוסיף 10 µl של ג'ל להזרקה קר התליה תא ומערבבים היטב על ידי חזר pipetting. לשמור את התערובת מטריקס GFP-SC/DMEM/F12/להזרקה על הקרח עד צינור הכניסה הושלמה.</li>
	<li>אחרי שתוודא כי החלונות על פני השטח הם הגבי לפתוח ( איור 2 א), להזריק µl 20 של תערובת מטריקס GFP-SC/DMEM/F12/להזרקה לתוך הצינור דרך לאחד windows חתוכות מראש 46 באמצעות אבן חשופה המערבי טעינת עצה ו- micropipette. אם התערובת מטריקס SC/DMEM/F12/להזרקה צריך תמלא יותר מדי הצינור, להסיר את עודף עם הקליטה משולשים. סגור את החלון לאחר ההזרקה; תפירת אינו זקוק ( איור 2B).</li>
</ol> 5. פצע הסגר ולדאוג לאחר הניתוח <ol><li>תפר השריר שכבות ושכבות שומן שטחית. לנקות את העור עם 70% אתנול והידוק ואז (למשל, באמצעות סרטוני הפצע) סגור העור. שמור את החיות חממה תרמית מוסדר עד שהם ישובו להכרה. העברת החיות בחזרה לתוך הכלובים. לספק מים צינור האכלה ארוך ומניחים באוכל שלהן על מצעים לגישה קלה.</li>
	<li>מנהל הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) פעמיים ביום למשך 3 ימים subcutaneously מתחיל מיד לאחר הניתוח כדי להפחית את הכאב. מזריקים gentamycin (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) subcutaneously פעם ביום במשך 7 ימים מיד לאחר הניתוח כדי למנוע ולצמצם את זיהום. להזריק 10 מ"ל של פתרון פלאפונים lactated subcutaneously פעמיים ביום במשך 7 ימים לטיפול בהתייבשות.</li>
	שלפוחיות <li>ריק באופן ידני פעמיים ביום עד שלפוחית השתן הפונקציה מחזירה. אם מתרחשת דלקת בשלפוחית השתן, ואז לנהל 10 מ ל תמיסת מלח subcutaneously עד השתן הופך ברור. אם אין שיפור תוך יומיים, להזריק gentamycin (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף, ופעם ביום) subcutaneously עד השתן הופך ברור.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השלב הקריטי ביותר ביצירת מודל חיתוך יעיל קטיעת חוט השדרה ב חתכים אחד או שניים. פער 2-2.5 מ מ בין ליער rostral, סימטרית השדרה צריך להיות נוכח באתר חיתוך. הסיבות ככל הנראה שלושה פער לא מופיע הן שורשים הגחוני הגבי / / (1) שלא הוסרו כראוי, (2) דורא הגחון לא הוסר כראוי, ו/או היה (3) בעל החיים אינו ממוקם כראוי על הסליל להציב תחתיה.
כדי לבצע ההכנסה conduit יעיל בין גדמי: (1) הקוטר של הצינור שלתלמידים מינים ספציפיים, הגיל של החיה המשמשים את הניסוי; (2) שנבזזו להסירו מספיק רוחבית עד, ניתן לאבחן את הפער...

תיקון פגיעה בחוט השדרה הוא בעיה מורכבים ומאתגרים שיחייבו טיפול קומבינטורית אסטרטגיה מעורבים, לדוגמה, השימוש של תאים biomaterial לפרנס microenvironment חיובית ותפקוד התאים המושתלים האקסון התחדשות באתר של פציעה. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 , חיתוך מלא10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 מודלים משמשים לעתים קרובות כדי להעריך את ההשפעות של biomaterial מבוססי טיפולים גישור. היתרון של שימוש דגם hemisection הוא כי הוא מספק יציבות יותר הבונה גישור לעומת חיתוך מלאה. עם זאת, hemisection דגמים, קשה להוכיח התחדשות האקסון כפועל של השיטה הטיפולית יישומית בשל נוכחותם של רקמות והבחירה הנכונה מצילה. המודל חיתוך מלאה היא השיטה ואינטלקטואלית כדי להדגים האקסון התחדשות.
חומרים טבעיים וסינתטיים שונים נחקרו לשימוש ג'ל להזרקה, ג'ל הקבועים מראש להציב החבורה או מודלים hemisection, או כצינור תקשורת מובנית לתוך hemisection או להשלים חיתוך מודלים (מפורט את הדעת23 , 24 , 25). בחיי עיר ג'לי של תערובת להזרקה מטריקס/SC יוצר ממשק יותר מתירני בין ההשתלה את כבל מארח האקסון המעבר26,27 לעומת מטריקס וג'ל מראש/SC שתלים 5 , 18 , 19 , 28. בחיי עיר ג'לי מותר המטריקס כדי ליצור מתאר סביב הממשקים המארח לא סדיר בעוד צינור קשיח ומובנים יותר או פחות moldable ג'ל הקבועים מראש לא יכול. צינור מובנים לעיתים קרובות מספק הדרכה קשר ויציבות השתל לעומת מטריקס להזרקה. הפרוטוקולים המובאת כאן לתאר את הליך כירורגי מנצל של מטריקס להזרקה קרום המרתף (למשל, matrigel, ראה הטבלה של חומרים, המכונה כמו מטריקס להזרקה כאן) והן צינור מובנים הערכת האקסון התחדשות במודל פגיעה בחוט השדרה ואינטלקטואלית.
Electrospun פולי-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) מיושר תעלות חלול סיביים משמשים בגישתנו ניסיוני. PVDF-TrFE הוא פולימר פיזואלקטריים יוצר מטען ארעי כאשר מכנית מעוות ולא הוכח לקדם התחדשות האקסון והסיומת neurite הן במבחנה29,30 , ויוו בתוך 31. Electrospinning היא שיטה נפוצה לגרדום פבריקציה נוספת שיכול לייצר במהירות אמין פיגומים סיביים באמצעות מגוון של פולימרים עם מאפיינים לשליטה כגון יישור סיבים, סיבים בקוטר עובי לגרדום עבור 33,32,עצבית ויישומים אחרים34.
מחקרים רבים של עכברוש SCs מושתלים לתוך חוט השדרה פגיעה באתרים הראו הטיפול היעילות5,9,18,19,20,21 ,26. השתלות אלה הן neuroprotective בשביל לרקמות שמסביב לפצע, לצמצם את גודל חלל הנגע, לקדם התחדשות האקסון לתוך הנגע/השתלת האתר ואת myelination של האקסונים מחדש. יכול להיות מושתלים autologously SCs אנושי, יתרון לעומת שאר עצביות הקשורות תאים24. לאחר ביופסיה במערכת העצבים ההיקפית, SCs יכול להיות מבודדת וטיהרו ו ותתנהל כדי הסכום הרצוי עבור השתלת לתוך בני אדם. עצמיים השתלת SC לחולים חוט השדרה נפגע הוכח כדי להיות בטוחים איראן35,36,37,38,39,סין40, ו ארצות הברית41,42. SCs ידועים להפריש מספר גורמים neurotrophic של מטריצה חוץ-תאית חלבונים חשובים לצמיחה האקסון וכדי לשחק תפקיד חיוני האקסון התחדשות לאחר פגיעה במערכת העצבים ההיקפית. מטרתנו כאן היא לתאר את שיטות אשר יכולים לחקור conduit עיצובים כדי לשפר את התוצאה של השתלת SC במודל חיתוך בחוט השדרה עכברוש שלם.

<table><tbody><tr><td>בקבוקונים קריוגניים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 10 ס"מ</td><td>VWR</td><td>25382-428</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco: תערובת חומרים מזינים F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039-021</td><td>"DMEM/F12" בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td> <td>"עט/סטרפטוק" בפרוטקול.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Hyclone</td><td>SH300-70-03</td><td>"FBS" בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>תמצית יותרת המוח</td><td>טכנולוגיות ביו-רפואיות</td><td>BT-215</td><td></td></tr><tr><td>פורסקולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>הרגולין</td><td>R& D Systems</td><td>396-HB/CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>"PLL" בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td><td>"DMEM" בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td><td>"HBSS" בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>נקבת חולדת פישר (160-180 גרם)</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים, ישר</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>Vedco Inc</td><td>5098976106</td><td>100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>לויד בע"מ</td><td>AnaSed</td><td>20 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-010-02</td><td>יכול להיות כל מותג לבחירה.</td></tr><tr><td>מיקרו מרית</td><td>FST</td><td>10089-11</td><td>יכול להיות כל מותג לבחירה.</td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים עם קצה קהה</td><td>FST</td><td>14017-18</td><td>יכול להיות כל מותג לבחירה.</td></tr><tr><td>מלקחיים קהים</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td>יכול להיות כל מותג לבחירה.</td></tr><tr><td>rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td>יכול להיות כל מותג לבחירה.</td></tr><tr><td>מספריים קפיציים זוויתיים</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td>יכול להיות כל מותג לבחירה.</td></tr><tr><td>משולשי ספיגה</td><td>FST</td><td>18105-03</td><td>יכול להיות כל מותג לבחירה.</td></tr><tr><td>קצף ג'ל</td><td>הנרי שיין</td><td>9083300</td><td>"קצף דחוס" בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>#10 להבים</td><td>Sklar</td><td>06-3010</td><td>יכול להיות כל מותג לבחירה.</td></tr><tr><td>מטריגל</td><td>קורנינג</td><td>354234</td><td>"מטריצה להזרקה" בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>נוגדן חלבון פלואורסצנטי עוף נגד</td> ירוק <td>Millipore</td><td>AB16901</td><td></td></tr><tr><td>עכבר RT97 נוגדן היברידומה</td><td>DSHB</td><td>RT97</td><td></td></tr><tr><td>ארנב נוגדן נגד נוירופילמנט</td><td>Encor Biotechnology, Inc</td><td>PRCA-NF-H</td><td></td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי גליה נוגדן חלבון חומצי סיבי</td><td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עיזים אנטי עוף IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 עז נגד ארנב IgG (H+L)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 עז נגד ארנב IgG (H+L)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21244</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 עז נגד עכבר IgG (H+L)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית</td><td>ניקון</td><td>clsi</td><td></td></tr></tbody></table>

השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות pvdf-trfe לגשר עכברוש transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער

Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

בין מודלים שונים עבור פגיעה בחוט השדרה אצל חולדות, המודל החבורה משמש לעתים קרובות ביותר כי הוא הסוג הנפוץ ביותר של פגיעה בחוט השדרה האנושית. המודל המלא חיתוך, אמנם לא כמו קלינית הרלוונטיים כמודל החבורה, היא השיטה ואינטלקטואלית כדי להעריך את האקסון התחדשות. במודל החבורה, קשה להבחין מחדש של אקסונים נבט או והבחירה הנכונה מצילה בשל נוכחותם של הנותרים רקמות שלאחר הפציעה. במודל חיתוך מלאה, שיטת הגישור יש צורך למלא את הפער וליצור המשכיות של rostral גדמי סימטרית על מנת להעריך את האפקטיביות של הטיפולים. ניתוח גישור אמין חיוני כדי לבדוק את התוצאה אמצעים על-ידי הפחתת מידת ההשתנות בשל שיטת. הפרוטוקולים המתוארים כאן משמשים להכנת שוואן תאים (SCs), תעלות לפני ההשתלה, חיתוך מלאה של חוט השדרה החזי רמה 8 (T8), הכנס את הצינור ולאחר השתלת SCs לתוך הצינור. גישה זו משתמשת גם בחיי עיר ג'לי של מטריקס קרום המרתף בזריקות עם השתלת SC המאפשר צמיחה האקסון משופרת על פני הממשקים rostral וסימטרית עם רקמת המארח.

מטרת השימוש בטכניקה כירורגית זו היא להעריך את השימוש של צינור מובנית ו מטריצה להזרקה בדימונה SC פונקציה לאחר השתלת לתוך שידרה transected הושלמה. שלושה שבועות לאחר ההשתלה, החיות הן perfused עם 4% paraformaldehyde, העמודות השדרה בגסות גזור, תיקנו את לשבועיים זהה עבור עוד 24 שעות ביממה. חוט השדרה הוא לאחר מכן גזור, הדגימות למקטעי הווריד cryostat ממוקמים בתוך 30% סוכרוז פתרון עבור cryoprotection. חתכי רוחב בעובי 1 מ מ מבודד באמצע הגשר SC של קבוצה נוספת של ביתור שידרה ממוקמים לתוך גלוטראלדהיד ...

מאמר זה מתאר שיטה להוספת צינור חלול בין גדמי חוט השדרה לאחר חיתוך מלא מילוי עם תאי שוואן (SCs), קרום המרתף להזרקה מטריקס על מנת לגשר, לקדם התחדשות האקסון על פני הפער.

השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות PVDF-TrFE לגשר עכברוש Transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

המטרה הכללית של הליך התערבות כירורגית זה היא להשתמש בצינורית (conduit) ממולאת בתאי Schwann ובמטריצה הניתנת להזרקה כדי להקים גשר בין קצוות קרועים לחלוטין של חוט השדרה, במטרה לעודד התחדשות של אקסונים לרוחב הגשר. מטרתנו היא לגשר על אתר פגיעה בחוט השדרה בחולדה כדי לשחזר תפקוד. הפגיעה שאנו משתמשים בה היא יצירת מרווח של קטיעה מלאה.רק באמצעות סוג זה של פגיעה נוכל לומר בוודאות שהאקסונים התחדשו כאשר נמצא אותם באתר הפגיעה. הגשר שבו אנו משתמשים הוא תעלה פולימרית המכילה תאי Schwann, שכן תאי Schwann חשובים מאוד להתחדשות של אקסונים. בסרטון זה אנו מראים כיצד להחדיר גשר כזה למרווח של קטיעה מלאה.חוקרים שאינם מנוסים בשיטה זו יזדקקו לתרגול, שכן כריתה מלאה של חוט השדרה והחדרת התעלה עלולות להיות מאתגרות עבור מתחילים. לפני תחילת הפרוצדורה, השתמשו בלהב מספר 10 כדי לחתוך את התעלה לאורך חמישה מילימטרים. ניתן לבצע זאת גם תחת מיקרוסקופ דיסקציה אם תעדיפו.קפלו את התעלה בעדינות לאורך הצד האורכי והשתמשו במספרי Vannas בעלי קצה ישר כדי לבצע ארבעה חתכים קטנים באורך של כ-0.4 מילימטרים, במרחק של לפחות מילימטר אחד מהפתחים ובמרווחים של כמילימטר אחד זה מזה. לאחר מכן, פתחו את התעלה וחתכו בין שני החתכים לאורך אותו צד כדי ליצור שני חלונות זה לצד זה, תוך וידוא שניתן לפתוח ולסגור את החלונות כראוי לאורך הצד שלא נחתך. כדי לבצע למינקטומיה ב-T7-T9, לאחר אישור היעדר תגובה לצביטה בבהונות בחולדת Fischer נקבה מורדמת במשקל 180 עד 200 גרם, אתרו את נקודת הסימוכין עבור התהליכים הקוצים ב-T9-T11.הם יורגשו כבליטה משולשת קטנה דרך העור. באמצעות להב מספר 10, בצעו חתך עורי במרכז הגב באורך ארבעה עד חמישה סנטימטרים מ-T4 ועד T11, ולאחריו חתך קטן בשכבת השומן השטחית באמצעות מספריים בעלי קצוות עגולים ועקומים. לאחר דיסקציה של השומן, השתמשו בלהב מספר 10 כדי לאתר את הזיזים הספינליים T7-T9 והשתמשו בפינצטה קהה כדי להחזיק את השריר באזור T4. בצעו חתך בשריר לאורך כל צד של החוליות מ-T6 ועד T10, קרוב ככל האפשר לחוליות, כדי ליצור פתח נקי ולגרום לפגיעה מינימלית בבעל החיים.מקמו את המרחיב (retractor) מסביב ל-T7 עד T9. השתמשו בלהב מספר 10 כדי לחתוך את השרירים והרצועות שבין הבליטות האינדיבידואליות מ-T6 עד T10, והשתמשו ברוןגור (rongeur) כדי להסיר כל שריר או רצועות מהלוחיות (laminae) מ-T7 עד T9 בצורה לטרלית ככל האפשר. כאשר הרווחים בין הבליטות הרוחביות מ-T7 עד T9 נראים, השתמשו ברוןגור כדי להסיר את בליטת הספיין (spinous process) של T9, תוך הרמה עדינה של בליטת הספיין של T8 באמצעות פינצטה קהה כדי להרים את הלוחית של T9 בפתח הקטן שבין הבליטות של T9 ו-T10. לאחר מכן, השתמשו ברוןגור כדי להסיר את הלוחית בצורה לטרלית ככל האפשר, החל מהפתח ובנסיעה רוסטרלית ב-T9. כאשר כל הלוחיות הוסרו, ודאו שהרווחים בין הבליטות הרוחביות נראים, במיוחד ב-T8, ובדקו את העצמות משני הצדדים בין T7 ל-T9 כדי לוודא שאין שברים עצמיים בולטים החוצה; השורשים הדורסליים אמורים להפוך לנראים.באמצעות מספרי קפיץ זוויתיים, גזרו את השורשים הגביים והבטניים מעל ומתחת ל-T8 והוסיפו סלין למחבל השדרה כדי לסייע בעצירת הדימום. לאחר מכן, הניחו את מספרי הקפיץ הזוויתיים מעל חוט השדרה ברווחים שבין התהליכים הרוחביים ב-T8 ובצעו חיתוך אחד כדי לנתק לחלוטין את רקמת העצב. הכניסו פיסה קטנה של ספוג דחוס לתוך המרווח שנוצר, ברוחב של 2 עד 2.5 מילימטר, והוסיפו מיד סלין לאזור.בזמן ההמתנה להשגת המוסטזיס בקצוות השכיחים של השרירי השבורים, גזרו משולשי ספיגה לרצועות דקות וארוכות והוציאו צינורית (conduit) מאחסון ב-PBS. הכניסו מספר משולשים לתוך הצינורית כדי להסיר PBS עודף ולוודא שהחלונות הגזורים מראש פתוחים. לאחר מכן, הסירו את המצע מתוך כדורית של GFP Schwann Cell ושעו את תאי השוואן (Schwann Cells) ב-10 microliters של DMEM/F-12 קר.הוסיפו 10 µL של ג'ל הניתן להזרקה מקורר לתרחיף התאים וערבבו היטב באמצעות פיפוט חוזר. לאחר מכן, הניחו את תרחיף התאים על קרח. כאשר השאריות של חבל השערה מוכנות, הסירו את הספוג הדחוס ולאחר מכן השתמשו ברצועות ארוכות של משולשי ספיגה כדי להסיר את הסליין והדם מאזור הלמינקטומיה.לאחר מכן, השתמשו במרית מיקרוסקופית כדי להרים בעדינות את השארית הרוסטרלית (rostral stump) והשחילו את הצינור מעל השארית כאשר החלונות פונים כלפי מעלה, תוך הקפדה על כך שכל השארית מוחדרת ושאין דימום עודף לתוך הצינור. הרימו בעדינות את השארית הקודאלית (caudal stump) והשחילו את הקצה השני של הצינור מעליה, תוך הקפדה על כך שכל השארית מוחדרת ושהחלונות נמצאים על הפנימה הדורסלי. לאחר מכן, השתמשו במיקרופיפט עם טיפ להעמסה של western blot כדי להזריק 20 µL של תערובת המטריקס להזרקה של תאי Schwann עם GFP לתוך הצינור דרך אחד החלונות החתוכים מראש, וסגרו את החלונות.הערה אזהרה. חשוב מאוד לטפל בקצות השגורים של חוט השדרה במהירות ובזהירות רבה ככל האפשר. עיכוב עלול לגרום לנפיחות של הקצוות, מה שיהפוך את החלקת התעלה מעל חוט השדרה לקשה יותר ויגרום לפגיעה נוספת.שלושה שבועות לאחר השתלה, תמונות פלואורסצנציה קונפוקאליות של חתכי רקמת שדרה סגיטליים מקריוסטט חושפות התפלגות אחידה של תאי שוואן (Schwann Cells) לאורך ובתוך הצינור, וכן כלי דם ואקסונים מיאליניים במרכז הגשר. התחדשות האקסונים קשורה באופן הדוק לנוכחות תאי שוואן, מה שמאשש את יעילות השימוש בגשר תאי שוואן בתוך צינור מובנה כדי לעודד התחדשות אקסונים לאורך הגשר בין השאריות הראשונית (rostral) והזנבית (caudal). לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים הליך זה בתוך 45 דקות כאשר הוא מבוצע כראוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מעקב EndoRay, כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, כמה אקסונים משתקמים אל תוך הגשר וכמה מהם יוצאים מהגשר כדי להיכנס מחדש אל חוט השדרה? לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע קיטוע של חוט השדרה, להחדיר צינורית ולהזריק תאים בתוך מטריצה כדי ליצור גשר אמין עבור התחדשות אקסונים והערכות תוצאה אחרות.

transplantation-schwann-cells-inside-pvdf-trfe-conduits-to-bridge

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פגיעה טראומתית בחוט השדרה משבש את התקשורת עם המוח. כדי לשחזר קישוריות איבד אנו מנצלים שתל העצב ההיקפיים לספק תשתית של סיבים התחדשות בשילוב עם גורמים neurotrophic מטריקס ו-ויסות אנזימים להסיר מולקולות המעכבות כדי לקדם את צמיחת למרחקים ארוכים.

שילוב העצבים ההיקפית השתלת ומטריקס אפנון לתקן את חוט השדרה עכברוש נפגעים

קחו חולדה מורדמת עם עצב סיאטי ימני חשוף ושלם, השולט בתנועת הרגליים והתחושה.כריתת מקטע עצבי, יצירת פער, ניתוק האקסונים העצביים ושיבוש העברת האות.האקסונים הדיסטליים המנותקים מתדרדרים, ומנתקים תאי תיקון עצבים מיוחדים או תאי שוואן.תפרו פיגום עצב מוליך ביוני, צינור רך עם מיקרו-ערוצים, לאפינוריום, השכבה החיצונית של העצב, בשני הקצוות החתוכים.אלקטרודות שתל מזווגות ליד קצות העצבים, ומעבירות חוטים מתחת לעור לחלק האחורי של הצוואר.הפעל גירוי חשמלי מתמשך, והעביר פולסים עדינים לפיגום.תאי שוואן מהקצה הדיסטלי...

תיקון עצבי באמצעות פיגום מוליך ביוני בשילוב גירוי חשמלי

מקור: Lee, Y., et.al. השתלת תאי שוואן בתוך צינורות PVDF-TrFE כדי לגשר על גדמי חוט השדרה של חולדה כדי לקדם התחדשות אקסונים על פני הפער. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את השימוש בצינור פולימרי פיזואלקטרי שנזרע בתאי שוואן כדי לקדם התחדשות אקסונים בחוט השדרה של חולדה שעבר טרנסקטציה. הצינור מספק הנחיה מבנית, בעוד שתכונותיו הביו-אלקטריות מעוררות צמיחת נויריטים. תאי שוואן בתוך הצינור מפרישים גורמים נוירוטרופיים, התומכים בגישור אקסונלי בין גדמי הרוסטרל והזנב.

צינורות זרעי תאי שוואן להתחדשות אקסונלית לאחר פגיעה בחוט השדרה

מטריצות הפיברין המכילות גורמי גדילה שימשו כדי לשמר את תאי גזע עצביים מורכבים לתוך אתרים של חיתוך רוחב חוט השדרה. תאים מורכבים מלאים לחלוטין חלל הנגע ומובחן לסוגים שונים עצבי תאים, כוללים תאי עצב שהשתרעו אקסונים לחוט השדרה מארח על פני מרחקים ארוכים.

קידום ההישרדות וההתמיינות של תאי גזע עצביים עם פיברין וקוקטיילי גורם גדילה לאחר פגיעה בחוט השדרה חמורה

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במערכת רדיו telemetric להקליט פרמטרים לב וכלי דם בחולדות חוט השדרה T4 transected שמונה שבועות לאחר תאי גזע עצביים בגזע מוח העוברי השתלה לאתר הנגע. טלמטריה היא טכניקה מתקדמת לאבחון תפקוד לב וכלי דם אצל חולדות שנפגעו נעו בחופשיות מודעת חוט השדרה באופן מדויק.

מערכת רדיו-telemetric לפקח פונקצית לב וכלי דם אצל חולדות עם חוט השדרה חיתוך רוחב ועוברי גזע עצבי שתלי סלולארי

פגיעה בחוט השדרה היא מצב טראומטי שגורם לתחלואה קשה ותמותה גבוהה. בעבודה זו אנו מתארים בפירוט מודל חבלה של פגיעה בחוט השדרה בעכברים ואחרי השתלה של תאי גזע עצביים.

השתלת תאי גזע עצבית בדגם ניסיוני של Contusive פגיעה בחוט השדרה

פגיעות חמורות בחוט השדרה גורמות לעתים קרובות למומים ברקמות. שתי אפשרויות מתוארות כדי לגשר בהצלחה על פערים כאלה כדי לקדם הסתגלות רקמות, תגובות רגנרטיביות ושיפור תפקודי בחולדות באמצעות השתלת מערכת מיקרו-מחברים מכנית לאחר פציעה חריפה וחמישה שבועות לאחר חתך מלא של חוט השדרה.

אסטרטגיות ניסיון לגשר על פערים גדולים של רקמה בחוט השדרה נפגע לאחר חריפת נגע כרוני

כאן, אנו מציגים טכניקת in vivo להעברת גנים לתאי שוואן (SCs) בעצב הסיאטי של המכרסם. טכניקה פשוטה זו שימושית לחקירת מנגנוני איתות המעורבים בפיתוח ותחזוקה של SCs מיאלינים.

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

אלקטרופורציה היא גישה יעילה כדי לספק את הגנים של אינטרסים לתוך תאים. על-ידי החלת גישה זה ויוו על הנוירונים של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון (DRG), נתאר מודל ללמוד האקסון התחדשות בתוך vivo.

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

וידאו זה מדגים את מודל orthotopic השתלת מסתם אאורטלי כמודל פשוט ללמוד את הפיתוח של vasculopathy ההשתלה (TVP) בחולדות.

Orthotopic אבי העורקים להשתלות: מודל עכברוש לחקר התפתחות vasculopathy כרונית

חקור שיטה ניתוחית ליצירת גשר בעזרת תעלה פולימרית המכילה תאי שוואן ומטריקס ניתן להזרקה בחוט השדרה של עכברוש. טכניקה זו מקדמת התחדשות אקסונים ושיקום תפקודי לאחר פציעת חוט שדרה.

השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות PVDF-TrFE לגשר עכברוש Transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער

גלה סרטונים נוספים