Name: במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: למדו שיטת הקלטה אלקטרופיזיולוגית של עצבים תחושתיים במעי הגס של חולדות במודל אקס ויוו. השיטה מאפשרת חקר תכונות מכניות-תחושתיות ומנגנוני כאב ויסרלי במחלות מעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקי מחקר את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (#31171066, #81270464) ומרכז המדע הגרמני-סין (GZ919).

פרוטוקול הניסוי דיווחו כאן אושרה על ידי חיה אתי הוועדה של שנחאי ג'יאוטונג של הספר לרפואה של אוניברסיטת (# SYXK2013-0050). ניתוח colorectum עם שלם גנגליון, עצבים תא המטען לוקח מינימום של 15 דקות לאדם די מנוסים בטכניקה זו. לכן, יש לשמור את בעלי החיים אבל בחיים תחת הרדמה עמוקה בזמן ביצוע ניתוח, כדי להבטיח יכולת הקיום של הרקמה להקלטה אלקטרופיזיולוגיות עוקבות.
 1. הכנה של פתרון זלוף ותרכובות מבחן <ol><li>להכין 5 L של קרבס פתרון: 113 מ מ NaCl, מ מ 5.9 אשלגן כלורי, 1.2 מ מ NaH 2 PO 4, 1.2 מ מ MgSO 4, 25 מ מ NaHCO 3, 1.2 מ מ CaCl 2 , וגלוקוז 11.5 מ מ. להרוות את הפתרון עם 95% O 2 + 5% CO 2 תערובת. מראש מגניב ~ 500 מ של קרבס מחומצן במקרר.</li>
	<li>הכנת aliquots של מניות מבחן תרכובות (קפסאיצין 1 מ מ באתנול וביו -10 מ מ 5-hydroxytryptamine (5-HT) בתוך תמיסת מלח) לפי הצורך. לדלל את המניה בקרבס (עבור יישום אמבט) וב -תמיסת מלח (עבור ניהול intraluminal) לריכוז סופי רק לפני השימוש.</li>
</ol> 2. הכנת האלקטרודה הקלטה <ol><li>למשוך האלקטרודה הקלטה סטנדרטי זכוכית צינורות ללא חוטים הפנימי (הקוטר החיצוני של 1.5 מ מ) באמצעות של פולר אלקטרודה קונבנציונלי. התאם את הגדרות פולר חום ולמשוך כך הדוקרן של האלקטרודות משך הוא בין 20 ו- 25 מ מ.</li>
</ol> 3. אוסף רקמה <ol><li>להרדים את החולדה עמוקות באמצעות סודיום פנטוברביטל (80 מ"ג/ק"ג, i.p.). </li> <li>תוך הקפדה על עקרות, לחשוף את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך קו האמצע בדופן הבטן בעזרת אזמל. למשוך את מצע המעי לרקמות אחרות הצידה כדי לחשוף את colorectum.</li>
	<li>במקום החיה תחת המיקרוסקופ ויבתר. דרך ניתוח זהיר, לאתר את PG השמאלי ולזהות את PN, את LSN להצטרף זה. לחתוך עצבים אלה כמה מילימטרים בלבד עמ' 
	הערה: PG נמצא קרוב לצומת המעי הגס. בדרך כלל, 3-4 PN חוט השדרה lumbosacral, פרוייקט LSN PG ( איור 1).</li>
	<li>לחתוך את העצם symphysis לחשוף את פי הטבעת. הסרת הרקמות (קרי, שלפוחית השתן, וכו ') מעל colorectum; יש להקפיד להשאיר את עמוד שלם.</li>
	<li>להקריב את החולדה על ידי הזרקה תוך ורידי של מנת יתר של פנטוברביטל. Transect המעי הגס 3 ס מ מעל PG ולהסיר את colorectum מן החיה באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>להעביר את colorectum צלחת פטרי מלא עם פתרון קרבס טרום מקורר. הסר את הצואה על ידי שטיפה בעדינות את המעי הגס. להסיר את שלפוחית השתן שריד ורקמות אחרות בקפידה, מבלי להתפשר על עמ'</li>
</ol> 4. דיסקציה של העצבים מביא חוקן <ol><li>למקם את המעי הגס לתא הקלטה (20 מ ל), perfuse את הרקמה באופן רציף עם carbogenated פתרון קרבס. הגדרת הקצב זלוף-15 מ"ל לדקה</li>
	<li>נקרר את colorectum בשני קצותיו אוראלי, אנאלי. נתחיל העירוי intraluminal של המעי הגס עם תמיסת מלח בקצב של 10 מ"ל/h – בכתב על כיוון אנאלי.</li>
	<li>אתר של PG הגדולות תחת המיקרוסקופ ויבתר. להשתמש בפינים חרקים כדי לחשוף גנגליון. עם ניתוח זהיר, למצוא ענף בסדר של עצב שמקורם גנגליון, רץ לכיוון המעי הגס ( איור 1). חתך העצב קרוב גנגליון. 
	הערה: איור 1 מדגימה הקלטה מענף עצב דיסטלי כדי עמ' ככל הנראה, העצב מכיל תערובת של האגן ועמוד שדרה וכן סיבים מביא splanchnic. לחלופין, הקלטה יכול להתבצע על PN ו/או את LSN הפרוקסימלית עמ'</li>
	<li>להפעיל חימום ואמבט חם הפתרון קרבס כדי לשמור על הטמפרטורה קאמרית ב ± 0.5 34 מעלות צלזיוס.</li>
</ol> 5. הכנת האלקטרודה שאיבה <ol><li>לקחת על פיפטה מזכוכית מראש משך (שלב 2), יש לבדוק אותו תחת המיקרוסקופ ויבתר. לשבור את קצה האלקטרודה עם זוג מלקחיים כך שיהיה תואם הקוטר של עצב שיירשמו בגודל.</li>
	<li>מסגרת משופעת הקצה על-ידי הצבתו קרוב קרני אור בהיר יותר.</li>
</ol> 6. הקלטה אלקטרופיזיולוגיות <ol><li>חיבור האלקטרודה משופע עם בעלי אלקטרודה. מזרק 10-mL להתחבר ליציאה בצד את המחזיק להחלת לחץ שלילי או חיובי על האלקטרודה.</li>
	<li>להתחבר המחזיק headstage של bioamplifier והר את headstage על גבי תחמן.</li>
	<li>לעבור האלקטרודה האמבט רקמות ולמלא את האלקטרודה עם הפתרון קרבס על-ידי החלת יניקה עדינה עד זה יוצר קשר החוט כסף של בעל. מקם קצה האלקטרודה קרוב לסוף חיתוך העצב והפעילו לחץ שלילי למצוץ העצב אל האלקטרודה. הפעילו לחץ שלילי יותר כך ~ 1 מ"מ של העצב נמשך אל האלקטרודה וצורות חותם צר.</li>
	<li>התור על bioamplifier ועל ערכת המסנן כדי 300-3,000 הרץ. האות המשודר אוסצילוסקופ לפקח ולתעד את האות העצבי (קצב הדגימה 20 kHz), האות לחץ intraluminal (קצב הדגימה 100-הרץ) באמצעות מחשב עיבוד הנתונים ספייק תוכנה-</li>
</ol> 7. בדיקת הרגישות מביא חוקן <ol><li>החל התנפחות הרמפה של המעי הגס על ידי סגירת הברז משולשת על הצינורית עודפים תוך החדרת ברציפות intraluminally. לנטר את הלחץ intraluminal עד שהוא מגיע 60 מ מ כספית, ובו בזמן פתח את הברז משולשת על בצינורית המנקזים.</li>
	<li>חזור על הליך זה במרווחי זמן קבועים של סמים החל 15 דקות נוספות - או intraluminally כדי לבדוק את הרגישות כימי של העצבים מביא.</li>
</ol>

<ol><li>Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+basis+of+visceral+pain%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Biological basis of visceral pain: recent developments.</a> Pain. 96 (3), 221-225 (2002).</li>
<li>Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spinal+distribution+and+neurochemical+phenotype+of+colonic+afferents+in+mouse+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat.</a> J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).</li>
<li>Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+mechanisms+contribute+to+mechanosensory+transduction+in+the+rat+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum.</a> Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+the+Primary+Afferent+Nerves+in+a+Rat+Model+of+Diabetic+Visceral+Hyposensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity.</a> Mol Pain. 11, (2016).</li>
<li>Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recordings+of+afferent+fibres+with+receptive+fields+in+the+serosa%2C+muscle+and+mucosa+of+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon.</a> J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).</li>
<li>Page, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+contributions+of+ASIC+channels+1a%2C+2%2C+and+3+in+gastrointestinal+mechanosensory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function.</a> Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).</li>
<li>Hockley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y+Receptors+Sensitize+Mouse+and+Human+Colonic+Nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors.</a> J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).</li>
<li>Peiris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+afferent+recordings%3A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human visceral afferent recordings: preliminary report.</a> Gut. 60 (2), 204-208 (2011).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Functional+Characterization+of+Mouse+Colorectal+Afferent+Endings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings.</a> J Vis Exp. (95), e52310(2015).</li>
<li>Nullens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Recording+of+Mesenteric+Afferent+Nerve+Activity+in+Mouse+Jejunal+and+Colonic+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jejunalafferent+nerve+sensitivity+in+wild-type+and+TRPV1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice.</a> J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).</li>
<li>Brierley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+chemosensory+function+and+receptor+expression+of+splanchnic+and+pelvic+colonic+afferents+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice).</a> J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li>
<li>La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+expression+of+transient+receptor+potential+channel+V1%2C+transient+receptor+potential+channel+A1+and+mechanosensitive+two+pore-domain+K%2B+channels+between+the+lumbar+splanchnic+and+pelvic+nerve+innervations+of+mouse+urinary+bladder+and+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon.</a> Neuroscience. 186, 179-187 (2001).</li>
<li>Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+processing+of+noxious+colonic+input+by+thoracolumbar+and+lumbosacral+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat.</a> J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

פרוטוקול המובאת כאן היא שיטה ניסיונית פשוטה יחסית כדי להעריך את מאפייני אלקטרופיזיולוגיות afferents חוקן של חולדות. הפרוטוקול (מתוך רקמת לנתיחה להגדרת ההקלטה עצב) בדרך כלל לוקח בערך 2 h כדי להשלים. אוסף רקמה (שלב 3) המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות לשלבים הקריטיים הכנה של האלקטרודה היניקה (שלב 5). זה חיוני להיות מסוגל לאתר את PG את LSN, את PN, לדאוג שלא יגרמו נזק על גנגליון ועצבים במהלך ניתוח רקמה. קצה פיפטה מזכוכית חייב להיות שבור, משופע לגודל תואם הצרור עצב.
ההכנה הוא בדרך כלל קיימא ל...

מערכת העיכול (אידיוט) בעושר innervated עם חיצוני מביא עצבים שיש להעביר אותות החישה מהבטן אל מערכת העצבים המרכזית ואשר תורמות האינטראקציה בטן-מוח. דעתנית מסולף של אלה afferents חיצוני, כמו גם העיבוד המרכזית מסולף על גבי מביא, ביסוד הקרביים כאבים וסימפטומים אחרים של מחלות במערכת העיכול, כולל מחלות מעי דלקתיות פונקציונלי1. החושיות מהרובד colorectum מועברת בעיקר דרך thoracolumbar/hypogastric ואת העצבים lumbosacral/האגן (PN)2. יש כבר עניין מוגבר ללמוד את המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבים אלה מביא העיקרי במודלים המחלה מכרסמים. עם זאת, ויוו אלקטרופיזיולוגיות הקלטות של afferents שטיפת המעי הגס בחולדות הוא אתגר טכני ודורש מיומנויות כירורגית. בנוסף, שינויים והמודינמיקה רקמות תנועה, הרדמה עשוי גם להשפיע פעילות העצבים ורגישות לאור מבחן גירויים ויוו. לכן, בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים המועסקים במבחנה (ex-vivo) ההכנות של מינים שונים, לרבות עכברים, עכברושים, שרקנים, בני האדם, לבחון על מנגנוני התמרה חושית חושית בחוקן afferents, דעתנית שינו את תנאי המחלה. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
שני סוגים של ex-vivo הכנת מעי בעיקר דווחו: "גיליון שטוח" הכנה9,5,, או10 ו- "צינור" הכנה3,4. פרוטוקול וידאו להכנת colorectum מאתר "גיליון שטוח" כבר שפורסמו בעבר11. ב פרוטוקול זה, colorectum העכבר, עם PN) או המותני העצבים splanchnic (LSN) מצורפים, הוא שנקטפו ו superfused תא רקמות. Colorectum נחתך פתוח longitudinally, הצרור עצב מורחב לתוך תא הקלטה מלאה בשמן פרפין. פעילות העצבים נרשם באמצעות אלקטרודת פלטינה-אירידיום monopolar. הפרוטוקול מאפשר הזיהוי של שדות פתוחים לרעיונות של סיבי מביא בודדים באמצעות גירוי חשמלי לא משוחדת. זה רגישה היישום של גירויים כימיים, כמו גם את היישום של פרדיגמות גירוי מכני שונה (למשל, מוקד הרירית חיטוט למתוח במבניו), על קצות העצבים מביא. כי העצב חייב שיורחבו לתא נפרד מן החדר רקמות, זה קריטי לשמור על העצב צמוד יחסית ארוכה; ניתוח מוצלח העצבים מציב אתגר לאלה חדש מתודולוגיה זו. לאחרונה, לאור Nullens. et al. פרוטוקול וידאו עבור ההקלטה במבחנה של afferents מצע המעי העליון jejunal מאתר ועוד מקטעי מעי12. זו הכנה "צינור", קטע בטן עם מצע המעי מצורף נשמרת ללא פגע, ובכך מאפשר התנפחות מדורגת ומינהל אינטרה - ו extra-luminal של כימיקלים שונים. מאז העצב מצע המעי נרשם באמצעות אלקטרודה היניקה, אשר יכול להיות ממוקם קרוב הרקמה, ניתן להקליט מביא פעילות למרות העצב מצע המעי הוא קצר יחסית. עם זאת, העצב מצע המעי מורכב אוכלוסיות מעורבות של הסיבים מביא vagal של עמוד השדרה innervate מעי צם או thoracolumbar hypogastric. Afferents האגן Lumbosacral innervate colorectum, אשר לא יכול שיפלו ב פרוטוקול זה. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות של עכברוש afferents שטיפת המעי הגס באמצעות הכנת colorectum "צינור" עמ' ללא פגע שיטה זו עשויה לאפשר אפיון פונקציונלי מאפייני המותני splanchnic (hypogastric) ו lumbosacral האגן afferents.

<table><tbody><tr><td>נתרן פנטוברביטל</td><td>שנחאי ווסטנג ביו-טק</td><td>B558</td><td></td></tr><tr><td>קפסאיצין</td><td>סיגמא</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>חולץ אלקטרודות</td><td>MicroData Instrument Inc</td><td>PMP107</td><td></td></tr><tr><td>מערכת נוירולוגית (ביו-מגבר)</td> <td>Digitimer, Ltd</td><td>מערכת</td><td></td>נוירולוג</tr><tr><td>ממיר A/D</td><td>קיימברידג' עיצוב אלקטרוני</td><td>Micro1401</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לעיבוד נתונים</td><td>קיימברידג' עיצוב אלקטרוני</td><td>Spike2 גרסה 6</td><td></td></tr><tr><td>חוט כסף</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>EP12</td><td></td></tr><tr><td>צינורות זכוכית</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודה</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>MEH3SBW</td><td></td></tr><tr><td>חימום אמבטיה</td><td>מענק</td><td>GR150</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>Zoom2000</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>PZMIII-BS</td><td></td></tr><tr><td>מצית</td><td>כל</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>כלים כירורגיים</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>סיכות חרקים</td><td>תוצרת בית חוט נירוסטה 0.1 מ"מ</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור</td> <td>תלת כיווניWorld Precision Instruments</td><td>KITF-R</td><td></td></tr><tr><td>חולדות</td><td>כל</td><td>NA</td><td>ניתן להשתמש בכל זן/מין.</td></tr></tbody></table>

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

תפקוד העצבים החישה חוקן היה מעורב הפתופיזיולוגיה של מספר מצבים שכיחים, כולל מחלות מעיים דלקתיות פונקציונלי וסוכרת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה אפיון מאפייני אלקטרופיזיולוגיות afferents שטיפת המעי הגס בחולדות. Colorectum, עם שלם האגן גנגליון (עמוד) מצורפים, יוסר העכברוש; superfused עם carbogenated קרבס פתרון בתא ההקלטה; לצינוריות בקצוות אוראלי, אנאלי כדי לאפשר התנפחות. צרור עצבים בסדר שמקורם PG מזוהה, הפעילות העצב מביא multiunit נרשם באמצעות אלקטרודה היניקה. התנפחות של המקטע הגס מעורר הדרגתית העלאות הפרשות multiunit. ניתוח גורמים ראשיים מתנהל להבדיל לסף נמוך, סף הגבוה ואת הסיבים מביא טווח דינמי רחב. רגישות כימית של מעי afferents שניתן ללמוד דרך המינהל אמבט או intraluminal של תרכובות הבדיקה. פרוטוקול זה יכול להיות שונה עבור יישום למינים אחרים, כגון עכברים, שרקנים, וכדי ללמוד את ההבדלים במאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של afferents thoracolumbar/hypogastric ו lumbosacral/האגן של המעי הגס היורד רגילה, מצבים פתולוגיים.

איור 1 הוא האיור סכמטי של ההתקנה ניסיוני להכנת colorectum ex-vivo "צינור", עם נציג הקלטה של עצב דיסטלי עמוד אחד העצב הכיל ככל הנראה תערובת של afferents splanchnic האגן, המותניים. ההכנות של חולדות רגילה, העצבים מביא שטיפת המעי הגס בדרך כלל יש רמה נמוכה של פעילות ספונטנית לא סדיר. הרמפה התנפחות של המעי הגס גורם עלייה הדרגתית קצב ירי (איור 1B). המאפיין mechanosensory של כל העצבים מיוצג על ידי התוויית עקומת תגובת עצב לחץ-מבי...

תפקוד חושי חריג ביסוד הקרביים כאב ותסמינים אחרים של מחלות מעיים דלקתיות פונקציונלי. פרוטוקול עבור ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות של העצבים מביא חוקן בהכנה ex-vivo עכברוש colorectum מוצג כאן.

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את המתודולוגיה להקלטות אלקטרופיזיולוגיות של עצבים תחושתיים של המעי הגס והחלחולת (colorectum) במצב in vitro. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ה-in vitro, כגון תרומת הרגישות של הסיבים האפרונטיים ההיקפיים החיצוניים להיפראלגזיה של המעי הגס והחלחולת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לבצע גירוי של המעי הגס והחלחולת באופן דומה לדרך שבה מבוצע גירוי של העצב התרשמי (carotid) במצב in vivo, בבעלי חיים או בחולים.הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שאיתור הגנגליונים ודיסקציה של העצבים הם תהליכים קשים יחסית. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, חשפו את חלל הבטן של חולדה תחת הרדמה עמוקה על ידי ביצוע חתך בקו האמצע של דופן הבטן באמצעות סכין מנתחים. לאחר מכן, הזיזו הצידה את הקרום (mesentery) ורקמות אחרות כדי לחשוף את המעי הגס והפיכס (colorectum).לאחר מכן, הניחו את בעל החיים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. באמצעות דיסקציה זהירה, אתרו את הגנגליון הפלבי השמאלי (left pelvic ganglion) וזהו את העצבים הפלביים ואת העצבים הספלאכניקומיים הלומבריים (lumbar splanchnic nerves) המתחברים אליו. לאחר מכן, חתכו עצבים אלו במרחק של מספר מילימטרים מהגנגליון הפלבי.איתור הגנגליון האובסייני (pelvic ganglion) ודיסקציה של העצבים הם השלב הקריטי והמסובך ביותר בפרוצדורה זו. לאחר מכן, חתכו את עצם הסימפיזה כדי לחשוף את הרקטום. הסירו את הרקמות שמעל הקולורקטום והקפידו להשאיר את הגנגליון האובסייני שלם.לאחר הקרבת החולדה באמצעות הזרקה תוורידית של מינון יתר של פנטוברביטול, בצעו חיתוך רוחבי של המעי הגס כ-3 ס"מ מעל הגנגליון האגן והוציאו את המעי הגס והחלחולת (colorectum) מהחיה באמצעות פינצטה. לאחר מכן, העבירו את המעי הגס והחלחולת לצחנת פטרי מלאה בתמיסת קרבס (Krebs) מקוררת מראש. הסירו את הצואה על ידי שטיפה עדינה של המעי הגס.בשלב הבא, הסר בזהירות את שאריות שלפוחית השתן ורקמות אחרות, מבלי לפגוע בגנגליון האגן. בהליך זה, הנח את המעי הגס לתא הקלטה והזרם לרקמה באופן רציף תמיסת Krebs מועשרת בקרבוגן. לאחר מכן, בצע קנולציה של המעי הגס והחלחול (colorectum) הן בקצה הפה והן בקצה האנוס, ואז התחל בעירוי תוך-לומנלי של סליין למעי הגס בכיוון מהפה לאנוס; לאחר מכן, אתר את הגנגליון העיקרי של האגן תחת מיקרוסקופ דיסקציה והשתמש בסיכות Entomology כדי לחשוף את הגנגליון.באמצעות דיסקציה זהירה, אתרו ענף עצב דק הנובע מהגנגליון ורץ לכיוון המעי הגס, ולאחר מכן, חיתכו את העצב קרוב לגנגליון. לפני השלב הבא, הפעילו את אמבט החימום ושמרו את תמיסת Krebs בטמפרטורה של 34 degrees celsius. כעת, בחנו פיפטת זכוכית שנמשכה מראש תחת מיקרוסקופ דיסקציה.שברו את קצה האלקטרודה באמצעות פינצטה, כך שגודלו יהיה תואם לקוטר העצב ממנו יש להקליט. לאחר מכן, צרו שיפוע בקצה על ידי הצמדתו ללהבת מצת. משתמשים חדשים בשיטה זו עשויים למצוא את יצירת השיפוע בקצה האלקטרודה באופן התואם לגודל העצב כמאתגרת.בשלב הבא, מקמו את האלקטרודה בעלת הקצה המשופע במחזיק האלקטרודות, ולאחר מכן חברו מזרק של 10 milliliter לפתח הצדדי של המחזיק לצורך הפעלת לחץ שלילי או חיובי על האלקטרודה. לאחר מכן, חברו את המחזיק לראש המגבר הביולוגי, והרכיבו את ראש המגבר על מניפולטור. לאחר פעולה זו, העבירו את האלקטרודה לאמבט הרקמה ומלאו את האלקטרודה בתמיסת Krebs על ידי הפעלת שאיבה עדינה עד למגע עם תיל הכסף של המחזיק.בשלב הבא, מקמו את קצה האלקטרודה קרוב לקצה החתוך של העצב והפעילו לחץ שלילי כדי לשאוב את העצב אל תוך האלקטרודה. לאחר מכן, הפעילו לחץ שלילי נוסף, כך שכשלוף מילימטר אחד של העצב יימשך אל תוך האלקטרודה וייצור אטימה הדוקה. כעת, הפעילו את המגבר הביולוגי והגדירו את המסנן ל-300 עד 3,000 hertz.יש לנטר את האות באוסצילוסקופ ולהקליט את אות העצב ואת אות הלחץ תוך-הלומנלי בתוכנה לעיבוד נתוני ספייקים. לאחר מכן, יש להחיל התרחבות הדרגתית (ramp distention) של המעי הגס על ידי סגירת הברז התלת-כיווני בקנולה של פתח היציאה תוך כדי עירוי תוך-לומנלי רציף. יש לנטר את הלחץ התוך-לומנלי עד שיגיע ל-60 millimeters mercury, ואז לפתוח את הברז התלת-כיווני בקנולה של הניקוז.חזור על הליך זה במרווחי זמן קבועים של ארבעים וחמש דקות והחלת תרופות באופן חיצוני או בתוך הלומן כדי לבחון את הרגישות הכימית של העצבים האפרנטים. להלן איור סכמטי של מערך הניסוי עבור הרכבת מעי גס ורקטום ex vivo עם הקלטה מייצגת מעצב דיסטלי לגנגליון הפלביס. בהכנות מחולדות נורמליות, העצבים האפרנטים של המעי הגס מראים בדרך כלל רמה נמוכה של פעילות ספונטנית סדירה.הרחבה הדרגתית של המעי הגס גורמת לעלייה הדרגתית בקצב הפריקה. התכונה המכנו-סנסורית של כל עצב מיוצגת על ידי שרטוט עקומת התגובה של העצב האפרנטי ללחץ תוך-לומנלי. לחלופין, ניתן לבצע הקלטה מענף של העצבים האובסוים (pelvic nerves) באופן פרוקסימלי לגנגליון האובסווי.פרופיל הפעילות המכנו-סנסורית של עצבי האגן הפרוקסימליים דומה בדרך כלל לזה הנראה בעצב הדיסטלי לגנגליון האגן. ניתן לבצע ניתוח רכיבים ראשיים (Principal component analysis) של צורות הגל של פוטנציאלי הפעולה מההקלטה הרב-יחידתית (multiunit recording) כדי להבחין בפעילות של יחידה בודדת. להלן צורות גל חופפות של שני סיבים אפרנטיים אינדיבידואליים של האגן.לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעתיים אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה של האנטומיה של הגנגליונים האגביים העיקריים ושל העצבים האחרים, ותהיו מסוגלים לאתר את הגנגליונים כדי לבצע דיסקציה של העצבים ולהקליט את הפעילות האפרנטית. יתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא עשוי לאפשר השוואה בין התכונות האלקטרופיזיולוגיות והפרופילים הפארמקולוגיים של העצבים האפרנטיים האגביים והספלנכניים.

in-vitro-characterization-electrophysiological-properties-colonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים שיטה לתיעוד הפעילות של עצבי המעי הגס במעי גס של חולדה ex-vivo, מקופלים בשני הקצוות ומוחדרים במי מלח כדי להגביר את הלחץ התוך-לומינלי. ככל שהלחץ עולה, האות העצבי עולה, ומציין את הגירוי שלו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגית מעצבי המעי הגס במעי הגס Ex Vivo Rat

סרטון זה מראה את התהליך של רישום אותות חשמליים מעצבי afferent mesenteric במקטע jejunal עכבר מנותח כדי לחקור את ההשפעות של לחץ רקמות ושינויים בתנועה על פעילות עצבית afferent.

הקלטה של פעילות עצבית רגשית מזנטרית במקטע ג'ג'ונום של עכבר ex vivo

סרטון זה מדגים הקלטה של סיב יחיד של הולכה עצבית של סיבי C בחולדות. חולדה מורדמת נחתכת כדי לחשוף את העצב הסיאטי, המספק אספקה חושית ומוטורית לגפיים התחתונות. לאחר מכן נחשפים סיבי ה-C הבודדים. גירוי חשמלי ניתן באמצעות אלקטרודות גירוי המושתלות בכף הרגל, ותגובה נרשמת מסיב עצב בודד.

In vivo הקלטה של סיב יחיד של סיבי C של עצב סיאטי בחולדות

מקור: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. באתרו ca2+{{}} הדמיה של מערכת העצבים המעי. J. Vis. exp.,  (2015){סרטון זה מדגים סידן הדמיה כדי להמחיש ולנתח את הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירי מקלעת מיאנטרית של המעי הגס בעכבר.

הדמיית סידן של פעילות נוירונים מעיים וגליה במקלעת מיאנטרית של עכבר

מקור: Lai, J., et al. רישום אלקטרופיזיולוגי בו זמנית ומיקרו-הזרקות של חומרים מעכבים במוח המכרסמים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת מיקרו-הזרקה להקלטה ועיכוב עצביים בו זמנית בקוליקולוס העליון של החולדה. ההליך כולל מיקוד סטריאוטקסי, קידוח גולגולת והחדרת מזרק, המספק נוירוטרנסמיטר מעכב תוך רישום פעילות עצבית. גירוי אור מעורר פוטנציאל פעולה, בעוד שמיקרו-הזרקת סמים מדכאת את הריגוש העצבי. ככל שרמות המוליכים העצביים יורדות, הפעילות העצבית חוזרת לנקודת ההתחלה, ומאפשרת לחקור הן את העיכוב...

עיכוב פעילות עצבית ואיתור שלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה בחולדה

אנו מדגימים פרוטוקול תרבית תאים למחקר הישיר של רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים enteric. נוירון / תרבות מעורבת גליה על coverslips מוכן ממקלעת myenteric של עכבר בוגר מתן היכולת לבחון נוירון בודד ופונקציה על ידי גליה electrophysiology,...

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

סרטון זה מדגים פרוטוקול לביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של סיב יחיד על הכנת עצב המעי הגס של עכבר במבחנה.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

עצבים אפרנטיים מזנטרי מעבירים מידע ממערכת העיכול לכיוון המוח לגבי הומאוסטזיס תקין כמו גם פתופיזיולוגיה. ניתן להעריך את פעילות העצב האפרנטי במערכת העיכול על ידי הרכבת מקטעי מעיים מבודדים עם עצבים אפרנטיים מחוברים לאמבט איברים, בידוד העצב והערכת פעילות בסיסית כמו גם מגורה.

במבחנת ההקלטה של פעילות עצבית Mesenteric מביא עכבר Jejunal ופלחים גסים

טכניקות דעתנית עצב לספק כלי רב עוצמה כדי לבחון פתופסיולוגיה ושינויים biophysical שקודמים אירועים ניוונית בלתי הפיך. כתב יד זה מדגים את השימוש של טכניקות אלה על עצם הגומד של חולדות מורדם.

אין ויוו מדידות אלקטרופיזיולוגיות של עצב הגומד עכברוש עם הבדיקות דעתנית עצב

הקלטה של סיב יחיד היא טכניקת אלקטרופיסיולוגית יעילה הישימה במערכות העצבים המרכזיות וההיקפית. יחד עם הכנת DRG שלם עם העצב המכניסטי, מנגנון כשל ההולכה נבדק. שני הפרוטוקולים משפרים את ההבנה של היחסים בין מערכת העצבים ההיקפית לכאב.

השימוש ב Vivo הקלטה חד-סיבים ושורש השורש שלמות עם העצב מוצמד לבחון את המנגנון של כשל הולכה

למדו שיטת הקלטה אלקטרופיזיולוגית של עצבים תחושתיים במעי הגס של חולדות במודל אקס ויוו. השיטה מאפשרת חקר תכונות מכניות-תחושתיות ומנגנוני כאב ויסרלי במחלות מעי.

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

גלה סרטונים נוספים