Name: דור של מחלת ריאות חסימתית כרונית מודל בעכברים על ידי חשיפה חוזרת ונשנית האוזון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: למדו כיצד ליצור מודל של מחלת ריאות חסימתית כרונית בעכברים באמצעות חשיפה חוזרת לאוזון. מודל זה מחקה תהליכים פתולוגיים של COPD ומסייע בסינון תרופות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים ברצוננו להביע תודה מר אדם מאוד צ'ין (שנגחאי בריאות הציבור קלינית במרכז) לסיוע טכני עם ההערכה µCT ב פרוטוקול זה.

הערה: מודל ה OE שנוצר, המשמשים למחקר שדווחה בעבר 30 , 31 , 32. ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת שנחאי ג'יאוטונג של.
 1. עכברים <ol><li>בית נטולת הפתוגן, 7 עד 9-בת נקבה BALB/c עכברים בכלובים מאוורר בודד בחיה מתקן תחת מבוקר טמפרטורה (20 ° C) ולחות (40-60%). מספקים אור 12 שעות ו 12 שעות מחזור כהה במתקן. לספק מזון ומים ad libitum.</li>
</ol> 2. האוזון או חשיפה אוויר <ol><li>צור האוזון עם גנרטור חשמלי בתוך קופסה איטום אקרילי (למשל פרספקס). לנשוף האויר מחוץ לקופסה באמצעות מפוח אוויר קטן דרך צינור אוורור אוויר המחובר מבפנים, מחוץ לקופסה. נטר את ריכוז האוזון בתיבה באמצעות בדיקה של האוזון. המתן עד ריכוז האוזון בתיבת מגיע ל- 2.5 חלקים למיליון (ppm). 
	הערה: החללית האוזון יכולה להחליף באופן אוטומטי את מחולל האוזון או ביטול, באפשרותך לשמור על רמת האוזון בתיבה בחלק 2.5 ppm.</li>
	<li>למקם את העכברים לתוך התיבה בעת הרמה של האוזון מגיע ל- 2.5 ppm. לשמור את העכברים בתיבה עבור 3 שעות בכל פעם לחשוף אותם האוזון. 
	הערה: תיבת יכול לשמר רמה האוזון של 2.5 ppm במהלך ה 3 על-ידי מיתוג אוטומטית את מחולל האוזון או ביטול ו CO 2 הזמבורה המיוצר על ידי העכברים מהקופסה.</li>
	<li>לתת אוזון שתי חשיפות (בכל חשיפה מתמשכת 3 h) בשבוע (פעם אחת כל 3 ימים) במשך 7 שבועות; לחשוף את העכברים הבקרה האווירית, באותו זמן, באותה התקופה.</li>
</ol> 3. מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת <ol><li>בסוף שבוע 7, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 מ ל/100 גרם) להתאים את המינון על פי מצבים בודדים כדי לראות העכבר אינו להגיב הבוהן קמצוץ. צג ולשמור העכבר בתדר נשימה קבועה; וודא כי אין הרצוניות קיים במהלך ההליכים.</li>
	<li>מקום העכברים anesthetized בחדרו של טומוגרפיה שחושב מיקרו (µCT).</li>
	<li>לכייל את µCT באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי והיצרן &#39; s הוראות. הגדר את שפופרת רנטגן 50 kV והזרם ב 450 µA. 
	הערה: שניהם הרנטגן והגלאי סובב סביב העכברים.</li>
	<li>לבצע את הניתוח µCT על-ידי השגת תחזיות 515 עם גודל פיקסל אפקטיבי של 0.092 מ מ, של זמן חשיפה של ms 300 בשביל פרוסה אחת, עובי הפרוסה של מ"מ 0.093.</li>
	<li>לשחזר את הריאה עם תמונות נרכשות באמצעות תוכנה. לכוונן את בהירות התמונה בגווני אפור על-ידי הגדרת את מינימום ומקסימום של גווני האפור ב-750 ו-550 נ. האונספילד יחידות, בהתאמה. 
	הערה: התוכנה יחשב באופן אוטומטי את אמצעי האחסון של parenchyma הריאה, 35 אזור נמוך-הנחתה (LAA) 34 ,.</li>
	<li>לחשב את אחוז LAA (LAA %) על-ידי חלוקת האחסון LAA לפי נפח הריאות הכולל.</li></ol>
 4. הבדיקה על ההליכון <ol><li>לתת העכברים הסתגלות לבדוק במהירות של 10 מ' לדקה 10 דקות ריצה הליכון המכונה הערה: החשמל הוא תמיד כבוי כאשר ההליך מתנהל.</li> <li>מנהל מבחן עייפות לעכברים.
	<ol><li>לחמם את העכברים במהירות של 10 מ' לדקה במשך 5 דק.</li>
		<li>להגדיל את המהירות עד 15 מ' לדקה במשך 10 דקות</li>
		<li>להגדיל את עצימות: הגדלת המהירות על ידי 5 מטר/דקה, החל מ- 20 מ'/דקה, כל 30 דקות עד עכברים אין אפשרות להמשיך לפעול 36.</li>
	</ol></li> <li>להקליט את הסיכום רץ מרחק ויפעילו את הזמן כמו עייפות מרחק וזמן עייפות, בהתאמה.</li></ol>
 5. מדידות תפקוד ריאתי <ol><li>עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 מ ל/100 גרם) להתאים את המינון על פי מצבים בודדים לראות כי העכבר עושה לא להגיב קמצוץ הבוהן ולחכות עד העכברים נשימה ספונטנית. צג שמרו ולשמור העכבר בתדר נשימה קבועה; וודא כי אין הרצוניות קיים במהלך ההליכים.</li>
	<li>בעיון tracheostomize העכברים ומניחים היא תגלה הגוף שאליו מחובר חמה מבוקר-מחשב- 
	הערה: אוורור נשלטת דרך שסתום הממוקם הציר הקרוב הצינור אנדוטרכאליות. הגדרת מספק תמרונים חצי אוטומטי שונים, כולל את התמרון של אמצעי האחסון לחץ סטטי ומעין ולתמרן את נפח זרימה מהירה.</li>
	<li>לכפות ממוצע נושם התדירות של 150 נשימות לדקה העכבר anesthetized באמצעות אוורור מבוקר ללחץ עד דפוס נשימה רגיל והשיג תפוגה מלאה על כל מחזור הנשימה.</li>
	<li>לבצע את התמרון לחץ סטטי ומעין-נפח עם המכשיר באמצעות הלחץ השלילי שנוצר היא תגלה.</li>
	<li>לבצע את התמרון נפח זרימה מהירה בתוך לולאות לחץ סטטי ומעין-נפח להקליט את FVC ואני את FEV. לנפח הריאה +30 ס"מ H 2 O ומיד לאחר מכן לחבר אותו כדי לחץ שלילי מאוד כדי לאכוף תפוגה עד שאמצעי האחסון שיורית ב-30 ס מ H 2 O. שיא FEV הראשון 25, 50, ו ms 75 של נשיפה (FEV 25 FEV 50, FEV 75, בהתאמה). דוחים את התמרונים שיוצרת. עבור כל בדיקה עם כל עכבר אחת, לנהל מינימום של שלושה מקובל תמרונים כדי לקבל ממוצע אמין עבור כל הפרמטרים מספריים.</li>
</ol> 6. אוסף BALF <ol><li>בעקבות הרדמה מסוף עם pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2.4 גרם/100 גרם) להתאים את המינון על פי מצבים בודדים לראות כי העכבר לא מגיב קמצוץ הבוהן, לאבד את הנשימה), שטיפה עכברים עם 2 מ של PBS דרך 1 מ מ קוטר צינור אנדוטרכאליות ו מכן לאחזר BALF 10-</li>
	<li>מאגר של aliquots שטיפה שאוחזרו ו centrifuge אותם ב 4 ° C ו- g x 250 במשך 10 דקות</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע לשימוש מיידי ולאחסן את השארית ב-80 מעלות צלזיוס או נוזל חנקן.</li>
	<li>לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא PBS, ואז ספין (1,400 x g, 6 דקות) µL 250 תאים resuspended על השקופיות בעזרת צנטריפוגה טווה שקופיות.</li>
	<li>רייט להחיל מכתימה את התאים של השקופיות לפי היצרן &#39; פרוטוקול s.</li>
	<li>לספור תאים 200 לכל עכבר; לזהות את התאים המקרופאגים או נויטרופילים, על פי המורפולוגיה סטנדרטי, תחת הגדלה X 400; ולספור את המספרים שלהם.</li>
</ol> 7. דגימה דם לב <ol><li>לאסוף דם באמצעות דקירה בלב, לטעון אותו לתוך צינורות 1.5-mL, ולשמור את זה על קרח במשך 30 דקות</li>
	<li>Centrifuge את דגימות הדם למשך 5 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע (סרום) צינור ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס או נוזל חנקן.</li>
	<li>להכין את הנסיוב IL-1β, IL-10, ו- TNF-α בדיקות זיהוי באמצעות ערכות אליסה בהתאמה.</li>
</ol> 8. ניתוח ריאות Morphometric <ol><li>לנתח את הריאות ואת tracheas של העכברים.
	<ol><li>למקם כל עכבר לאללה על גבי לוח כירורגית מיד לאחר ההקרבה.</li>
		<li>לנתח משם platysma את שרירי הנשימה הקדמי כדי להמחיש ולגשת הטבעות והכו אותי.</li>
		<li>פתח את החזי חלל. לנתח את הריאות, קנה הנשימה, אך אל תפריד את הלב מהריאות.</li>
	</ol>
	</li> <li>להתחבר הקטטר אנדוטרכאליות המזרק המכיל 4% paraformaldehyde דרך צינור פוליאתילן PE90. 
	התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. ללבוש כפפות בטיחות משקפיים ולהשתמש הפתרון בתוך ברדס fume.</li>
	<li>מנפח הריאות לחלוטין באמצעות paraformaldehyde 4% (10 טיפות, µL ~ 200) דרך הקטטר אנדוטרכאליות. להסיר את הלב לאחר השלמתו של האינפלציה.</li>
	<li>שמור על הריאה בשפופרת 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde לפחות 4 h</li>
	<li>להטביע את הריאה פרפין. לקבל סעיפים 5-מיקרומטר על-ידי בלוק פראפין חלוקתה עם מיקרוטום רוטרי. במהלך חלוקתה, לחשוף את פני השטח המרבי של רקמת הריאה בתוך אזור עץ הסמפונות.</li>
	<li>ניתוח morphometric, לבצע hematoxylin אאוזין (H &#38; E) צביעת במקטעי.</li>
	<li>תמונה הסעיפים עם מיקרוסקופ זקוף בהיר-שדה (המטרה עדשה, 20 X; זמן החשיפה, 1.667 ms).</li>
	<li>שני חוקרים עיוור בפרוטוקול טיפול באופן עצמאי לספור הסעיפים היסטולוגית. השתמש בנקודת החיתוך ליניארי רשע (L m) כפרמטר למדידת המרחק של הקיר במחיצה הבין-מכתשי. לקבוע את L m באמצעות השלבים הבאים: <ol><li>לפתוח את התמונות של הסעיפים ב- Photoshop וצייר החריט-רשת על התמונה עם תורים ארוכים 550 5 מיקרומטר.</li>
		<li>לספור את מספר alveoli מעבר לקו רשת.</li>
		<li>לחשב את ה L m על-ידי חלוקת אורך הקו ברשת על ידי מספר alveoli. על כימות, תמונה לחמישה מדורים לכל העכבר. לרכוש עשר תמונות של כל אחד מהמקטעים (תמונה אחת לכל שדה), להעריך באופן אקראי. בעת בחירת שדה, להימנע שדות של דרכי הנשימה וכלי על-ידי הזזת שדה אחד קדימה או לכיוון אחר. 
		הערה: הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± S.E.M. מבחן-t בלתי מזווג בוצע לשם השוואה בין עכברים החשופים אוויר ועכברים החשופים האוזון. שלוש חיות של כל קבוצה שימשו כדי לחשב את ההבדל המשמעותי. ערך-p של &#60; 0.05 נחשב משמעותי.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S. וו. וו הם העובדים הנוכחי ומחזיקים אופציות של קבוצת וההתערבות הסלולר (סימול: CBMG). המחברים אחרים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

במחקר זה, אנו מציגים שיטה אמינה ליצירת מודל חדש של COPD. מודל זה OE לעומת דגמים אחרים (קרי, LPS או עיקרון השוויון הפוליטי מודלים), recapitulates את תהליך פתולוגי של מטופלי COPD. כי עישון סיגריות הוא החומר מסוכנים העיקרית שגורמת COPD בחולים אנושיים40, דגם CS נשאר הפופולרי ביותר COPD דגם41,42. עם זאת, דגם CS דורש a R 3 - 12 חודש &#38; D תקופה עבור תרופות חדשות. לעומת דגם CS, המודל הנוכחי OE מצמצם תקופה דור 6-8 שבועות. הבחנו אמפיזמה ...

ההערכה היא כי COPD, כולל אמפיזמה וגם ברונכיטיס כרונית, עשוי להיות הגורם המוביל השלישי המוות בעולם 20201,2. שכיחות COPD פוטנציאליים בקרב אוכלוסיה מעל גיל 40 מוערך 12.7% אצל גברים ו- 8.3% אצל נקבות בתוך 40 שנה הבאה3. אין תרופות זמינים כעת להפוך את הידרדרות הדרגתית חולי COPD4. אמין מודלים חייתיים של COPD לא רק דורשים החיקוי של תהליך פתולוגי המחלה אך גם לדרוש תקופה קצרה הדור. המודלים הנוכחיים COPD, כולל את התקליטים או מודל הנוצרות על-ידי עיקרון השוויון הפוליטי, יכול לגרום תסמינים דמויי אמפיזמה5,6. ניהול יחידה או אתגר השבוע של LPS או עיקרון השוויון הפוליטי תוצאות עכברים או חולדות neutrophilia המסומן בנוזל שטיפה bronchoalveolar (BALF), מגביר pro-מתווכים דלקתיים (למשל, TNF-α ו- IL-1β) BALF או סרום, מייצרת ריאות האיזורים אוויר מוגדל-הרס parenchymal, גבולות זרימת אוויר5,6,7,8,9,10. עם זאת, LPS או עיקרון השוויון הפוליטי אינם גורמים אנושיים COPD, ובכך לא לחקות את תהליך פתולוגי11. דגם CS-induced המיוצר על הגבלת זרימת האוויר מתמשך, הרס parenchymal ריאות, מופחתת יכולת תפקודית פעילות גופנית. עם זאת, פרוטוקול CS מסורתי דורש לפחות 3 חודשים כדי להפיק COPD מודל12,13,14,15. לכן, חשוב לייצר מודל בעלי חיים חדשים, יעיל יותר העומד בדרישות שני.
לאחרונה, בנוסף עישון סיגריות, זיהום אוויר, חשיפה תעסוקתית הפכו הסיבות השכיחות יותר של COPD16,17,18. האוזון, כאחד המזהמים העיקריים (אם כי לא המרכיב העיקרי של זיהום אוויר), יכולים להגיב עם מערכת הנשימה באופן ישיר לנזק רקמת הריאה של ילדים והן צעירים מבוגרים19,20,21 ,22,23,24,25. אוזון, כמו גם תכשירים אחרים כולל LPS, עיקרון השוויון הפוליטי של הפקולטה למדעי המחשב, מעורב של משעולים הביוכימי של סטרס חמצוני ריאתי, נזק לדנ א הינם מקושרים על ייזום וקידום של COPD26,27. גורם נוסף הוא כי הסימפטומים של חלק מהחולים COPD להתדרדר אחרי נחשפים האוזון, המציין כי האוזון יכול לשבש את הריאה פונקציה18,28,29. לכן יצרנו מודל חדש של COPD על ידי חשיפת שוב ושוב עכברים ריכוזים גבוהים של אוזון 7 שבועות; כתוצאה מכך זרימת אוויר פגמים ונזק ריאות parenchymal דומים לאלה של חקירות קודמות30,31,32. עלינו להרחיב את פרוטוקול OE עכברים הנשי במחקר זה, בהצלחה לשכפל האמפיזמה נצפתה בעכברים זכרים ב שלנו הקודם מחקרים30,31,32. כי COPD התמותה ירדה בגברים אך גדל אצל נשים אצל מדינות רבות33, מודל COPD אצל נקבות יש צורך ללמוד את המנגנונים וכדי לפתח שיטות טיפוליות לחולים COPD הנשי. תחולת שמודל OE כל המינים משאיל תמיכה נוספת לשימוש שלה כמודל COPD.

<table><tbody><tr>במחקר זה נעשה שימוש <td>בעכברי BALB/c</td> חיית <td>מעבדה Slac, שנחאי, סין</td><td>N/A</td><td>נקבות עכברי BALB/c בנות 7 עד 9 שבועות.</td></tr><tr><td>כלובים מאווררים בודדים</td><td>סוהאנג, שנחאי, סין</td><td>מספר דגם: MU64S7</td><td>הכלובים שימשו לשיכון עכברים במתקן לבעלי חיים.</td></tr><tr><td>איטום קופסת פרספקס</td><td>סוהאנג, שנחאי, סין</td><td>N/A</td><td>הקופסה שימשה להכיל את מחולל האוזון. עכברים נחשפו לאוזון בתוך הקופסה.</td></tr><tr><td>גנרטור חשמלי</td><td>סנדר אוזוניזר, Uetze-Eltze, גרמניה</td><td>דגם 500&nbsp;</td><td>המכשיר שימש לייצור אוזון.</td></tr><tr><td>בדיקת אוזון</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, מנצ'סטר רבתי, בריטניה</td><td>אוזון 300</td><td>המכשיר שימש לניטור ובקרה של ייצור האוזון.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>P3761</td><td>עכברים הורדמו על ידי הזרקה תוך-צפקית של pelltobarbitalum natricum.</td></tr><tr><td>טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת</td><td>GE Healthcare, לונדון, אונטריו, קנדה</td><td>RS0800639-0075</td><td>מכשיר זה שימש לרכישת תמונות של הריאה.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 תוכנת ABA</td><td>GE Healthcare, לונדון, ON, קנדה</td><td>Micro-view 2.01&nbsp;</td><td>מכשיר זה שימש לשחזור הריאה ולניתוח נפח LAA של הריאה.</td></tr><tr><td>מכונת הליכון&nbsp;</td><td>דואנשי, האנגג'ואו, ג'ג'יאנג, סין</td><td>DSPT-208</td><td>מכונה זו הייתה usd לבדיקת עייפות.</td></tr><tr><td>פלתיסמוגרף גוף</td><td>eSpira&trade; מערכת תמרונים כפויים, EMMS, אדינבורו, בריטניה</td><td>מערכת תמרונים כפויים</td><td>מכשיר זה שימש לבדיקת תפקוד ריאתי של ספירומטריה.</td></tr><tr><td>מכונת הנשמה</td><td>eSpira&Trade; מערכת תמרונים כפויים, EMMS, אדינבורו, בריטניה</td><td>מערכת תמרונים כפויים</td><td>מכשיר זה שימש לבדיקת תפקוד ריאתי של ספירומטריה.</td></tr><tr><td>צנטריפוגת ספינר שקופיות</td><td>דנוויל סיינטיפיק, הוליסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>C1183&nbsp;</td><td>הוא שימש לסיבוב תאי BALF על שקופיות.</td></tr><tr><td>Wright Staining</td><td>Hanhong, שנגחאי, סין</td><td>RE04000054</td><td>&nbsp; הוא שימש להכתמת מקרופאגים, נויטרופילים ב-BALF התלוי.</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>האוסר סיינטיפיק, הורשאם, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>4000</td><td>הוא שימש לספירת תאים.</td></tr><tr><td>IL-1 ובטא;</td><td>אבקאם, קיימברידג', MA, ארה"</td>ב <td>ab100704</td><td>הם שימשו לבדיקת הגורמים המתאימים בסרום.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, קיימברידג', MA, ארה"</td>ב <td>ab46103</td><td>הם שימשו לבדיקת הגורמים המתאימים בסרום.</td></tr><tr><td>TNF ואלפא;</td><td>אבקאם, קיימברידג', MA, ארה"</td>ב <td>ab100747</td><td>הם שימשו לבדיקת הגורמים המתאימים בסרום.</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד&nbsp;</td><td>סיגמא, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>P6148</td><td>הריאה נופחה ב-4% פרפורמלדהיד.</td></tr><tr><td>פרפין</td><td>Hualing, שנגחאי, סין</td><td>56#</td> <td>הוא שימש להטמעת הריאה.</td></tr><tr><td>מיקרוטום רוטרי</td><td>לייקה, וצלר,&nbsp; הסן, גרמניה</td><td>RM2255</td><td>הוא שימש לחיתוך הריאה.</td></tr><tr><td>Hgaematoxylin ו-Eosin (H& ה) תמיסת צביעה</td><td>Solarbio, בייג'ינג, סין</td><td>G1120</td><td>H& צביעה E נעשתה לניתוח מורפומטרי.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה בהיר זקוף</td><td>אולימפוס, סנטר ואלי, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>CX41</td><td>הוא שימש להדמיית H& שקופיות מכתים E.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>הוא שימש לספירת מספר הנאדיות ב-H& תמונות מוכתמות E.</td></tr><tr><td>פריזמה GraphPad 5</td><td>תוכנת Graphpad בע"מ, סן דייגו, קליפורניה</td><td>פריזמה GraphPad 5</td><td>הוא שימש לניתוח נתונים והפקת דמויות.</td></tr></tbody></table>

דור של מחלת ריאות חסימתית כרונית מודל בעכברים על ידי חשיפה חוזרת ונשנית האוזון

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) מאופיין על ידי הגבלת זרימת האוויר מתמשך והרס parenchymal ריאות. יש שיעור גבוה מאוד של הזדקנות האוכלוסייה. טיפולים קונבנציונליים הנוכחי COPD דגש בעיקר על שינוי סימפטום סמים; לפיכך, ההתפתחות של טיפולים חדשים דרוש בדחיפות. מוסמך מודלים חייתיים של COPD יכול לעזור כדי לאפיין את המנגנונים המשמשת כבסיס, יכול לשמש עבור חדש והתרופות הקרנה. המודלים הנוכחיים של COPD, כגון ליפופוליסכריד (LPS) או elastase הלבלב חזירי (עיקרון השוויון הפוליטי)-מודל אמפיזמה המושרה, ליצור נגעים COPD, כמו ריאות, דרכי הנשימה אבל אחרת לא דומים בפתוגנזה של COPD אנושי. לעשן סיגריה (CS)-מודל המושרה נותר אחד הפופולריים ביותר כי זה לא רק מדמה COPD דמוי נגעים במערכת הנשימה, אבל זה גם מבוסס על אחד החומרים המסוכנים העיקרית הגורמת COPD בבני אדם. עם זאת, ההיבטים מהגידולים ועתירת של דגם CS-induced להגביל באופן דרמטי שלה יישום חדש והתרופות הקרנה. במחקר זה, בהצלחה יצרנו מודל חדש של COPD על ידי חשיפת עכברים לרמות גבוהות של האוזון. מודל זה הפגין את הפעולות הבאות: 1) ירד קיבולת ויטל 25, 50, והכריח את 75/נפח expiratory בכפייה (FEV25/FVC, FEV50/FVC, FEV75/FVC), המציין את התדרדרות תפקוד הריאות; 2) alveoli ריאות מוגדלת, עם הרס parenchymal ריאות; 3) מופחת עייפות הזמן והמרחק; . ו-4) מוגבר דלקת. יחדיו, נתונים אלה מדגימים כי המודל חשיפה (OE) האוזון הוא מודל בעלי חיים אמין דומה לבני כי חשיפת יתר האוזון הוא אחד הגורמים etiological של COPD. בנוסף, לקח רק 6-8 שבועות, בהתבסס על העבודות הקודמות שלנו, כדי ליצור מודל OE, ואילו זה דורש 3-12 חודשים לזירוז המודל עשן סיגריות, המציין כי המודל OE עשוי להיות בחירה טובה עבור מחקר COPD.

דוגמאות של תמונות תלת-ממד µCT של כל קבוצה מוצגים באיור 1. העכברים החשופים האוזון היה נפח הריאות הכולל גדול יותר באופן משמעותי (איור 1ו- b) LAA % (איור 1c) מאשר העכברים בקרת אוויר החשופים. נפח הריאות ואת LAA % נשארו גבוהות לאחר שישה שבועות של אוזון חשיפה31,32. נפח הריאות מוגברת LAA % מייצגים א...

מחקר זה מתאר את הדור מוצלחת של מודל חדש של בעלי חיים מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) על ידי חשיפת שוב ושוב עכברים ריכוזים גבוהים של אוזון.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להשרות מחלה ריאתית חסימה כרונית, או C-O-P-D, באמצעות חשיפה לאוזון, O-E, בעכברים. מודל OE חדש זה יכול לסייע באפיון המנגנון הבסיסי של COPD וניתן להשתמש בו לסריקה של תרופות חדשות. היתרונות העיקריים של מודל OE זה הם בכך שהוא משחזר את התהליכים הפתולוגיים של חולי COPD.ניתן להפיקו בתוך שש עד שמונה שבועות בלבד. את הפרוצדורה תדגים עבורי וייג'יאן סאנג (Weijaian Sang), עמיתה למחקר בקבוצה שלנו. כדי להפיק אוזון, השתמשו בגנרטור חשמלי ובמנשב אוויר קטן כדי לדחוף את האוויר אל תוך קופסת פרספקס אטומה דרך צינור פליטה המחובר לחלק הפנימי והחיצוני של הקופסה, תוך שימוש בגשש אוזון לניטור ריכוז האוזון בתוך הקופסה.כאשר ריכוז האוזון מגיע ל-2.5 parts per million, העבירו את העכברים לתוך התיבה למשך 3 שעות. בסוף שבוע 7, בצעו הדמיה של בעלי החיים שטופלו באוזון באמצעות micro-computed tomography בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לבחון את השינויים שהושרה על ידי האוזון ואת היכולות התפקודיות, כגון עייפות ריאות, חממו תחילה את העכברים במהירות של 10 meters per minute על מסוע.לאחר 5 דקות, הגבירו את המהירות ל-15 meters per minute למשך 10 דקות. המשיכו להעלות את המהירות ב-five meters per minute בכל 30 דקות, עד שהעכברים לא יוכלו לרוץ יותר. רשמו את מרחק הריצה הכולל ואת זמן הריצה של כל חיה כמרחק העייפות וזמן העייפות, בהתאמה.כדי למדוד את תפקוד הריאות של בעלי החיים שנחשפו לאוזון, מקמו עכבר בהרדמה בתוך פלתיסמוגר גוף המחובר למנשם הנשלט על ידי מחשב. השתמשו בהנשמה מבוקרת-לחץ כדי להטיל תדירות נשימה ממוצעת של 150 נשימות לדקה על בעל החיים המורדם, עד להשגת דפוס נשימה סדיר ונשיפה מלאה בכל מחזור נשימה. לאחר מכן, רשמו את נפח הנשיפה המאולצת ב-25, 50 ו-75 המילי-שניות הראשונות של הנשיפה, תוך פסילת תמרונים שאינם אופטימליים.לאחר הרדמה סופית, השתמשו בשפופרת אנדוטראכאלית בעלת קוטר של one millimeter כדי לבצע שטיפה (lavage) של בעלי החיים פעמיים, עם one milliliter של PBS לכל שטיפה. רכזו את מנות השטיפה שנאספו מכל בעל חיים לצורך סנטריפוגציה ואספו את העילאיים (supernatants) בחנקן נוזלי. השאיבו מחדש את המשקעים (pellets) ב-PPS טרי לצורך ספירה, והכינו עבור כל עכבר שני מחזיקים הכוללים זכוכית מיקרוסקופ, כרטיס מסנן ומשפך.הוסיפו כ-100 עד 125 µL של התאים שהושעו מחדש לכל משפך. העמיסו את התפסים על צנטריפוגת ציטוספין (cyto centrifuge) וסובבו את התאים על גבי השקופיות. לאחר מכן, מרחו את תמיסת הצביעה המתאימה על התאים בהתאם להוראות היצרן וספרו 200 תאים לכל עכבר תחת הגדלה של 400 פעמים.עבור דגימת דם לבבית, אספו כ-500 microliters של דם מהבעליים שנחשפו לאוזון באמצעות פנקטורה לבבית. הוסיפו את הדם לשפופרות של 1.5 milliliter על קרח. לאחר 30 דקות על קרח, סבבו את דגימות הדם בצנטריפוגה והעבירו את על-משקעי הסרום לשפופרות חדשות לאחסון בחנקן נוזלי.ניתן להפשיר את הדגימות מאוחר יותר לצורך הערכת רמות הביטוי של ציטוקינים בסרום באמצעות ELISA לפי פרוטוקולים סטנדרטיים. לצורך ניתוח מורפומטרי של הריאה, יש להניח את העכבר הראשון במנח גב (supine) לאחר דגימת הלב. לאחר מכן, פתח את חלל בית החזה ונתק את ה-platysma ואת שרירי קנה הנשימה הקדמיים כדי לגשת לטבעות קנה הנשימה.אספו את הריאות ואת הקנה מבלי להפריד את הלב מהריאות. לאחר מכן, השתמשו בצינור פוליאתילן מסוג PE90 כדי לחבר קטטר אנדוטראכאלי למזרק המכיל 4% formaldehyde ונפחו את הריאות באופן מלא עם כ-200 µL של paraformaldehyde. לאחר מכן, הניחו את הריאות במבחנה של 15 mL המכילה 10 mL של formaldehyde רענן בריכוז ארבעה אחוזים למשך ארבע שעות לפחות.כפי שהוערך באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת במיקרו (microcomputed tomography), עכברים שנחשפו לאוזון מראים נפח ריאה כולל ואחוז של אזור בעתenuation נמוכה הגדולים באופן משמעותי מאלו של חיות בקבוצת הביקורת שנחשפו לאוויר סביבתי. הפנוטיפ של האמפיזמה בא לידי ביטוי גם באלווולי ריאה מורחבים ובממוצעי חיתוך קווים (mean linear intercepts) מוגברים. הערכת תפקודי הריאה באמצעות פלתיסמוגרף מדגימה כי כל הפרמטרים שיורדים בעכברים שנחשפו לאוזון עקביים עם הפגמים התפקודיים הטיפוסיים של הריאות הנצפים בחולים עם מחלה ריאתית חסימה כרונית (COPD).יתרה מכך, חשיפה לאוזון מפחיתה באופן משמעותי את זמן העייפות ואת מרחק העייפות במבחני סבילות למאמץ. בעלי חיים שטופלו באוזון מראים גם עלייה משמעותית בתאים דלקתיים, כולל מקרופאגים ונויטרופילים, כמו גם ירידה משמעותית ב-IL-10 ועלייה ב-IL-1 beta וב-TNF alpha, מה שמוכיח כי מודל החשיפה לאוזון משחזר תסמינים דמויי מחלת ריאות חסרתית כרונית (COPD) בבני אדם. ביצוע פרוצדורה זו בזנים אחרים של עכברים, כגון עכברי C57 BR6, יכול לשמש ליצירת מודל OE זה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום מחלות הריאה לבחון את המנגנונים העומדים בבסיס ה-COPD.זכרו כי עבודה עם פאראפורמאלדהיד עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות, הרכבת משקפי מגן ועבודה עם התמיסה בתוך מapay (מכסות שאיבה), בעת העבודה עם ריאגנט זה.

generation-chronic-obstructive-pulmonary-disease-model-mice-repeated

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאור מפורט צעד אחר צעד של הנהלים הנדרשים לביצוע מדידות של מכניקה של מערכת נשימה, כמו גם ההערכה של היענות נשימה לשאיפת מטכולין בעכברים באמצעות טכניקת התנודה נאלצה (flexiVent; SCIREQ Inc, מונטריאול, QC , קנדה).

הערכה של מכניקת מערכת נשימה בעכברים באמצעות טכניקת תנודה בכפייה

אנו מתארים את השיטה אגר חרוזים להקים זיהום מתמשך לטווח ארוך כרוני Pseudomonas aeruginosa בדרכי אוויר במודל העכבר.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטות אוטומטיות לכימות פתולוגיות ריאה כרוניות במודל עכברי של COPD. הפרוטוקול כולל חשיפת עכברים לעשן סיגריות (CS), מדידת תפקוד ריאתי, ניפוח הריאות ושימוש בשיטות מורפומטריה למדידת אמפיזמה ושיפוץ דרכי נשימה קטנות בעכברים.

מדידה אוטומטית של הריאות נפחתו וקטן Airway Remodeling בעכברים שנחשפו לעשן סיגריות

מוצג כאן הוא פרוטוקול שימושי עבור קיבעון ריאה שיוצר מצב יציב עבור הערכה היסטולוגית של דגימות ריאה ממודל העכבר של אמפיזמה. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהוא יכול לתקן את הריאות הרבה עם הלחץ התמידי אותו ללא התמוטטות ריאה או בדלציה.

קיבעון ריאה תחת לחץ מתמיד על הערכה של אמפיזמה בעכברים

כאן אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי ריאות miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים שימוש בעכברים נחשפים האוזון או סינון אוויר בשלבים שונים של ייחום.

ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לקביעת האם חשיפה לאוזון, קריטריון מזהם אוויר, פוגע מכתשי מקרופאג efferocytosis בvivo. פרוטוקול זה מנצל בדרך כלל ריאגנטים וטכניקות והוא יכול להיות מותאם מודלים מרובים של פגיעה בריאות כדי לקבוע את ההשפעות על מכתשי מקרופאג efferocytosis.

בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון

אוזון משולב ועכברים חשופים אנדוטוקסין חיידקי מראים מוות תאי נרחב, כולל זה של נויטרופילים. ראינו התאמות תאיות כגון שיבוש של lamellipodia ציטוסלטל, ביטוי תאי מוגבר של subunit סינתאז V ATP מורכב β ואנגיוסטין בשטיפת ברונכו-מכתשית, דיכוי התגובה החיסונית ריאות וגיוס נויטרופילים מעוכבים.

הדמיה של התאמות תאיות ריאות במהלך אוזון משולב ו- LPS המושרה פגיעה ריאות חריפה מורין

מודלים שונים של בעלי חיים של פיברוזיס ריאתי הוקמו באמצעות בלומיצין כדי להבהיר את הפתוגנזה של פיברוזיס ריאתי ולמצוא מטרות תרופות חדשות. עם זאת, רוב המודלים פיברוזיס ריאתי המכוונים לרקמת הריאה יש מתן תרופות לא אחיד. כאן, אנו מציעים מודל של פיברוזיס ריאתי אחיד המושרה על ידי nebulization בלומיצין האף.

מודל עכבר של פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי נבוליזציה של בלומיצין באף

פרוטוקול זה מתאר שיטה לביסוס מודל עכברי של סיליקוזיס באמצעות חשיפה חוזרת ונשנית לתרחיפים של סיליקה באמצעות טפטוף אף. מודל זה יכול לחקות ביעילות, בנוחות ובגמישות את התהליך הפתולוגי של סיליקוזיס אנושי עם חזרתיות וחיסכון גבוהים.

מודל עכבר סיליקוזיס שנקבע על ידי שאיפה חוזרת ונשנית של אבק סיליקה גבישי

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשראת פיברוזיס ריאתי בעכברים באמצעות מתן חוזר ונשנה של בלאומיצין, המניב מאפיינים פתולוגיים הדומים מאוד לאלה של פיברוזיס ריאתי אידיופטית.

מודל עכברי מעודן של פיברוזיס ריאתי אידיופטי

כאן אנו מציגים פרוטוקול למידול פיברוזיס ריאתי בעכברים באמצעות בלומיצין אירוסולי המועבר דרך קנה הנשימה. שיטה אופטימלית זו מאפשרת מסירה אחידה, כמותית ומדויקת ללא חתך כירורגי, ומשפרת את השחזור והאמינות של פיברוזיס הנגרמת על ידי בלומיצין.

שיטה משופרת מבוססת אירוסולים להעברת בלומיצין תוך-קנה הנשימה למודלים של עכברים ניתנים לשחזור ומינימום פולשני של פיברוזיס ריאתי

למדו כיצד ליצור מודל של מחלת ריאות חסימתית כרונית בעכברים באמצעות חשיפה חוזרת לאוזון. מודל זה מחקה תהליכים פתולוגיים של COPD ומסייע בסינון תרופות חדשות.

דור של מחלת ריאות חסימתית כרונית מודל בעכברים על ידי חשיפה חוזרת ונשנית האוזון

גלה סרטונים נוספים