C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

המטרה הכוללת של שילוב זה של שיטות סטנדרטיות היא להדגים כיצד ניתן להשתמש במעי C.elegans לניתוח in vivo של ביוגנזה של ממברנה מקוטבת ומורפוגנזה של לומן ברמת התא הבודד והתת-תאי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הקוטביות והביוגנזה כגון כיצד תחומי ממברנה אפיקליים לעומת בסיסיים ואסימטריות תת-תאיות אחרות נוצרות ונשמרות במהלך ואחרי מורפוגנזה. היתרון העיקרי של מערכת מודל זו הוא ששכבה אחת שקופה זו של 20 תאים בלבד יכולה לשרוד בתא רקמות in vivo כדי לנתח ממברנה מקוטבת של תא בודד וביוגנזה לומן.

ניתן להרחיב את הטכניקות לניתוח פנוטיפים אחרים של מורפוגנזה של C.Elegans ההתמקדות כאן היא בניתוח ביוגנזה של הממברנה, במיוחד על ביוגנזה של הממברנה האפיקלית והלומן. ההליכים כוללים טכניקות הדמיה מעודנות בבעלי חיים קבועים וחיים כדי להבחין בין תחומי ממברנה ורכיבים תת-תאיים ולזהות פנוטיפים של מורפוגנזה לומן במעי C.elegans. סרטון זה על טובולוגנזה במעי מלווה בסרטון על מודלים אינפורמטיביים הדדיים של תעלת ההפרשה שבהם ניתוח in vivo של ביוגנזה של ממברנה מקוטבת.

בנוגע לתיוג, דור בעלי חיים טרנסגניים עם חלבוני היתוך מסומנים פלואורסצנטיים להדמיה חיה מתואר בסרטון הנלווה על ניתוח טובולוגנזה של תעלת הפרשה. ניתן להשתמש בבעלי חיים כאלה ישירות בניסויי RNAi. דור שלישי הוא בדרך כלל הצעד הראשון בשילוב זה של נהלים.

סרטון זה מתחיל בשיטת התיוג האלטרנטיבית צביעת נוגדנים שעבורה יש לתקן בעלי חיים. ניתן לשלב את הליכי התיוג השונים עם אימונוהיסטוכימיה המשמשת בדרך כלל לניתוח ההדמיה הסופי. לפרוטוקול זה יש גם דוגמאות לסמני ממברנה ספציפיים למעי, מקדמים ומשאבים אחרים שימושיים לשני הליכי התיוג.

לאחר הדגמת אימונוהיסטוכימיה, סרטון זה משתמש בזן טרנסגני המסמן את הממברנה האפיקלית של המעי עם ERM-1 GFP כדי לחפש פנוטיפים של קוטביות ומורפוגנזה לומן באמצעות RNAi. ראשית הכינו שקופית לתיקון התולעים. פיפטה 30 מיקרוליטר של פולי-L-ליזין על שקופית ואז הניחו שקופית שנייה על השנייה וזרקו אותם יחד כדי לפזר את התמיסה באופן שווה על שניהם.

כעת מקלפים את שתי השקופיות ונותנים להן להתייבש באוויר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו גוש מתכת שטוח למיכל מלא בחנקן נוזלי. שוטפים את הצלחות בתמיסת M9 ומעבירים כ -10 מיקרוליטר M9 המכיל את התולעים.

לחלופין, בחר את התולעים והוסף M9 לשקופית. לאחר העברת התולעים, זרוק בעדינות החלקת כיסוי עליהן כך שהכיסוי מחליק מעל תלוי בקצה אחד. לאחר מכן לחץ בעדינות על החלקת הכיסוי מבלי לבצע תנועות רוחביות.

כעת העבירו מיד את השקופית לגוש המתכת בחנקן נוזלי ותנו לה להקפיא. לאחר חמש דקות הורד את החלקת הכיסוי באמצעות הקצה התלוי. עשה זאת במהירות כדי לקבל את הסדק הנכון של הציפורן.

לאחר מכן, טבלו את השקופית בצנצנת זכוכית קופלין מלאה במתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות העבירו את השקופית לצנצנת זכוכית קופלין מלאה באצטון למשך חמש דקות נוספות באותו טמפטורה. ניתן לצבוע את השקופיות ישירות או לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס.

הסר את השקופית מהאצטון ותן לה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סמן את המיקום לקיר עגול של ג'לי נפט בצד התחתון של המגלשה, ואז בנה את דופן הג'לי. אין לשפשף את הג'לי במהלך הליך זה.

לאחר מכן, הכינו תא רטוב בפח עם מגבות נייר רטובות והניחו את השקופית על מתלה בתוכו. לא אמור להיות מגע בין המגבות למגלשה או בין מגלשות סמוכות. עכשיו פיפטה מספיק PBS לתוך עיגול הג'לי כדי לכסות את האזור.

הניחו בעדינות קצה פיפטה בקצה העיגול ואפשרו לנוזל להתפזר בצורה חלקה על התולעים. לאחר מכן סגור את המכסה והמתן חמש דקות. לאחר חמש דקות הטה את המגלשה ושאף לאט את ה-PBS תוך הקפדה לא לאבד תולעים מהמגלשה.

לאחר מכן, מלאו בזהירות את עיגול הג'לי בתמיסת חסימה טרייה. ותנו למגלשה לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות יש להחליף את תמיסת החסימה בתמיסת חסימה המכילה את הנוגדן העיקרי.

ודגרו על המגלשה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת הסר את הנוגדן העיקרי ושטוף את השקופית על ידי מריחה והסרה של תמיסת חסימה שלוש פעמים. אפשר לכל יישום בלוק לדגור למשך 10 דקות.

לאחר מכן מוסיפים את הנוגדן המשני המדולל בתמיסת חסימה ומדגרים את המגלשה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את השקופית פעמיים עם תמיסת חסימה ולאחר מכן פעם אחת עם PBS. לאחר מכן הסר כמה שיותר מה-PBS מבלי לאפשר לדגימה להתייבש והסר בזהירות את הג'לי סביב הדגימה.

מרחו טיפה של מדיום הרכבה על הדגימה ואחריה החלקת כיסוי וחותם לק. לאחר מכן אחסן את השקופיות בחושך בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את לוחית ספריית ה-RNAi ממינוס 80 מעלות צלזיוס לקרח יבש.

הסר את סרט האיטום. ולהעביר את שיבוט העניין למקדחה סלקטיבית. לאחר מכן פס את השיבוט וגדל את החיידקים במהלך הלילה.

לפני החזרת צלחת הספרייה למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס יש למרוח סרט איטום חדש. למחרת לחסן מושבות מהצלחת לתוך מיליליטר אחד של מדיום נוזלי המכיל אמפיצילין. לאחר מכן יש לנער אותם במשך כ-14 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת זרעו 200 מיקרוליטר לכל שיבוט על לוחות RNAi נפרדים. הניחו לצלחות להתייבש וגרמו לייצור ה-RNAi עם דגירה למשך הלילה בטמפרטורת החדר. יום לאחר מכן העבירו חמש תולעים בשלב L4 לכל לוחית RNAi המסומנת בגן הספציפי שאליו מכוון.

לאחר מכן העבירו את הצלחות לחממה בדרך כלל בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. ראשית בחן בקרה לעומת חיות RNAi באור בהיר בהגדלה נמוכה וגבוהה. לאחר מכן, בחן בקרה מול חיות RNAi באור פלואורסצנטי תחת המסננים המתאימים.

סרוק באופן שיטתי צלחת עם חיות RNAi משמאל למעלה לימין התחתון של הצלחת כולה בחיפוש אחר פנוטיפים. חפשו בעלי חיים מעניינים. לבחינה מדוקדקת יותר של פנוטיפים נבחרים של RNAi התמקדו במעי והשתמשו בזום כדי להעריך פנוטיפים של טובולוגנזה ומורפוגנזה לומן.

כדי לבחון את התולעים המעניינות במיקרוסקופיה קונפוקלית, הרכיב תחילה ושיתק אותן ביד, צור עיגול דק של שומן ואקום או ג'לי נפט על מגלשת זכוכית. שכבת השומן צריכה להיות דקה ולא עבה יותר מ- 0.1 מילימטר. לאחר מכן, הוסף כ-3.5 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי נתרן אזיד לאמצע המעגל.

לאחר מכן בחר במהירות תולעים מעניינות לתמיסה תחת מיקרוסקופ מנתח לפני שהתמיסה מתייבשת. לאחר מכן מרחו בעדינות פתק כיסוי ודמו את החיות תוך 30 דקות. השתמש בלחץ מתון ותחת המיקרוסקופ וודא שהתולעים אינן צפות בתמיסה.

תחת המיקרוסקופ הקונפוקלי מצא את התולעים תחת הספק ומיקוד נמוכים. לאחר מכן השתמש במטרת טבילה בשמן פי 60 או פי 100 כדי להציג ולדמיין את המעי. לאחר מכן, בחנו את החיה באור פלואורסצנטי עם הערוץ המתאים כדי לבחור אזורים המציגים את הפגם הסלולרי המעניין.

זוז במהירות כדי למנוע הלבנת תמונות. לאחר מכן עברו לסריקת לייזר והגבילו את התמונה למעי על ידי קביעת גבולות סריקה בצד הגבי והגחוני שלו. צלם סדרת תמונות ולאחר מכן מזג את התמונות לתמונת הקרנה אחת.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח מולקולרית ולנתח חזותית ביוגנזה של ממברנה מקוטבת במעי C.elegans המתפתח שבו הממברנה האפיקלית ומורפוגנזה לומן חופפות. ניתן לפתור את תחומי הממברנה האפיקליים והבסיסיים, הצמתים הקשורים לממברנה ולומן המעי ולבחון את הקשר שלהם זה לזה לאורך כל ההתפתחות. רכיבים תת-תאיים אלה יכולים להיות מסומנים על ידי נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים או חלבוני היתוך פלואורסצנטיים לתיוג כפול או משולש כמתואר במאמר הנלווה.

ניתן לסרוק במהירות פגמים בלומן גס באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מנתח. מקשר השלד התא של הממברנות האפיקליות ERM-1 בשילוב עם GFP הוא סמן בעל ביטוי חזק שימושי עבור מסך RNAi. מערך של מורפוגנזה חדשה של לומן המעי ופנוטיפים של קוטביות יחד עם פגמי הגנים הבסיסיים שלהם נחשפו בעת שימוש בסמן זה.

לאחר מכן נעשה שימוש בתמונות בהגדלה גבוהה יותר שנרכשו על ידי סריקת לייזר קונפוקלית כדי לבחון בזהירות רבה יותר את הפנוטיפים כדי להבין טוב יותר את הפגמים הבסיסיים. ניתן לכמת כמה פנוטיפים. נעשה שימוש בכימות כדי להשוות פגמים כאלה ולעקוב אחר התקדמותם במהלך הפיתוח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג תאי קרום מעי ואנדו ממברנה על ידי צביעה חיסונית וכיצד לנתח פנוטיפים של RNAi תפקודי של ממברנה מקוטבת וביוגנזה לומן.