הערכה stereological של דופאמין נוירון במספר העכבר הסובסטנציה ניגרה באמצעות מיקרוסקופ רגיל ציוד אופטי Fractionator
1 בספטמבר 2017
עבודה זו מציג עבור הערכת stereological לא משוחדת של מספרים דופאמינרגיים וכולינרגיים פרוטוקול צעד אחר צעד העכבר הסובסטנציה ניגרה באמצעות מיקרוסקופ רגיל ציוד (קרי, מיקרוסקופ אור, טבלה אובייקט ממונע (x, y, z המטוס), ותוכנה הציבור לניתוח תמונה דיגיטלית.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את ההערכה הסטריאולוגית מבוססת התכנון של מספר התאים הדופמינרגיים ב-SN של העכבר באמצעות ציוד מיקרוסקופיה סטנדרטי. שיטה זו שימושית להערכת מספר הנוירונים הדופמינרגיים בעכבר substantia nigra למחקר פרקינסוני פרה-קליני של מחלת פרקינסון באמצעות סטריאולוגיה בלתי משוחדת מבוססת עיצוב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה עם ציוד מיקרוסקופיה סטנדרטי ללא צורך במערך סטריאולוגי מלא זמין מסחרית.
מי שתדגים את ההליך תהיה לואיזה פריז, טכנאית מהמעבדה שלי. התחל בהנחת מוח עכבר קבוע של פרפורמלדהיד לתוך מטריצת מוח וביצוע חתך פלוס 0.74 מילימטרים מברגמה. העבירו את החלק הזנבי של המוח, כולל ה-SN, ל-4% PFA ב-0.1 מולרית, וקבעו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, החליפו את ה-PFA ב-30% סוכרוז ב-0.1 PBS מולארי ודגרו למשך יומיים נוספים בארבע מעלות צלזיוס כדי להגן על הדגימה. לאחר יומיים כאשר המוח שקע בסוכרוז, הכניסו את הרקמה לתוך Cryomold מלא בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית והקפיאו לאט את הרקמה באיזופנטן נוזלי מקורר קרח יבש. השתמש בקריוסטט כדי לחתוך באופן סדרתי קטעי קריו של 30 מיקרון במישור העטרה.
סמן את ההמיספרה הימנית על ידי ניקוב חור קטן באזור העליון של גזע המוח. אסוף ארבע סדרות של קטעים המתחילים במינוס 2.46 מילימטרים מברגמה ומסתיימים ב-4.04 מילימטרים מברגמה. העבירו כל סדרת חלקים לצינור מלא בחומר קריופרוטקטנט ואחסנו במינוס 20 מעלות צלזיוס.
צלם תמונות דיגיטליות של מקטעי SN מוכתמים אימונוהיסטוכימית של טירוזין הידרוקסילאז באמצעות תוכנת הדמיה המשולבת למיקרוסקופ. התחל בקביעת ההרכבה והעובי בפועל של החלקים בשלושה אתרי ספירה שנבחרו באופן אקראי לכל קטע. לחץ תחילה על הצג את ההיסט העליון כדי להגדיר את החלק העליון של הקטע.
לאחר מכן לחץ על עצור תצוגה למעלה. לאחר מכן, לחץ על הצג היסט תחתון ולאחר מכן לחץ על עצור הצג למטה. רשום את עובי הקטע.
חשב את אזור השמירה על ידי חיסור שלושה מיקרון מההיסט העליון והקלד את התוצאה בתיבת ההיסט העליונה. לאחר מכן הפחיתו את גובה 13 מיקרון של החיתוך האופטי ממספר ההיסט העליון והקלידו את התוצאה בתיבת ההיסט התחתונה. בחר את הפרמטרים הבאים, שלבים 14, גודל 1.00.
בחר את הספריה לשמירת הקובץ. לחץ על רצף כדי להתחיל את הרכישה. לאחר רכישת התמונות, לחץ על עיבוד ובחר את הפרמטרים הבאים, כל המישורים מרצף, מונטאז' ותיבות המהירות והתפירה עם חפיפת תמונה של 10%התחל לתפור את התמונות על ידי לחיצה על התחל.
זה ייצור תמונות ערימה לניתוח. כדי להתחיל, פתח את התמונה על ידי לחיצה על קובץ ופתח. קבעו את קנה המידה של התמונה בעזרת הפקודה 'ניתוח' ו'קביעת קנה מידה'.
משלב זה, שנה את הגודל המוגדר מפיקסלים למיקרונים. בחר את התוספים ולאחר מכן את הפקודה grid type lines כדי להוסיף רשת באופן אקראי. סמן את תיבת ההיסט האקראי.
הגדר את גודלו של ריבוע אחד בתוך הרשת כ-130 מיקרון על 130 מיקרון כדי להיות שווה ל-16,900 מיקרון מרובע. שנה את סוג התמונה מ-16 סיביות לצבע RGB על ידי לחיצה על התמונה ולאחר מכן הקלד ולאחר מכן צבע RGB. אתר את החומר השחור pars compacta.
הקף את האזור בעזרת כלי מברשת הצבע באמצעות רוחב מברשת של 11. בטל את הפקודה להגדיר קנה מידה על ידי לחיצה על ניתוח ואז הגדר קנה מידה ואז לחץ כדי להסיר קנה מידה כדי לחשב בפיקסלים ולא במיקרונים. צלם צילום מסך, שמור את קובץ התמונה ופתח את הקובץ החדש באמצעות ImageJ.
בחר מברשת ורוחב מברשת של 25. סמן כל ריבוע רשת שיוצר קשר עם ה-SN למיקום דיסקטור אופטי. בחר ריבוע רשת אחד הכולל חלקים מה- SN. מדוד את הפינה השמאלית העליונה של הריבוע עם הסמן ב-ImageJ כדי להגדיר את הקואורדינטות ההתחלתיות x ו-y.
בחר את תבנית הגיליון האלקטרוני שכותרתה מיקום דיסקטור אופטי וחשב את מיקום החיתוך האופטי. לאחר מכן הערך את מספר התא באמצעות חישוב גיליון אלקטרוני של ספירת תאים כמתואר בחלק הכתוב של הפרוטוקול. התמונה הזו בעוצמה נמוכה מציגה אזור במוח של עכבר אחרי צביעת TH עבור תאי עצב דופמינרגיים.
הגדלה גבוהה יותר מתארת נוירונים דופמינרגיים חיוביים TH. הכניסה מציגה את האזור בקופסה בהגדלה מוגברת. תמונה זו מציגה סדרה אחת של קטעי SN מוכתמים TH המכסים את כל SN העכבר מרוסטרל לזנב.
כל קטע מופרד מהקטע העוקב ב-120 מיקרון. מספר תאי העצב החיוביים ל-TH ב-SN של העכבר הימני והשמאלי הוערך באמצעות השיטה המוצגת בסרטון זה ובאמצעות מערכת סטריאולוגית זמינה מסחרית. כפי שניתן לראות כאן, שתי השיטות הביאו לספירת תאים דומה ולא היו הבדלים משמעותיים בין מערכי הנתונים.
אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי כמו כפפות מגן בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הערכה סטריאולוגית בלתי משוחדת של מספר הנוירונים הדופמינרגיים בעכבר החומר השחור באמצעות שיטת השבר האופטי וציוד מיקרוסקופיה סטנדרטי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתווה פרוטוקול להערכה סטריאולוגית לא מוטה של מספר תאי עצב דופמינרגיים ב-substantia nigra של עכבר, תוך שימוש בכלי מיקרוסקופיה סטנדרטיים. שיטה זו שואפת להקל על מחקר פרה-קליני במחלת פרקינסון באמצעות אספקת גישה מהימנה לכמות תאים, ללא צורך במערכות סטריאולוגיות ייעודיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר על מחלת פרקינסון
רקע
- נוירונים דופמינרגיים הם קריטיים לבקרה מוטורית.
- ה-substantia nigra היא אזור מפתח המושפע ממחלת פרקינסון.
- סטריאולוגיה בלתי מוטה מספקת שיטה כמותית חסונה.
- ציוד מיקרוסקופיה סטנדרטי הופך את הטכניקה לנגישה.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול שלב-אחר-שלב לכימות נוירונים.
- שימוש בסטראולוגיה לא משוחדת מבוססת-תכנון (design-based unbiased stereology) במודלים של עכברים חיים.
- מתן אפשרות למחקרים פרה-קליניים הבוחנים אובדן של נוירונים דופמינרגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיה סטנדרטית, כולל מיקרוסקופיה של אור ותוכנה לניתוח תמונות דיגיטליות.
- ה-substantia nigra של עכבר כמודל ביולוגי.
- קיבוע, קריו-הגנה (cryoprotection) וחיתוך מפורטים של רקמת מוח של עכבר.
- דימות דיגיטלי וטכניקות ספציפיות של אימונוהיסטוכימיה.
- מדידות וחישובים מדויקים לקביעת ספירת נוירונים.
תוצאות עיקריות
- הוכח כי ניתן להערכת במדויק את מספר הנוירונים הדופמינרגיים ב-SN.
- הן שיטות סטנדרטיות והן שיטות מתקדמות הניבו ספירות נוירונליות דומות.
- דגש חשוב על מהימנות השיטה באמצעות כלים סטנדרטיים.
מסקנות
- מחקר זה מציג גישה מעשית לכימות אוכלוסיות נוירונליות במחקר.
- הוא משפר את ההבנה של אובדן נוירונים במחלת הפרקינסון.
- השיטה עושה שימוש בכלים זמינים, ובכך מקדמת יישום רחב יותר במחקרי מדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מדויק של אובדן נוירונים דופמינרגיים ב-substantia nigra הוא נקודת קצה קריטית במחקר פרה-קליני של מחלת פרקינסון, המהווה בסיס ישיר לתיקוף מטרות (target validation) ולהפחתת סיכונים מכניסטיים של אסטרטגיות נוירו-פרוטקטיביות. פרוטוקול זה מאפשר הערכה סטריאולוגית מהימנה ובלתי מוטה באמצעות ציוד מיקרוסקופיה סטנדרטי, ובכך מפחית את התלות במערכות סטריאולוגיה ייעודיות ומגביר את הנגישות לתהליכי עבודה של ביולוגיית גילוי. על ידי אספקת נתוני ספירת תאים כמותיים וניתנים לשחזור, השיטה תומכת בביטחון חזוי בבחינת היפותזות של מטרות בשלבים מוקדמים ובהחלטות של תיעדוף פורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי אספקת כימות לא מוטה של הישרדות נוירונים דופמינרגיים במודלים פרה-קליניים של מחלת פרקינסון.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות סטריאולוגיה מבוססת-תכנון, הממזערת הטיות של הצופה ושונות טכנית במחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
- ערך ניבוי: מייצר נתוני ספירה נוירונלית כמותיים המסייעים בהערכת יעילות המודולציה של המטרה ובקבלת החלטות המשך (go/no-go) בשלבי הגילוי המוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר תוצרים היסטולוגיים כמותיים וסטנדרטיים המתאימים לתיקוף של תוצאות סינון (screening hits) השואפות לשמר את שלמות הנוירונים הדופמינרגיים.
- שחזוריות: מספק מדידות עקביות של ספירת תאים בין חתכים ובין בעלי חיים, ובכך תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך הערכת תרכובות בשלבים הבאים.
- יכולת הרחבה (Scalability): תואם למיקרוסקופיה סטנדרטית ולתוכנות לניתוח תמונות, מה שמאפשר אימוץ רחב יותר בפלטפורמות גילוי ללא צורך בחומרה ייעודית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה באופן ישיר את אובדן הנוירונים הדופמינרגים ב-substantia nigra, מאפיין פתולוגי מרכזי של מחלת פרקינסון, ובכך משפר את התוקף התרגומי.
- המשכיות פרה-קלינית: מספק גשר כמותי משלב סריקת הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי אספקת נתונים השווים למערכות סטראולוגיה מסחריות.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר קבלת החלטות אובייקטיביות ומבוססות נתונים לגבי קידום תרכובות, בהתבסס על מדדי הישרדות נוירונלית חזקים מבחינה סטטיסטית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד להערכת יעילות פרה-קלינית, ומספקת קריאה היסטולוגית כמותית התורמת להבנה מכניסטית ולביטחון במטרה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות כימות של אוכלוסיות נוירונים דופמינרגיים כקריאה פונקציונלית של מודולציית מסלולים במודלים פרה-קליניים.
- סריקה: מייצר פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור המבוססים על דימות, המאפשרים השוואה אמינה של השפעות תרכובות על הישרדות נוירונים.
- אנליטיקה: מספק נתוני ספירה מספריים של תאים ויכולת השוואה סטטיסטית בין קבוצות ניסוי, מה שמקל על השוואות תנאים מבוססות נתונים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם הפתולוגיה של מחלת הפרקינסון על ידי מדידת אובדן נוירונים באזור מוחי רלוונטי למחלה, ותומך בתיקוף פרה-קליני המותאם לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה סטנדרטי ונגיש של סטראולוגיה שניתן להחיל על תוכניות גילוי מרובות בתחום מדעי המוח ללא צורך בציוד בעל עלות הונית גבוהה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות כימות סטריאולוגי לא מוטה ומבוסס תכנון.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה בין מעבדות באמצעות שימוש בכלים זמינים למיקרוסקופיה וניתוח תמונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי ביטול הצורך במערכות סטריאולוגיה ייעודיות, תוך שמירה על יכולת השוואה של הנתונים לפלטפורמות מסחריות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים פרה-קליניים בהתבסס על נתונים כמותיים ומתוחקקים היסטולוגית של שימור נוירונים דופמינרגיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהיסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה ועקרונות סטראאולוגיים להכנה מדויקת של רקמות ולזיהוי אזורים.
- תלוי בציוד מיקרוסקופיה ממוטור עם בקרת ציר z ותוכנה לתפירת תמונות לצורך ניתוח שיטתי של חתכים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, עובי החתכים וכללי הספירה כדי להבטיח שחזוריות בין אתרים שונים.
- התאמה לאזורי מוח אחרים או לסוגי נוירונים אחרים עשויה לדרוש התאמות בפרמטרי הצביעה, בגודל הרשת ובמימדי ה-optical dissector.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות באיכות החתכים ואת הצורך בהדרכה קפדנית כדי לשמור על דיוק הספירה ולמנוע הטיות דגימה.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
- ערך מדעי: חזרה על הפרוצדורה במספר חתכים ובמספר בעלי חיים נותנת מענה לשונות ביולוגית וטכנית, ומגבירה את הביטחון בכך שמספרי הנוירונים שנצפו משקפים השפעות ניסוייות אמיתיות ולא תוצרי לוואי של הדגימה.
- ערך תפעולי: פרוטוקולי דגימה עקביים מפחיתים שונות בין מבצעים שונים ותומכים בסטנדרטיזציה בין מעבדות, דבר החיוני לפרויקטים של גילוי רב-אתריים.
