ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את מספר עותק החלבון המוחלט של חלבון מטרה ברזולוציה של תא בודד. טכניקות של תא בודד יאפשרו הבנה טובה יותר של התנהגות החלבון בכל הקשור לדוגמה מרכזית ויסייעו לכימות מדויק של ביטוי הגנים המבוקר. עבודה ברמת התא הבודד יכולה ללכוד את ההטרוגניות העשירה של אוכלוסיית התאים שאחרת הייתה הולכת לאיבוד על ידי המיצוע המתרחש בטכניקות ביוכימיות מסורתיות.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הרגישות של בדיקות תא בודד או כמות מוגבלת של חלבון בכל תא. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר רצינו לבצע בדיקת חלבון חד-תאית שניתן לדגום בקלות לניתוח נוסף בהמשך הזרם. התחל הליך זה על ידי ייצור שבבים והדפסת מיקרו-מערכי נוגדנים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

להכנת המכשיר, הזינו צינור סיליקה התמזג באורך של 100 מילימטר בקוטר פנימי של 150 מיקרון בקוטר חיצוני של 360 מיקרון לצינורות PFA בקוטר חיצוני של 40 מילימטר בקוטר פנימי של 1/16 אינץ' עד שהוא בולט בשני מילימטרים. זה יהווה את הזרבובית הקונצנטרית. מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על קצה קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר והכניסו אותו לחתיכת צינור PFA בגודל 40 מילימטר

במידת הצורך, מקם מחדש את צינור הסיליקה המותך כדי לשמור על בליטה של 2 מילימטר בזרבובית לפני שהדבק מתייצב. הכנס את הקצה השני של נימי הסיליקה הממוזגים לקצה של צינור PTFE באורך 200 מילימטר בקוטר פנימי של 014 אינץ' בקוטר חיצוני של 062 אינץ'. חבר את זה למזרק המילטון בנפח 100 מיקרוליטר מלא באלבומין סרום בקר של ארבעה אחוזים במי מלח עם פוספט.

לאחר מכן, הכנס צינור FEP באורך 400 מילימטר בקוטר פנימי של 1 מילימטר, קוטר חיצוני של 2 מילימטר לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עד ליצירת אטימה. מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על קצה פיפטה נוסף של 200 מיקרוליטר, ולאחר מכן דחפו אותו לקצה הראשון כדי לקבע את הצינור במקומו. לאחר מכן חבר את הקצה הפתוח של צינור ה-FEP למזרק המילטון בנפח 1 מיליליטר מלא בשמן מינרלי.

הכנס את מכלול קצה הפיפטה בנפח 200 מיקרוליטר לקצה הפיפטה בנפח 10 מיקרוליטר של הזרבובית הקונצנטרית. לאחר מכן, מלאו את המזרק בנפח 100 מיקרוליטר בתמיסת חסימת PBSA של 4 אחוזים. חבר מחדש ושטוף את הצינור המימי עם תמיסת החסימה.

חזור על הפעולה פעמיים בסך הכל שלוש שטיפות בסך הכל. לאחר מכן מלאו את המזרק בנפח 100 מיקרוליטר בנוגדני זיהוי של 0.125 מיקרוגרם לליטר ב-PBSA של 4 אחוזים וחברו מחדש את הצינור. החלף את תמיסת החסימה בצינור על ידי חלוקת 25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לזיהוי.

שטפו את צינורות השמן בשמן מינרלי עד שכל הצינורות והזרבובית מתמלאים בשמן. לאחר מכן מלאו מחדש את המזרק של 1 מיליליטר בשמן מינרלי וחברו מחדש את הצינור. לבסוף, אבטח את מכלול הצינורות והזרבובית למניפולטור XYZ.

כדי ליצור טיפות הניתנות להתייחסות, אבטח את השבב על במת המיקרוסקופ. רשום את קואורדינטות השלב של המיקרוסקופ של כל נקודה במערך באמצעות תוכנת בקרת המיקרוסקופ האוטומטית. לאחר מכן, הגדר את המניפולטור XYZ על שלב המיקרוסקופ.

הנח את המזרקים במשאבות מזרקים נפרדות מכיוון שיהיה צורך להפעיל אותם באופן עצמאי. הנח את הזרבובית בזווית של 50 עד 60 מעלות. לאחר מכן הגדר את משאבת המזרק המימית להוציא 10 ננוליטר של 100 מיקרוליטר לדקה, והגדר את משאבת מזרק השמן לפיזור 5 מיקרוליטר ב-100 מיקרוליטר לדקה.

הוצא את התמיסה המימית עד שנראה חרוז נוזל בראש הזרבובית. טפחו את החרוז במגבון נטול אבק כדי להסיר אותו. באמצעות תוכנת בקרת המיקרוסקופ האוטומטית, הגדר את קואורדינטות שלב המיקרוסקופ לנקודת נוגדנים במערך והתמקד במשטח החלקת הכיסוי.

בעת יישור הזרבובית, היזהר לא להפריע לנקודת הנוגדנים. היזהר במיוחד וודא שאתה מתבונן בהתקרבות של קצה נימי הזכוכית דרך מיקרוסקופ. היזהר לא להפריע למקום, השתמש במניפולטור XYZ כדי ליישר את קצה נימי הזכוכית של הזרבובית הקונצנטרית לצד נקודת הנוגדנים.

לאחר היישור, יש להוציא 10 ננוליטר של תמיסה מימית. מבלי להזיז את השלבים, הוציאו חמישה מיקרוליטר שמן כדי לכסות את התמיסה המימית. הרם לאט את הזרבובית מהטיפה ועבור לבאר הבאה.

חזור על שלב זה עבור כל כתמי הנוגדנים במערך. לאחר 30 דקות, צלם את כל הנקודות במערך באמצעות תוכנת בקרת המיקרוסקופ האוטומטית כדי לקבוע את הרקע של מולקולות בודדות הקשורות לכל נקודת נוגדן לפני טעינת התאים. כדי להעמיס את הטיפות הניתנות להתייחסות בתאים, השעינו את התאים בתמיסה של נוגדן זיהוי של 0.125 מיקרוגרם למיליליטר במדיה L-15 עם 10 אחוז FDS.

סנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים בפסיעה של 40 מיקרון כדי להבטיח מתלה של תא יחיד. טען את התאים הבודדים לטיפות הניתנות להתייחסות ממאגר התא באמצעות המיקרומניפולטור והמיקרו-נימי. התבוננות דרך מטרה פי 10, השתמש במיקרו-מזרק כדי לשאוב תא בודד לתוך המיקרו-נימי ממאגר התא.

עבודה ידנית עם ג'ויסטיק, מזיגה אוטומטית באמצעות תכונת הפליטה של שלב מניפולטור אלקטרוני. דחה את המיקרופיפטה על ידי תרגומו כלפי מעלה כדי לנקות את גובה המילימטר של השבב. הגדר את קואורדינטות הבמה לזו של טיפה הניתנת להתייחסות באמצעות תוכנת בקרת המיקרוסקופ האוטומטית.

הזרקו את המיקרופיפטה על ידי החזרתה למצב Z המאוחסן. בצע זאת באופן ידני עם הג'ויסטיק או באופן אוטומטי אם אתה משתמש במניפולטור אלקטרוניtage. התהליכים המכניים הנובעים מליזה הנגרמת על ידי לייזר יכולים ליצור תחליב בקצה הטיפות שאנרגיות פולסים גבוהות יותר יכולות לשבש לחלוטין את הטיפות.

ודא שאנרגיות דופק הליזה התקינות נשמרות למינימום ותאים אינם מופקדים בקצה המיידי של הטיפות. הוצא את התאים בטיפה הניתנת להתייחסות באמצעות המיקרו-מזרק. דמיין את התאים בטיפות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, כולל כל הדמיה פלואורסצנטית.

כמו כן, צלם את כל הנקודות במערך באמצעות מיקרוסקופ TIRF של מולקולה אחת. התמקד בתא ב- droplet הניתן לכתובת. השג ליזה אופטית מלאה על ידי מיקוד פולס לייזר יחיד של 6 ננו-שניות קרוב למיקום התא.

שים לב לזמן שבו כל תא עובר ליזה. רכוש תמונות של מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ TIRF של כל הכתמים כל עשר דקות במשך 30 הדקות הראשונות, ולאחר מכן כל 20 דקות למשך 60 דקות נוספות. אם אתה מעוניין רק בכמות החלבון הקשור בשיווי משקל, דמיין את כל הכתמים לאחר דגירה של השבב למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי לבצע ספירת מולקולה בודדת עבור כל נקודת נוגדנים שאינה גודשת, טען את תמונת הרקע שנרכשה לפני הליזה. בפיג'י, בחר את תמונת הרקע. בתפריט התמונה, בחר שכפל כדי לשכפל את הרקע.

לאחר מכן בחר את התמונה הכפולה ותחת הכרטיסייה מסנני תהליך בחר טשטוש גאוס וציין רדיוס של 50 פיקסלים. נווט אל עיבוד ובחר מחשבון תמונות. שם ציין את חלוקת הפעולה, התמונות הנדרשות, ואז בחר את התיבות ליצור חלון חדש ותוצאה של 32 סיביות.

הפחיתו כל פיקסל בתמונה בפיקסל אחד. לאחר מכן בחרו אזור בגודל 50 פיקסלים על 50 פיקסלים בכל אחת מארבע הפינות בתמונת הרקע השטוחה. מדוד את סטיית התקן של עוצמת הפיקסלים על-ידי בחירה באפשרות ניתוח ומדידה.

תחת התאמת תמונה, בחר סף והגדר את רמת הסף התחתונה לשלוש סטיות תקן. בתמונה המפולחת, מסיכת SM קבעה את ערכי עוצמת הפיקסלים לאפס עבור אובייקטים שאינם בגודל של ארבעה עד תשעה פיקסלים מרובעים ומעגליות של 0.5 עד 1. לשם כך, בחר ניתוח ואחריו ניתוח חלקיקים וציין את הגודל והמעגליות.

עבור אותן נקודות נוגדנים, טען וחזור על שלבי ניתוח הנתונים עבור כל מסגרות התמונה שצולמו כסדרת תוצאות זמן שנרכשה לאחר ליזה. בתוצאות מייצגות של תמונות של מולקולה בודדת, האות בתמונות הרקע מראה את הרמה הנמוכה יותר של קשירה לא ספציפית של נוגדן הזיהוי המסומן פלואורסצנטי לפני השטח ולנקודת הנוגדנים. התמונה המוגדלת מציגה מולקולות בודדות מודגשות עם חיצים אדומים.

מוצגת גם תמונה טיפוסית של משיכה של p53 בתאי קרצינומה של המעי הגס האנושי BE. רצף תמונות זה מראה הצטברות של חלבון p53 על נקודת הנוגדנים. עקומת כיול המתקבלת באמצעות ריכוזים ידועים של החלבון המשולב משמשת להמרת ספירת מולקולות בודדות בכל נקודה למספר חלבוני המטרה בנפח הניתוח ומרמזת על מספר עותק של תא בודד.

הקו האופקי המקווקו באדום מציין את רמת הכריכה הלא ספציפית. ביטוי החלבון הבסיסי p53 בתאי סרטן BE מראה התפלגות דמוית גמא ארוכת זנב שבה ביטוי חלבון p53 בתאים מסוימים גבוה משמעותית מהערך המודאלי. כאן, ביטוי חלבון p53 משורטט כפונקציה של נפח התא כפי שמחושב מקוטר התא הנמדד לפני הליזיס.

התוצאות מצביעות על כך שריכוז מינימלי של חלבון p53 נשמר בתאים אלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד למדוד את השפע של חלבון מטרה ברזולוציה של תא בודד. בזמן העבודה עם תאים ביולוגיים, חשוב לזכור שהחלבונים יכולים להתפרק.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי, וניתן לשלב אותה בפרוטוקולים המנתחים דגימות ראשוניות של מטופלים. טכניקות של תא בודד יכולות לעזור לספק תובנה לגבי התפקוד וההתנהגות של התא, כמו גם לזהות אירועים נדירים שאחרת היו מתפספסים על ידי שתי השיטות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הביולוגיה של קווי תאי p53 וסרטן השד, ניתן ליישם אותה גם במחקרים אחרים של מחלות ללא צורך בתיוג, מה שמועיל בחקר תאים ראשוניים מדגימות חולים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR נקודות קוונטיות כדי לענות על שאלות נוספות כגון קביעה אם יש מתאם בין RNA יעד לביטוי חלבון. מדידת מספר העותק המוחלט של חלבון תהיה אטרקטיבית לביומתמטיקאים ומדענים חישוביים בתמיכה במודלים הביולוגיים שלהם.