Name: ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: למדו לכמת חלבונים בתאים יחידים באמצעות מערכי טיפות מיקרו-מיעון. השיטה מאפשרת ניתוח רגיש של שונות בביטוי חלבונים כמו p53 בקווי תאי סרטן אנושיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ASR תוכנן ניסויים, פיתח פרוטוקולים, ניתחו נתונים. SC ו PS ביצע ניסויים גודל התא. ASR ו OC כתב היד. המחברים מאחלים לאשר בתודה את התמיכה של פרופסור דוד ר קלוג למתן גישה לציוד. המחברים רוצים להודות את אימפריאל קולג מתקדם Hackspace לגישה פבריקציה נוספת ומתקני טיפוס.

<ol><li>Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single+cell+and+single+molecule+proteomics+for+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).</li>
<li>Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+tools+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis tools for drug discovery and development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+step+towards+practical+single+cell+proteomics%3A+a+microfluidic+antibody+capture+chip+with+TIRF+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection.</a> Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressable+droplet+microarrays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis.</a> Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).</li>
<li>Ramji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+kinase+signaling+assay+using+pinched+flow+coupled+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics.</a> Biomicrofluidics. 8 (3), 34104(2014).</li>
<li>He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+encapsulation+of+single+cells+and+subcellular+organelles+into+picoliter-+and+femtoliter-volume+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets.</a> Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).</li>
<li>Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+TIRF+microscopy+to+quantify+and+confirm+efficient+mass+transfer+at+the+substrate+surface+of+the+chemistrode%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode.</a> New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+picoliter+droplet+array+for+parallel+real-time+polymerase+chain+reaction+based+on+double-inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing.</a> Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).</li>
<li>Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floating+droplet+array%3A+An+ultrahigh-throughput+device+for+droplet+trapping%2C+real-time+analysis+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery.</a> Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).</li>
<li>Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Karthikeyan_Narayanan2/publication/257690809_Elucidating_drug_resistance_properties_in_scarce_cancer_stem_cells_using_droplet_microarray/links/554ac2700cf29752ee7c3360.pdf">Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray.</a> Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).</li>
<li>Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlelanding/2016/ra/c6ra06011k">Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings.</a> RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+nanoinjection+for+high-thoughput+chemiluminescence+immunoassay+on+multicapillary+glass+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate.</a> Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).</li>
<li>Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+protein+crystallization+and+screening+with+a+microfluidic+droplet+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot.</a> Sci. Rep. 4, 5046(2014).</li>
<li>Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-in-oil+array+for+picoliter-scale+analysis+based+on+sequential+inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing.</a> Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).</li>
<li>Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22One+cell-one+well%22%3A+A+new+approach+to+inkjet+printing+single+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">"One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays.</a> ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).</li>
<li>Yusof, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-like+printing+of+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+a+Chip+-+Miniaturisation+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inkjet-like printing of single-cells.</a> Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).</li>
<li>Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+2-dimentional+droplet+array+for+single-cell+reverse+transcription+quantitative+PCR+assay+with+a+microfluidic+robot%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot.</a> Sci. Rep. 5, 9551(2015).</li>
<li>Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23114283">Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications.</a> Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).</li>
<li>Kozak, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-volume+wall-less+immunoassays+using+patterned+planar+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates.</a> Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).</li>
<li>Yen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Pico-Liter+Droplet+Microarray+for+Ultrasensitive+Nucleic+Acid+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification.</a> ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).</li>
<li>Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2072-666X/2/2/179/htm">Microvalves and Micropumps for BioMEMS.</a> Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).</li>
<li>Lai, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+use+of+laser-based+lysis+for+cell+analysis+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).</li>
<li>Salehi-Reyhani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+advantages+and+constraints+in+miniaturized+capture+assays+for+single+cell+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis.</a> Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).</li>
<li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+single-cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Current techniques for single-cell lysis.</a> J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).</li>
<li>Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+effects+on+enzyme+activity+and+solubilization+of+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes.</a> BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).</li>
<li>Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/microfluidic-single-mammalian-cell-lysis-in-picolitre-droplets-2155-6210.S12-001.php?aid=14625">Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets.</a> J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).</li>
<li>Burgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+protein+copy+number+using+a+single-molecule-sensitive+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray.</a> Analyst. 139 (13), 3235(2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מיקרו-מערכים Droplet למיעון הם שיטה רגישה וניתן להרחבה לקביעת באופן כמותי את המספר המוחלט עותק של חלבונים בתוך תא בודד.
הגבלת הרמה של איגוד שאינם ספציפיים (נאצית) חיוני בתוך הפרוטוקול להשגת כמו נמוך מגבלה של זיהוי ככל האפשר. חלבונים ו מינים אחרים הביוכימי הלא ספציפית עלול להיקשר אל מספר רב של ממשקים מתנה בתוך טיפות – פני השטח coverslip, הנוגדן ספוט וממשק בשמן/מים. חלבונים יכולים לאבד על-ידי חלוקה למחיצות של הממשק או השמן עצמו. אנחנו הראו כי 4% BSA נוכח ה-droplet מימית הוא מסוגל להגביל נאצית של...

המטרה של שיטה זו היא לקבוע את הווריאציה בשפע של חלבון המטרה באוכלוסיה תא ברזולוציה של תא בודד. ניתוח תא בודד מספק מספר יתרונות שאינם זמינים עם שיטות ביוכימיות הרכב המסורתי. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . ראשית, עבודה ברמה תא בודד יכול ללכוד את הטרוגניות עשיר של אוכלוסיית תאים אחרת אהיה אבודה על ידי חישוב ממוצע המתרחשת עם טכניקות הביוכימי הרכב המסורתי. רוב שיטות ביוכימיות סוס עבודה לעבוד עם הנפח, המחייב, כמו שעושים בדרך כלל, מיליוני תאים כדי לקבל תוצאה. כמובן, ההשלכות של הערכת אוכלוסיות התא כולו תלוי במספר גורמים, לדוגמה, את הטרוגניות בביטוי חלבונים בו כמה תכונות חשובות של ההתפלגות של חלבון שפע עשויים לפספס. מנקודת מבט מעשית, הרגישות הדרושה של תא בודד טכניקות להפוך אותם מסוגלים לעבוד עם כמויות של חומר ביולוגי אינו מספיק אפילו טכניקות בכמות גדולה יותר רגיש לתפקד. דוגמה מפתח היא המחקר של סוגי תאים נדירים כגון מחזורי תאים סרטניים (CTCs) שבו גם עבור חולים עם השקפה prognostic מסכן פחות מ 10 CTCs עשוי להיות נוכח דם בודדת 7.5 mL לצייר. 6 . נציג המתודולוגיה הדרושים לביצוע מדידות חלבון תא בודד באמצעות אמצעי אחסון מופחת נוגדן מבוססי assay העסקת טיפות שמן הכתיר מודפס על microarray נוגדן.
Microfluidic droplet פלטפורמות הם תפוקה גבוהה, מסוגל לייצר אלפי טיפות לכל השנייה, יכולת אנליטית, אפילו culturing, תאים בודדים טיפות בודדות כדי לבצע מגוון רחב של מבחני הביוכימי. טכניקות מבוססות droplet מתאימים היטב לניתוח תא בודד,7,8,,9 , עם דוגמאות הבולטים האחרונים כולל DropSeq10 ו- inDrop11, אשר יש בגילויים באופן משמעותי בכוח טכניקות הגברה. את כמות מוגבלת של חומר ושיטות אין של הגברה חלבונים להפוך לתא בודד פרוטאומיקס מאתגר במיוחד.
טיפות עשוי להיות מנותח על ידי מספר שיטות, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות כבר בשימוש נרחב. מולקולה בודדת טכניקות כגון מיקרוסקופ גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF) מאפשר מולקולות פלורסנט, ניתן לאבחן עם יחס אות לרעש ללא תחרות. 12 עקב דעיכה מעריכית השדה evanescent, רק fluorophores בסמיכות גבוהה על פני השטח (סדר 100nm) נרגשים ביצוע TIRF אסטרטגיה טובה מזהה כמויות קטנות של מולקולה היעד תערובת מורכבת. החוזק הפנימי אופטים אופטי של TIRF גם מסייעת להימנע שטיפת מדרגות, וזמינותו מגבלות הזמן והמורכבות. עם זאת, TIRF דורש משטחים מישוריים, דוגמאות של מיקרוסקופ TIRF חלה על טיפות בזרימת לערב היווצרות של משטח מישורי אשר לתמונה. 13 למטרה זו, תא בודד פרוטיאומיה מבנית טכניקות לעיתים קרובות עיצוב microfluidic צ'יפס סביב סוכני השטח. מרותק למיטה לכידה בפורמט microarray. 4 , 14
טיפות, עצמם, עשוי להיווצר מערכים על משטחים מישוריים, מיקרו-מערכים droplet כביכול. 15 , 16 , 17 במרחב ארגון טיפות לתוך מערכי מאפשר להם להיות נוח ליצור אינדקס, בקלות במעקב לאורך זמן, באופן אינדיבידואלי התייחס ולאחזר, במידת הצורך. מיקרו-מערכים droplet ניתן להשיג צפיפות גבוהה של מיקרו-כורים עם אלפי רכיבים לכל שבב שעמד חופשי או נתמך על-ידי microwell מבנים. 18 , 19 , 20 . הם עשויים להיווצר על ידי התצהיר רציפים ע י טיפול בנוזלים רובוטים, הזרקת דיו יבחינו פנה microarrayers21,22,23,24,25, 26 , או שהם יכולים להרכיב עצמית על משטחים כגון superhydrophillic כתמים בדוגמת על משטח superhydrophobic. 27 , 28 , 29
עם שיקולים אלה בחשבון, Droplet למיעון מיקרו-מערכים (עיוותים) תוכננו כדי לשלב את צדדיות, מיעון המרחבי ואמצעי אחסון מופחת של מיקרו-מערכים droplet עם הרגישות של מולקולה בודדת מיקרוסקופ TIRF כדי באופן כמותי למדוד חלבון שפע. 5 ארכיון דיגיטלי מאפשרים ניתוח תא בודד ויוצרים microarray droplet המכיל תאים בודדים מעל microarray נוגדנים, אשר הוא אז הכתיר בשמן כדי למנוע אידוי. נפחי טיפות הם נפרדים כדי למנוע הפסד דגימה אחרת תושג ע י על שבב valving ב מיקרופלואידיקה זרימה רציפה. 30 כמות חלבון המטרה של תא בודד המוחלט הוא קטן מאוד; עם זאת, נפח מופחת טיפות מאפשר ריכוז מקומי גבוה יחסית כדי בכך שהם מזוהים באמצעות assay נוגדן של כריך - נוגדן הוא משותק באזור ברורים, או נקודה, על משטח אשר לוכדת חלבון אשר בתורו מאגד כדי fluorescently עם תוויות ברורות זיהוי נוגדנים נוכח האחסון droplet. כמו ללא תווית בגישה (כלומר חלבון מטרות לא צריך להיות מתויג ישירות), ארכיון דיגיטלי הם חלים באופן כללי על ניתוח תאים ממקורות ראשוניים, כגון דם מעובד, בסדר צריך aspirates הפומבית הגידול ביופסיות, כמו גם תאים מתרבות, lysates שלהם.
מדידת וריאציית בשפע חלבון לרוחב אוכלוסיה תא חשוב בקביעת את הטרוגניות בתגובה, לדוגמה, את הסם, יסייעו במתן תובנה תאיים מסלולים, הערכת subpopulations שלהם התנהגות כמו גם לזהות אירועים נדירים אחרת להיות רעולי פנים על ידי שיטות בצובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפיק ולהשתמש מיקרו-מערכים למיעון droplet כדי לקבוע באופן כמותי של השפע p53 פקטור שעתוק בתאים סרטניים אנושיים, עשוי לשמש כדי לחקור את התפקיד של p53 בתגובה תרופות כימותרפיות. חלבון המטרה נקבעת על-ידי הבחירה של נוגדנים לכידת וזיהוי, עשוי להיות שונה כדי לכלול יעדים שונים או יותר. ההוראות מסופקות כדי לבנות מנגנון פשוט שילוב זרבובית קונצנטריים מ ציוד מעבדה כללי כדי באופן ידני מערך 10 טיפות nL כתרים עם שמן. התהליך הניסויי מלא מתואר לפיה לכל droplet ואז נטען עם תא בודד, אשר לאחר מכן lysed, הביטוי של חלבונים נקבע עם רזולוציה מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

<table><tbody><tr><td><חזק>תרבית תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM סרום בקר עוברי</td> גבוה <td>סיגמא</td><td>D6429</td><td></td></tr> (<tr><td>FBS)</td><td>צלוחיות</td> תרבית תאים של Biochrom <td>S0115</td><td></td></tr><tr><td></td><td>קורנינג</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, בריטניה</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Micro Micro Finin ArrayIt, ארה"ב</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים (Nexterion)</td><td>שוט, אירופה</td><td>1098523</td><td>גודל (מ"מ): 65.0 x 25.0; עובי (מ"מ) 0.17</td></tr><tr><td>p53 נוגדן ללכידה</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53 נוגדן לזיהוי, Alexa Fluor 488 שכותרתו</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>ריכוז מלאי 200&mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מאגר מלוח-נתרן ציטראט</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>בטאין</td><td>סיגמא</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>סיגמא</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>צלחת באר 384 (נפח נמוך)</td> <td>סיגמא</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>צילינדר גז חנקן</td><td>BOC</td><td>כיתה תעשייתית, ללא</td><td></td> חמצן</tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>ידני Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Origio, דנמרק</td> משאבות מזרק <td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>KD</td><td>Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; מזרק L</td><td>המילטון</td><td>81020</td><td>אטום לגז, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>המילטון</td><td>81327</td><td>אטום לגז, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>מבודד סיליקון</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>6x4 באר מבודד סיליקון עם דבק</td></tr><tr><td>חותך לייזר</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 לייזר 3W</td><td>לחיתוך לייזר של מבודדים מותאמים אישית</td></tr><tr><td>1 מ"מ עבה גיליון</td> <td>אקריליגיליון דיוק Weatherall-UK</td><td>Clarex 001</td><td>לחיתוך לייזר של מבודדים מותאמים אישית</td></tr><tr><td>גיליון דבק</td><td>3M</td><td></td><td>המשמש להדבקת מבודדים מותאמים אישית לכיסויים מיקרו-מערכים</td></tr> דבק <tr><td>סופר</td><td>Loctite</td><td></td> LOCPFG3T <td></td></tr><tr><td>150 &mu; m ID/360 &mu; m OD צינורות סיליקה התמזגו</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1.0 מ"מ ID/1/16 אינץ' צינורות OD PFA</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014 אינץ' ID/0.062" OD PTFE צינורות</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1.0 מ"מ ID/2.0 מ"מ OD צינורות FEP</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד</td><td>Millipore, גרמניה</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td> חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>מיקרוסקופיה & מיקרוסקופ אופטיקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF עם שלב XY מקודד</td><td>ניקון, יפן</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, אירלנד</td> מקור עירור לייזר <td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vortran, ארה"ב</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>מקור לייזר ליזה אופטית</td><td>Continuum, ארה"ב</td><td>מיקרוסקופ Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td> קוביית מסנן עבור TIRF</td><td>Chroma, ארה"ב</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>קוביית מסנן מיקרוסקופ עבור לייזר ליזה אופטי</td><td>2000, בריטניה</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>תוכנה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות</td><td>בקוד</td><td></td> פתוח <td>של פיג'י</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>גרסה 7.14 ומעלה</td> תוכנת <td>ניתוח תמונות</td></tr></tbody></table>

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם droplet למיעון מיקרו-מערכים

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

לעיתים קרובות הסלולר התנהגות ותגובות הסלולר מנותחים ברמת האוכלוסייה שם התגובות של תאים רבים הם איחדו יחד בתור תוצאה הממוצע מטשטשים את אופן הפעולה של תא בודד עשיר בתוך אוכלוסיה מורכבת. טכנולוגיות זיהוי, כימות של חלבון תא בודד הפכו את השפעה מדהימה בשנים האחרונות. כאן נתאר פלטפורמה ניתוח תא בודד פרקטי ומודולרי המבוסס על מיקרו-מערכים למיעון droplet. מחקר זה מתאר כיצד ניתן למדוד את המספרים העתקה מוחלטת של חלבונים היעד ברזולוציה של תא בודד. P53 משתיק קול גידול הוא גן שעבר מוטציה הנפוצות ב סרטן אנושי, עם יותר מ- 50% של מקרי סרטן הכולל מפגין דפוס ביטוי p53 שאינם בריאים. הפרוטוקול מתאר את השלבים ליצירת 10 טיפות nL שבתוכו תאים סרטניים אנושיים יחיד מבודדים, המספר עותק של החלבון p53 נמדדת ברזולוציה של מולקולה בודדת כדי לקבוע במדויק ההשתנות בביטוי. ניתן להחיל את השיטה לכל סוג התא כולל חומר ראשוני כדי לקבוע את המספר המוחלט עותק של חלבונים היעד בכל עניין.

המספר עותק חלבון הבזליים מוחלטת של p53 נקבע עם רזולוציה תא בודד בקו תא סרטן המעי הגס האנושי, להיות תאים. נדגים כיצד הביטוי p53 יכול המשתנים במספר סדרי גודל ולהראות מתאם חיובי חלש בין תא גודל וחלבון עותק מספר בתוך האוכלוסייה התא להיות מנוחתו.
מיקרו-מערכים Droplet למיעון נוצרות כאשר טיפות מימית הם ויתרו במיקומים ספוט נוגדן, כתרים עם שמן. . כאן, טיפות תומכים וזמינותו חלבון p53 רגיש. Coverslips נערכים עם לכידת נוגדן כתמים באמצעות mi...

כאן אנו מציגים מיקרו droplet למיעון-מערכים (עיוותים), שיטה מערך מבוסס droplet מסוגל לקבוע חלבון מוחלטת שפע תאים בודדים. נדגים את היכולת של ארכיון דיגיטלי כדי לאפיין את הטרוגניות בביטוי של p53 חלבון משתיק קול גידול בקו תאים סרטניים אנושיים.

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לקבוע את מספר העותקים המוחלט של חלבון מטרה ברזולוציה של תא בודד. טכניקות של תא בודד יאפשרו הבנה טובה יותר של התנהגות החלבון כפי שהיא קשורה לדוגמה המרכזית (central dogma) ויסייעו לכמת במדויק את הביטוי הגני המבוקר. עבודה ברמת התא הבודד יכולה ללכוד את ההטרוגניות העשירה של אוכלוסיית התאים, שאלמלא כן הייתה אובדת עקב הממוצע המתרחש בטכניקות ביוכימיות מסורתיות.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יתקלו בקשיים בשל הרגישות של בדיקות תא בודד או בשל כמות חלבון מוגבלת בכל תא. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר רצינו לבצע בדיקת חלבון של תא בודד שניתן יהיה לדגום ממנה בקלות לצורך ניתוחים המשכיים בהמשך התהליך. התחילו את הפרוצדורה ביצירת השבבים ובהדפסת מיקרו-מערכים של נוגדנים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.להכנת המכשיר, הכניסו צינור סיליקה מותכת (fused silica) באורך 100 מילימטר, בעל קוטר פנימי של 150 מיקרון וקוטר חיצוני של 360 מיקרון, לתוך צינור PFA באורך 40 מילימטר, בעל קוטר פנימי של 1 מילימטר וקוטר חיצוני של 1/16 אינץ', עד שייבלט ממנו פי שניים מילימטרים. פעולה זו תיצור את הדיזה הקונצנטרית. מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט (cyanoacrylate) על קצהו של טיפ פיפט של 10 מיקרוליטר והכניסו אותו לתוך קטע צינור ה-PFA באורך 40 מילימטר.במידת הצורך, מקמו מחדש את צינור הסיליקה המותכת כדי לשמור על בליטה של 2 מילימטרים בפתח הדיזה לפני הת굳דות הדבק. הכניסו את הקצה השני של קפילרית הסיליקה המותכת לסוף קטע באורך 200 מילימטרים של צינור PTFE בעל קוטר פנימי של 014 אינץ' וקוטר חיצוני של 062 אינץ'. חברו זאת למזרק Hamilton בנפח 100 מיקרוליטר הממולא באלבומין מסרום בקר בריכוז ארבעה אחוזים בתוך תמיסת סליין עם בופר פוספטי.כעת הכניסו קטע באורך 400-millimeter של צינור FEP בעובי פנימי של 1-millimeter וקוטר חיצוני של 2-millimeter לתוך טיפ של פפית 200-microliter עד להשגת אטימה. מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על טיפ נוסף של פפית 200-microliter, ולאחר מכן דחפו אותו לתוך הטיפ הראשון כדי לקבע את הצינור במקומו. לאחר מכן, חברו את הקצה הפתוח של צינור ה-FEP למזרק Hamilton של 1-milliliter מלא בשמן מינרלי.הכנס את מכלול קצה הפסיטה של הפסיטה בנפח 200 µL לתוך קצה הפסיטה בנפח 10 µL של הדיזה הקונצנטרית. לאחר מכן, מלא מזריק בנפח 100 µL בתמיסת חסימה של 4% PBSA. חבר מחדש את צינור התמיסה המימית ושטוף אותו בתמיסת החסימה.חזרו על הפעולה פעמיים, לסך הכל שלושה שטיפות. לאחר מכן, מלאו מזרק של 100 µL בנוגדן זיהוי בריכוז 0.125 µg/L ב-4% PBSA וחברו מחדש את הצינורית. החליפו את תמיסת החסימה בצינורית על ידי הזרקה של 25 µL מתמיסת נוגדן הזיהוי.שטפו את צינור השמן בשמן מינרלי עד שכל הצינורות והנחיר יתמלאו בשמן. לאחר מכן, מלאו מחדש את המזרק בנפח 1-milliliter בשמן מינרלי וחברו שוב את הצינור. לבסוף, קבעו את מכלול הצינור והנחיר למניפולטור XYZ.כדי ליצור טיפות שניתן להפנות אליהן, קבעו את השבב על במה של המיקרוסקופ. רשמו את קואורדינטות הבמה של המיקרוסקופ עבור כל נקודה במערך באמצעות תוכנת הבקרה האוטומטית של המיקרוסקופ. לאחר מכן, הגדירו את המניפולטור XYZ על במיקרוסקופ.הנח את המזרקים במשאבות מזרקים נפרדות, שכן יהיה צורך להפעיל אותן באופן עצמאי. מקם את הפיה בזווית של 50 עד 60 מעלות. לאחר מכן, הגדר את משאבת המזרקים של התמיסה המימית להזרקת 10 nanoliters בקצב של 100 microliters לדקה, והגדר את משאבת המזרקים של השמן להזרקת 5 microliters בקצב של 100 microliters לדקה.הסע את התמיסה המימית עד להופעת טיפה של נוזל בראש הנחיר. טפח על הטיפה באמצעות ניגוב נקי מאבק כדי להסירה. באמצעות תוכנת הבקרה האוטומטית של המיקרוסקופ, הגדר את קואורדינטות שולחן המיקרוסקופ אל נקודת נוגדן במערך והתמקד על פני השטח של זכוכית הכיסוי.בעת יישור הדיזה, היזהרו לא להסיע את נקודת הנוגדן. גלו זהירות יתרה וודאו כי אתם עוקבים אחר התקרבות קצה קפילרי הזכוכית באמצעות מיקרוסקופ. תוך כדי הקפדה שלא להפריע לנקודה, השתמשו במניפולטור XYZ כדי ליישר את קצה קפילרי הזכוכית של הדיזה הקונצנטרית לצד נקודת הנוגדן.לאחר היישור, יש להניח 10 nanoliters של תמיסה מימית. ללא הזזת הבמות, יש להניח חמישה µL של שמן כדי לכסות את התמיסה המימית. יש להרים באיטיות את הדיספנסר מחוץ לטיפה ולהעביר לבאר הבאה.חזור על שלב זה עבור כל נקודות הנוגדנים במערך. לאחר 30 דקות, דמיין את כל הנקודות במערך באמצעות תוכנת הבקרה של המיקרוסקופ האוטומטי כדי לקבוע את הרקע של מולקולות בודדות הקשורות לכל נקודת נוגדן לפני טעינת התאים. כדי לטעון את טיפות הכתובת בתאים, תלינו את התאים בתמיסה של 0.125 µg/mL נוגדן זיהוי במדיום L-15 עם 10% FDS.סננו את תמיסת התאים דרך מסנן תאים בעלת נקבוביות של 40 מיקרון כדי להבטיח סספנסיה של תאים בודדים. העבירו את התאים הבודדים אל הטפות הניתנות לכתובת ממאגר התאים באמצעות המיקרומניפולטור והמיקרוקפילריה. תחת תצפית בעזרת עדשה פי 10, השתמשו במיקרואינג'קטור כדי לשאוב תא בודד אל המיקרוקפילריה מתוך מאגר התאים.בעבודה ידנית באמצעות ג'ויסטיק, שפכו את הנוזל באופן אוטומטי באמצעות תכונת ההזרקה של במה אלקטרונית ממניפולטורית. הסירו את המיקרופיפטה על ידי העברתה כלפי מעלה כדי לעבור את גובה השבב העומד על 1-millimeter. הגדירו את קואורדינטות הבמה לאלו של טיפה הניתנת לכתובת באמצעות תוכנת הבקרה האוטומטית של המיקרוסקופ.החדירו את המיקרופיפט על ידי החזרתו למיקום Z השמור. בצעו זאת ידנית באמצעות הג'ויסטיק או באופן אוטומטי במידה ונעשה שימוש בבמה של מניפולטור אלקטרוני. התהליכים המכניים כתוצאה מליזיס המושרה בלייזר עלולים ליצור אמולסיה בקצה הטיפה, כאשר אנרגיות פולס גבוהות יותר עלולות להביא לפירוק מלא של הטיפות.יש לוודא שמרגש אנרגיות דופק התאימות (lysis pulse) נשמר ברמה מינימלית, ושהתאים אינם מופקדים בקצה המיידי של הטיפות. יש להחדיר את התאים לטיפה הניתנת לכתובת באמצעות המיקרו-מזרק. בצע הדמיה של התאים בטיפות באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר, כולל כל הדמיית פלואורסצנציה.בנוסף, דמיינו את כל הנקודות במערך באמצעות מיקרוסקופיית TIRF של מולקולה בודדת. התמקדו בתא הנמצא בטיפה הניתנת לכתובת. הגשילו ליזיס אופטי מלא על ידי מיקוד פולס לייזר בודד של 6 ננו-שניות בקרבת מיקומו של התא.יש לרשום את הזמן שבו בוצע ליסיס לכל תא. רכשו תמונות של מולקולות בודדות באמצעות מיקרוסקופיית TIRF של כל הנקודות מדי עשר דקות במהלך 30 הדקות הראשונות, ולאחר מכן מדי 20 דקות למשך 60 דקות נוספות. אם העניין הוא רק בכמות החלבון הקשור במצב שיווי משקל, צלמו את כל הנקודות לאחר דגירה של השבב למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.כדי לבצע ספירת מולקולות בודדות עבור כל נקודת נוגדן שאינה צפופה, טענו את תמונת הרקע שצולמה לפני הליזיס. בתוכנת Fiji, בחרו את תמונת הרקע. תחת תפריט image, בחרו ב-duplicate כדי לשכפל את הרקע.לאחר מכן בחרו את התמונה המשוכפלת ותחת לשונית מסנני העיבוד (process filters) בחרו בטשטוש גאוסיאני (Gaussian blur) והגדירו רדיוס של 50 פיקסלים. עברו לתפריט עיבוד (process) ובחרו במחשבון תמונות (image calculator). שם הגדירו את הפעולה כחילוק (divide), בחרו את התמונות הדרושות, ולאחר מכן סמנו את תיבות "צור חלון חדש" (create new window) ו"תוצאה של 32 סיביות" (32-bit result).חסרו 1 מכל פיקסל בתמונה. לאחר מכן, בחרו שטח של 50 פיקסלים על 50 פיקסלים באחת מארבע הפינות בתמונת הרקע (background flat). מדדו את סטיית התקן של עוצמת הפיקסלים על ידי בחירה ב-analyze and measure.תחת image adjust, בחרו ב-threshold והגדירו את רמת הסף התחתונה (lower threshold) לשלוש סטיות תקן. בתמונת הסגמנטציה SM mask, הגדירו את ערכי עוצמת הפיקסלים לאפס עבור כל העצמים שגודלם אינו בין ארבע לתשעה פיקסלים רבועים והמעגליות (circularity) שלהם אינה בין 0.5 ל-1. לשם כך, בחרו ב-analyze ולאחר מכן ב-analyze particles והגדירו את הגודל והמעגליות.עבור אותן נקודות נוגדן, טענו וחזרו על שלבי ניתוח הנתונים עבור כל פרימי התמונה שנסרו כסדרת תוצאות זמניות שנרכשו לאחר ליזיס. בתוצאות מייצגות של תמונות מולקולה בודדת, האות בתמונות הרקע מראה רמה נמוכה של קישור לא ספציפי של הנוגדן הזיהוי המסומן פלואורסצנטית לפני השטח ולנקודת הנוגדן. תמונת ההגדלה בתוך התמונה מראה מולקולות בודדות מודגשות באמצעות חצים אדומים.מוצגת גם תמונה טיפוסית של pulldown של p53 בתאי קרצינומה של מעי הגדול אנושי מסוג BE. רצף תמונות זה מראה הצטברות של חלבון p53 בנקודת הנוגדן. עקומת כיול שהתקבלה באמצעות ריכוזים ידועים של החלבון הרקומביננטי משמשת להמרת ספירות של מולקולה בודדת בכל נקודה למספר חלבוני המטרה בנפח הניתוח, ומרמזת על מספר העותקים בתא בודד.הקו האדום המקווקו האופקי מציין את רמת הקישור הבלתי ספציפי. ביטוי חלבון p53 הבזאלי בתאי סרטן BE מראה התפלגות דמוית גמא עם זנב ארוך, שבה ביטוי חלבון p53 בחלק מהתאים גבוה משמעותית מהערך השכיח. כאן, ביטוי חלבון p53 מוצג כפונקציה של נפח התא, כפי שחושב מקוטר התא שנמדד לפני הליזיס.התוצאות מעידות כי בתאים אלו נשמר ריכוז מינימלי של חלבון p53. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן למדוד את השפע של חלבון מטרה ברזולוציה של תא בודד. בעת עבודה עם תאים ביולוגיים, חשוב לזכור כי חלבונים עלולים לעבור דגרדציה.לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשלימה תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי, וניתן לשלבה בפרוטוקולים המנתחים דגימות ראשוניות מחולים. טכניקות של תא בודד יכולות לסייע בהספקת תובנות לגבי התפקוד וההתנהגות התאית, וכן בזיהוי אירועים נדירים שאלמלא כן היו מתפספסים על ידי שתי השיטות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הביולוגיה של p53 ושל שורות תאי סרטן השד, ניתן להחילה גם על מחקרים אחרים של מחלות ללא צורך בסימון, דבר המועיל במחקר של תאים ראשוניים מדגימות של חולים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון quantum dot PCR כדי לענות על שאלות נוספות, כגון קביעה האם קיים מתאם בין ביטוי ה-RNA למבנה החלבוני של המטרה. מדידה של מספר העותקים המוחלט של חלבון תהיה בעלת ערך עבור ביו-מתמטיקאים ומדעני חישוב לצורך תמיכה במודלים הביולוגיים שלהם.

counting-proteins-in-single-cells-with-addressable-droplet-microarrays

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

אנו מתארים בדיקה דיגיטלית של נקודת קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאה פשוטה (אנלוגית). אנו מודדים פלואורסצנטיות בתפזורת של בדיקות דיגיטליות מבוססות טיפות באמצעות מכונת qPCR סטנדרטית במקום מכשור מיוחד ומאשרים את התוצאות שלנו במיקרוסקופיה.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של בקנה מידה גדול, מערך ה- DNA או נוגדן דו ממדים מרובב, עם יישומים פוטנציאליים במחקרי איתות תא וזיהוי סמנים ביולוגיים.

ייצור מודרך זרימת דפוס בצפיפות גבוהה ברקוד נוגדן Microarray

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

נדגים טכנולוגיה שבב snap לביצוע כריך מרובבת cross-reactivity ללא immunoassays על ידי הצמדת פשוט שתי שקופיות. מנגנון הצמדה משמש באופן אמין מבנק ריאגנטים microarray-כדי-microarray. השבב הצמד יכול לשמש עבור כל התגובות הביוכימי הדורש colocalization של ריאגנטים שונים ללא זיהום צולב.

הצמד הצ'יפ בשביל כריך מרובבת Cross-reactivity חופשי ונטול שהמשגיח Immunoassays

פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללי, בקרת איכות בודק הדרושים להכנת בריאים למבוגרים תאים בודדים בתרבית של תפוקה גבוהה, מבוסס-droplet תא בודד RNA-Seq ההכנות. קביעת רצף פרמטרים, יישור קריאה וניתוח bioinformatic תא בודד במורד הזרם הינם גם מסופקים.

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון במדגם חלבונים מורכבים ברמת מולקולה בודדת.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא להכין מעל 1,000,000 הורה, אחיד, יציב, ותואם ביולוגי טיפות של ליטר על 1 ס מ2 מצע מישורי שניתן להשתמש בו עבור סינתזה של חלבון תא ללא.

מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי מוחלט (mt)DNA ורמות הטרופלזמה של מחיקת mtDNA בתאים בודדים.

מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז

שיטה זו מכמתת את השפע המיקרוביאלי באמצעות תבנית צלחת של 96 בארות ליחידות יוצרות מושבות לוחות (CFUs) ומיושמת על המיקרוביום Drosophila בדגימות הומוגניות של זבובים שלמים. יחידות CFU נספרות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות אוטומטית המסופקת כאן.

ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בתבנית צלחת 96 בארות המיושמת על מיקרוביום הדרוזופילה

למדו לכמת חלבונים בתאים יחידים באמצעות מערכי טיפות מיקרו-מיעון. השיטה מאפשרת ניתוח רגיש של שונות בביטוי חלבונים כמו p53 בקווי תאי סרטן אנושיים.

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

גלה סרטונים נוספים