Name: דור ותחזוקה לטווח ארוך של עצבים ללא הידרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: למדו שיטה משופצת לגידול והחזקה לטווח ארוך של הידרה חסרת עצבים באמצעות האכלה כפויה ושחרור ידני. טכניקה זו מאפשרת חקר תפקידי העצבים בהתנהגות ובתהליכים ביולוגיים ב-Hydra vulgaris.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד&quot;ר דיק קמפבל (UC Irvine) לדיונים על הפרוטוקול המקורי להפקת ושמירה על בעלי חיים ללא עצבים, גב &#39;רוי וואנג על עזרה בהתאמת טכניקת המזרק והמחט, וגברת דניאלה הגסטרום וד&quot;ר רוב סטיל (UC Irvine) להערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי RCSA ו- NSF מענק CMMI-1463572.

<ol><li>Bode, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interstitial+cell+lineage+of+Hydra%3A+a+stem+cell+system+that+arose+early+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution.</a> J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).</li>
<li>Hager, G., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+differentiated+nerve+cells+in+hydra+is+determined+by+precursor+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration.</a> Development. 124, 569-576 (1997).</li>
<li>Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+Hydra+interstitial+and+nerve+cells+by+means+of+colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine.</a> J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).</li>
<li>Marcum, B. A., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Hydra+lacking+nerve+and+interstitial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells.</a> J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).</li>
<li>Burns, R. G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/001448277390517X">3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms.</a> Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).</li>
<li>Lee, H. -T., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1541055?seq=1#page_scan_tab_contents">Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells).</a> Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).</li>
<li>Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNovak%2C+P+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).</li>
<li>Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230091645_Effect_of_hydrostatic_pressure_on_morphogenesis_in_nerve-free_hydra">Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra.</a> J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).</li>
<li>Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+cell+differentiation+in+nerve-free+tissue+of+epithelial+Hydra+from+precursor+cells+introduced+by+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting.</a> Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).</li>
<li>Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+regeneration+in+wild-type+hydra+requires+de+novo+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis.</a> Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).</li>
<li>Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+neurogenesis+in+Hydra+leads+to+compensatory+regulation+of+neurogenic+and+neurotransmission+genes+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).</li>
<li>Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/958390">Excitability of nerve-free Hydra.</a> Nature. 262, 388-390 (1976).</li>
<li>Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innexin+gap+junctions+in+nerve+cells+coordinate+spontaneous+contractile+behavior+in+Hydra+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps.</a> Sci. Rep. 4 (3573), (2014).</li>
<li>Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarcum%2C+BA+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).</li>
<li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+method+for+maceration+of+Hydra+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux+Arch.+Entwickl.+Mech.+Org%22%5BJournal%5D)">A quantitative method for maceration of Hydra tissue.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).</li>
<li>Gröger, H., Schmid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+development+in+Cnidaria%3A+A+connection+to+Bilateria%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria.</a> Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).</li>
<li>Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).</li>
<li>Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cnox-2%2C+a+HOM%2FHOX+homeobox+gene+in+hydra%2C+is+correlated+with+axial+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation.</a> Development. 117, 657-667 (1993).</li>
<li>Böttger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Gene+Transfer+Contributed+to+the+Evolution+of+Extracellular+Surface+Structures%3A+The+Freshwater+Polyp+Hydra+Is+Covered+by+a+Complex+Fibrous+Cuticle+Containing+Glycosaminoglycans+and+Proteins+of+the+PPOD+and+SWT+%28Sweet+Tooth%29+Families%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families.</a> PLoS One. 7 (12), (2012).</li>
<li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

הידרה interstitial תאים ניתן לבטל דרך טיפול קולצ&#39;יצין פעמיים 3 , 4 . בימים שלאחר הטיפול הראשון, זה קריטי כדי למנוע מגע בין הידרה בודדים כדי למנוע היתוך של חלקים הידרה לתוך הידרה מעוות. כמו כן, בעלי חיים אשר יכולים לאכול ללא סיוע לאחר הטיפול הראשון יש להסיר כמו טיפול colchicine השני לא יכול להיות מספיק כדי לחסל את התאים interstitial הנותרים מבעלי חיים כאלה. כדי למקסם את שיעור ההישרדות...

מערכת העצבים של הידרה מורכבת של רשת עצבים, עם נוירונים הקשורים בשתי שכבות רקמה אפיתל 1 . רשת העצבים צפופה יותר בהיפוסטומה ובמחזור הדם ופחות צפופה בעמודה השנייה של הגוף. תאי העצבים מקורם בתאי גזע אינטרסטיציאליים, שהם תאי גזע רב-תכליתיים המביאים לתאים מפרידים, נמטוציטים, תאי נבט, ונוירונים. ניתן לחסל את התאים interstitial של הידרה vulgaris באמצעות טיפול עם colchicine 3 , 4 , נגזרות צמח נגזר כי הורג תאים מחולקים. למרות colchicine נמצא לעכב פילמור microtubule באורגניזמים אחרים, מחקר קודם הוכיח כי microtubules נוכחים בהידרה לאורך כל הטיפול, מה שמרמז כי קולכיצין לא מתנהג כך הידרה 3 . רחוב נוסףAudy מציע כי colchicine אינו נקשר ביעילות toulinin בכמה אורגניזמים, כולל Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas, ו Schizosaccharomyces pombe, אשר עשוי להסביר את ההבדל 5 . הטיפול קולצ&#39;יצין גורם phagocytosis של תאים interstitial על ידי תאים אפיתלתיים endodermal 3 ובכך מאפשר את היצירה של בעלי חיים שחסרים תאים עצביים, תאי בלוטת, ו nematocytes. לא ברור מדוע התאים interstitial רגישים במיוחד לטיפול קולכיצין. בהתחשב בכך שתאי ביניים של פוסט-מיטוטי ותאי גזע של תאי גזע פגומים ופגוסיטוסים, קמפבל סיכם כי קולצ&#39;יצין לא משפיע ישירות על פעילות מיטוטית. יש לציין כי הטיפול בקולכיצין פועל היטב בהידרה וולגריס, אך הוכח כי אינו פועל גם במינים אחרים, כגון הידרה אוליגקטוס 6 . </Em&gt; טיפול שונה עם colchicine ו hydroxyurea ניתן להשתמש כדי לייצר עצבים ללא הידרה viridis 7 . ללא עצב הידרה (המכונה גם לעתים קרובות &quot; הידרה אפיתל&quot; 8 ) ולכן הם כלי שימושי ללמוד את התפקידים של סוגי תאים מיוחדים אלה מן השושלת תא interstitial בהומיאוסטזיס רקמות התחדשות. הידרה עשויה להיות הדוגמה המוכרת היחידה של בעל חיים המסוגל לחיות ללא מערכת העצבים. העצבים ללא הידרה משמשים מודל שימושי במיוחד עבור לנתח את התפקיד של רשת העצבים בוויסות התחדשות הידרה , הומאוסטזיס, והתנהגות. לדוגמה, המבוא של תאים interstitial לתוך הידרה ללא עצב באמצעות השתלת מותר אפיון של התמיינות תאים עצביים כמו אזור ספציפי במיוחד 9 . יתר על כן, כי הידרה ללא עצב יכול להתחדש, הםלאפשר את החקירה של אלטרנטיבי, העצבים מערכת עצמאית התחדשות מסלולים. דוגמה אחת כזו היא neurogenesis apical ו היווצרות הראש, אשר הוכח להיות תלוי פונקציה cnox-2 במערכת העצבים wildtype הידרה , אבל נראה להיות ניתנת להסרה ב הידרה ללא עצבים, דבר המצביע על כך עשוי להיות חלופי ראש התחדשות התהליך 10 . העצבים ללא הידרה שימשו גם כדי ללמוד ביטוי תא אפיתל תקנה של גנים neurogenic ו neurotransmission לאחר אובדן neurogenesis 11 . עצבים ללא הידרה אינם מציגים התפרצויות ספונטניות בהתכווצות 12 , מה שמראה כי התפרצויות אלה מוסדרים על ידי מערכת העצבים. העצבים ללא הידרה לעשות, עם זאת, חוזה בתגובה צביטה של ​​עמודה הגוף עם מלקחיים, מה שמרמז כי התכווצות בתגובה לגירויים מכניים מתווכת על ידי צימוד throuצומת פערים בתאים אפיתל, בעוד התנהגות התכווצות ספונטנית מתווכת על ידי צימוד דרך צמתים הפער בתאי עצב 13 . העצבים ללא הידרה לא לפתוח את הפה כאשר הציג עם מזון או מופחת גלוטתיון 3 , דבר המצביע על כך נוירונים חושית נחוצים כדי לזהות את הנוכחות של מזון לאות את הפה לפתוח. בנוסף, נראה כי רשת העצבים ממלאת תפקיד בחישה של לחץ אוסמוטי, מכיוון שחיות ללא עצב אינן מסוגלות לסדר באופן אוטומטי את הלחץ ההידרוסטטי הפנימי שלהן באמצעות פתיחת הפה, דבר הגורם להופעתן של בלון אופייני 3 , 4 ( איור 1 ב &#39; ). תקנה של לחץ הידרוסטטי ב הידרה ללא עצב על ידי דפלציה ידנית תכופים הובילה לאובדן של מורפולוגיה חריגה בעמודה hypostome ואת הגוף. עם זאת, דפלציה כרונית הובילה להפרעה לצמיחה, אלOngation, נבגי, ואת רקמת הארגון 8 . למרות הידרה ללא עצבים אינם מסוגלים להאכיל ו egest על שלהם, אפשר לשמור אותם ללא הגבלה במעבדה על ידי ידני האכלה בכוח ו גיהוק כל בעל חיים. פרסומים קודמים תיארו שיטות של האכלה בכוח ו גיהוק הידרה ללא עצבים, אולם פרוטוקולים אלה מעורבים השימוש עצות micropipette כי חייב להיות מושך יד בזהירות לגודל המתאים, כמו גם שימוש של שפופרת מחובר פיפטה ידי צינורות 14 . הנה, שיטה פשוטה יותר, בטוחה יותר, זמן יעיל יותר של האכלה ו גיהוק מתואר. בנוסף, מחקרים קודמים היו כרוכים בבדיקת היעדר תאי עצב באמצעות ניתוק של בעלי חיים קבועים לתאים בודדים ובדיקת מורפולוגיה של התא 3 , 4 , 15 . חאז, אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן חד שבטי נגד carboxyl- tyrosinated מסוף של אלפא טובולין שימש כשיטה חינם כדי macation כדי לבדוק את דלדול של נוירונים ב hypostome 13 , 16 . מחקרים קודמים הראו כי נוירונים ב peduncle יכול גם להיות דמיינו באמצעות נוגדן זה 13 , אולם אלה נוירונים כמו גם אלה בעמודה הגוף קשה יותר לעשות. בעוד אימונוהיסטוכימיה מספיקה כדי לאשר את היעדר תאי עצב ב hypostome ואינו דורש מומחיות על סוג מורפולוגיה התא, זה לא יכול לשמש כדי לבדוק את היעדר תאי גזע interstitial ואת נגזרות אחרות של תאים אלה. דיסוציאציה ומחקרים מורפולוגיה תא הם קפדניים יותר והוא יכול לתת חשבון כמותי של המספרים של כל סוג התא שנותרו לאחר כל שלב של הטיפול.

<table><tbody><tr><td>קולכיצין</td><td>אקרוס אורגניקס</td><td>227120010</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>BD</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח שרימפס ביצים שרימפס</td><td>מי מלח ישיר</td><td>N/A</td><td>ניתן לרכוש מקומית</td></tr><tr><td>צלחת מדגרת שרימפס מי</td><td>מלח שרימפס ישיר</td><td>60</td><td></td></tr><tr><td>מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי</td><td>Celltreat</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם x 3/4 אינץ' מחט היפודרמית</td><td>Covidien</td><td>1188830340</td><td>ניתן להשתמש גם במחט 27G 2</td></tr><tr><td>x פינצטה עדינה</td><td>Dumont</td><td>0109-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>EMD Millipore</td><td>557303</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר lgG, Pab (מצומד HRP)</td><td>Enzo</td><td>ADI-SAB-100-J</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td></td>אזמל <td>פישר BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר</td><td>08-920A</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>טבליות PBS</td><td>MP Bio</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>מונוקלונל אנטי-טובולין, טירוזין</td><td>סיגמא</td><td>T9028</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>סיגמא</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X - 100</td><td>סיגמא</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>20</td><td>סיגמא</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>אורטן</td><td>סיגמא</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>משאבת אוויר</td><td>Tetra</td><td>77846-00</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת פסטר זכוכית</td><td>VWR</td><td>53283-916</td><td>אורך הפיפט לא משנה</td></tr><tr><td>צינור 15 מ"ל VWR</td><td></td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>P320 נייר זכוכית</td><td>3M</td><td>IBGABBV00397</td><td>ניתן לרכוש בחנות שיפוץ הבית המקומית</td></tr></tbody></table>

דור ותחזוקה לטווח ארוך של עצבים ללא<em&gt; הידרה</em

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

השושלת התא interstitial של הידרה כולל תאי גזע multipotent, ונגזרותיהם: תאי בלוטת, נמטוציטים, תאי נבט, ותאי עצב. תאים interstitial ניתן לבטל דרך שני טיפולים רצופים עם קולצ&#39;יצין, רעלן הנגזרות מן הצמח כי הורג תאים מחולקים, ובכך מוחק את הפוטנציאל לחידוש של תאים מובחנים נגזרות תאי גזע interstitial. זה מאפשר את הדור של הידרה כי חוסר תאי עצב. פוליפ נטול עצבים אינו יכול לפתוח את פיו כדי להאכיל, לגדול, או להסדיר לחץ אוסמוטי. בעלי חיים כאלה, לעומת זאת, יכולים לשרוד ולהיות מתורבת ללא הגבלת זמן במעבדה אם באופן קבוע להאכיל בכוח ו גיהוק. היעדר תאי עצב מאפשר מחקרים על תפקידה של מערכת העצבים בוויסות התנהגות בעלי חיים והתחדשות. שפורסמו בעבר פרוטוקולים עבור תחזוקה ללא הידרה הידרה כרוך טכניקות מיושנות כגון פיפטינג פה עם יד משך micropipetteIps כדי להאכיל ולנקות את ההידרה . הנה, פרוטוקול משופר לתחזוקה של הידרה ללא עצב הוא הציג. מלקחיים עדינים משמשים לכפות לפתוח את הפה ולהכניס טריים Artemia נהרג. לאחר האכלה בכוח, חלל הגוף של החיה הוא סומק בינוני בינוני באמצעות מזרק ומחט מזרק כדי להסיר חומר מעוכל, המכונה כאן &quot;גיהוק&quot;. שיטה חדשה זו של האכלה בכוח ו גיהוק ללא הידרה ללא שימוש במלקחיים ומזרקים מבטלת את הצורך בפה פיפטינג באמצעות משיכת יד micropipette עצות. זה ובכך הופך את התהליך בטוח יותר באופן משמעותי יותר זמן. כדי להבטיח כי תאי עצב hypostome בוטלו, אימונוהיסטוכימיה באמצעות אנטי tyrosine- טובולין מתנהל.

מיד לאחר הטיפול הראשוני 8 colchicine, כל הידרה לשרוד. חלק אלה הידרה יהיה רק ​​זרועות בדלי הנותרים ( איור 3 א ), בעוד שאחרים איבדו לחלוטין זרועותיהם ( איור 3 ב ). במהלך 1 או 2 ימים הבאים, זרועות ימשיך להתכווץ עד כל הידרה איבדו את זרועותיהם. כשבוע לאחר הטיפול, ההידרה יראה סימנים של לצמיחה מחודשת זרוע, עם בדל קטן כמו זרועות...

באמצעות טיפול כפול עם קולצ&#39;יצין, רעלן הנגזרות מן הצמח הורג תאים מחולקים, הידרה ללא עצה הידראולית יכול להיות שנוצר. הידרה אלה לא יכולים להאכיל או egest בעצמם. מאמר זה מתאר שיטה משופרת עבור תחזוקה לטווח ארוך של העצב חינם הידרה vulgaris במעבדה.

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לייצר ולתחזק ביעילות הידרות נטולות עצבים באמצעות האכלה כפויה ידנית וגרעפסים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מחקר ההידרה בנוגע לתפקיד העצב ולהתנהגויות ותהליכים ביולוגיים שונים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, בטוחה ויעילה יותר מבחינת זמן מאשר פרוטוקולים להאכלה וגרעפסים שפורסמו בעבר.השימוש בפינצטה כדי להזיז את ההידרה תחת המיקרוסקופ עשוי להיות קשה ומתסכל בתחילה, אך הדבר הופך לקל יותר במהירות עם התרגול. התחילו בהוספת ציסטות של Artemia למכל זכוכית גבוה וצר המצטמצם בתחתיתו. מלאו את המכל במי Artemia, תוך הקפדה שלא לחרוג מכמות של 1 g של ציסטות ל-1 L של מים כדי להבטיח אחוז בקיעה גבוה יותר.כסו את חלקו העליון של המכל ב-parafilm והחדירו פפית סרולוגית של 10 מיליליטר דרך ה-parafilm אל תוך המכל, תוך הקפדה שקצה הפפית יגיע לתחתית המכל. חברו קטע צינור למשאבת אוויר של אקווריום, ולאחר מכן התאימו את הצינור סביב הפפית כדי לספק אספקת אוויר למכל.כאשר ה-Artemia בוקעות, השתמשו ברשת Artemia כדי לסנן את השרימפס מהתרבית ושטפו את בעלי החיים במשך כ-20 שניות במים דיוניים. בסיום השטיפה, העבירו את ה-Artemia לצלוחית עם מצע hydra. תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להביא להמתת השרימפס על ידי לחיצה קלה.הנח את ה-Artemia ששוחטו זה עתה קרוב להידרה כדי להקל על האכלה מהירה. כעת אחז את ההידרה הראשונה בבסיסה בעזרת זוג פינצטות, וצבט את גוף ההידרה עם זוג פינצטות שני כדי לגרום להידרה להתכווץ. הקיש על מרכז ההיפוסטום כדי לגרום להידרה לפתוח את פיה.אם הפה אינו נפתח, נקבו את מרכז ההיפוסטום באמצעות הפינצטה ושחררו מעט את הלחץ מהקצוות כדי להרחיב את פתח הפה שנוצר מהדקירה. הכניסו במהירות כמה שיותר Artemia לחלל הקיבה של ההידרה, עד שהחלל יהיה מלא ולא ניתן יהיה להכניס Artemia נוספים מבלי לפגוע בהידרה, לשלוף בטעות Artemia מתוך החלל או למנוע מהפה להיסגר. אם הפה מתחיל להיסגר, הרחיבו את פתח הפה באמצעות הפינצטה כפי שהודגם כעת, תוך הקפדה ש-Artemia שכבר נמצאים בתוך בעל החיים לא יצאו החוצה.אם ההידרה קטנה מדי עבור Artemia שלמה, חתכו את החריף בעזרת הסקלפל והגש להידרה חתיכות קטנות יותר. אם ה-Artemia אינה נשארת בתוך ההידרה, ייתכן שיהיה צורך להפעיל לחץ עם הפינצטה על ה-Artemia, כדי להחזיקה בפנים עד לסגירת הפה. לאחר שכל ההידרה הוכשרו, השתמשו בפיפט פסטור מזכוכית כדי להעביר את ההידרה לצלחית עם מצע הידרה טרי, המועשר ב-rifampicin, תוך הקפדה למנוע פליטה מקרית של המזון.בין שמונה ל-20 שעות לאחר ההאכלה, השתמשו בנייר זכוכית בעל רשת P320 או דומה לו, כדי להחליק את קצה מחט היפותרמית בקוטר 30 gauge עד שהחלק העליון יהיה שטוח. חברו את המחט למזרק פלסטיק חד-פעמי של מיליליטר אחד ומלאו את המזרק בתמיסת גידול להידרה (hydra medium) רעננה בתוספת rifampicin. הניחו את צלחת תרבית ההידרה תחת המיקרוסקופ והשתמשו בפינצטה עדינה כדי להחזיק את בסיס ההידרה.הקישו במרכז ההיפוסטום (hypostome) בעזרת מחט המזרק. אם הפה אינו נפתח, הכניסו פינצטה אל ההיפוסטום כדי לפתוח את הפה כפי שהודגם כעת. לאחר מכן, השתמשו במזרק כדי לשטוף בעדינות רבה את התמיכה לתוך החלל הקיבתי, תוך הקפדה שלא להעיף את ההידרה עד שכל השאריות יסולקו.לאחר מכן, השתמשו בפיפטת פסטור מזכוכית כדי להעביר את ההידרה לאחר השחרור (burped) לצלחת עם מצע גידול להידרה המועשר בריפמפיצין (rifampicin). מיד לאחר טיפול ראשוני בתרבית למשך שמונה שעות, כל ההידרות שרדו. לחלק מהבעלי חיים יישארו רק שאריות של זרועות, בעוד שאחרים יאבדו את זרועותיהם לחלוטין.כשבוע לאחר הטיפול, ההידרה תראה סימנים של צמיחה מחדש של זרועות קטנות דמויות בדל, בטרם התחדשותן המלאה במהלך שבעת הימים הבאים. לאחר טיפול שני, כ-10% ממספר בעלי החיים המקורי שעברו את שני הטיפולים מחלימים וגדלים לגודל המתאים לניסוי. הידרות שעברו טיפול כפול מציגות זרועות שנראות דקות יותר מאלו של בעלי חיים שלא טופלו, בעלות רקמה שקופה יותר ונראות נפוחות עקב חוסר יכולתן לפתוח את פיהן כדי להקל על הלחץ האוסמוטי.רשתות העצבים בראשיהם של הידרה לא מטופלת מציגות סיבים ברורים הקורנים החוצה מהפה, וכן גופי תא ניכרים. לעומת זאת, סיבים אלו אינם קיימים בהידרה נטולת עצבים לאחר טיפול כפול ב-culturezine. צביעה משולבת עם DAPI חושפת מספר מופחת של גרעינים בהידרה נטולת עצבים בהשוואה לביקורות לא מטופלות, וזאת בשל אובדן תאי שושלת התאים הבין-רקמתיים שנגרם מהטיפול הכפול ב-culturezine.ברגע שהפעולה תהפוך למיומנת, ניתן להשלים האכלה של הידרה אחת בפחות מדקה, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ההאכלה המאולצת והוצאת האוויר (burping) מהידרה נטולת עצבים.

generation-and-long-term-maintenance-of-nerve-free-hydra

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הידרה טרנסגנית יציבה מיוצרת על ידי הזרקת מיקרו של DNA פלסמיד לעוברים ואחריה אינטגרציה גנומית אקראית והתפשטות א-מינית כדי ליצור קו אחיד. הידרה טרנסגנית משמשת למעקב אחר תנועות תאים, ביטוי יתר של גנים, חקר תפקוד המקדם או הפלת ביטוי גנים באמצעות RNAi.

דור של הטרנסגניים הידרה על ידי Microinjection העובר

מתואר פרוטוקול מותאם אישית להבדיל תאי ES של עכברים לאוכלוסיות מוגדרות של נוירונים טהורים ביותר המציגים סינפסות מתפקדות והתנהגות רשת מתעוררת. ניתוח אלקטרופיזיולוגי מדגים את אובדן ההעברה הסינפטית בעקבות חשיפה לסרוטיפים של נוירוטוקסין בוטולינום /A-/G ורעלן עצבי טטנוס.

הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להבדיל בין תאי אב עצביים לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, על מנת להניב אוכלוסיית תאים עצביים חזקה ומשוכפלת, אשר עשויה לשמש לזיהוי מסלולי ההתפתחות התורמים לפתוגנזה של מחלות בהפרעות נוירולוגיות רבות.

מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

כתב היד הזה מפרט את ייצור של רקמות מיקרו- רקמות מהונדסות ברשתות עצביות: מבנים תלת-מימדיים בגודל מיקרון המורכבים משטחים אקסונליים ארוכי טווח המקיפים אוכלוסייה נוירונית מצטברת (s), המצופים בהידרוגול צינורי. אלה הפיגומים החיים יכולים לשמש ממסרים תפקודית לשחזר או לווסת מעגלים עצביים או כמו מיטות בדיקה ביופידלית מחקה נוירונטומי חומר אפור לבן.

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

אנחנו ראווה הפיתוח של חבילות שהורכב עצמית, תלת מימדי של somata astrocytic longitudinally מיושר ותהליכים בתוך למטרתו biomaterial הרומן. אלה מהונדסים "חי פיגומים", מפגין בקנה מידה מיקרון קוטר עדיין הארכת ס מ אורך, עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד מנגנוני התפתחותיות או להקל על neuroregeneration על-ידי הגירה העצבית המשגה ו/או עצב pathfinding.

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

במסמך זה, אנו מציגים עבור התרבות תלת-ממד של עכברוש פרוטוקול תאי המוח-derived עכשיו, דונלד, לרבות האסטרוציטים, מיקרוגלייה oligodendrocytes להפוך. נדגים התרבות התא הראשי, סינתזה הידרוג חומצה היאלורונית methacrylated (חמה), HAMAphoto-הפילמור ותא כימוס, דוגמת עיבוד עבור הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים קונאפוקלית של סריקה.

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפעלת שדה חשמלי פולס ננו-שנייה (nsPEF) כדי לעורר תאי Schwann במבחנה. יכולת הסינתזה וההפרשה של גורמים רלוונטיים ושינויים בהתנהגות התא אימתו את הגירוי המוצלח באמצעות nsPEF. המחקר נותן מבט חיובי על שיטת התחדשות העצבים ההיקפית.

ויסות צמיחת תאי Schwann על ידי שדה חשמלי פועם ננו-שנייה להתחדשות עצבית היקפית במבחנה

באמצעות הדמיית טיימ-לפס, ניתן לעקוב אחר תהליך ההתחדשות המלא של ספרואידים של הידרה . פרוטוקול זה מתאר את יצירת ספרואידים של הידרה , דן במגוון אסטרטגיות התקנה, ומפרט כיצד לבצע הדמיה חיה ארוכת טווח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב וכן מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של יריעת אור.

הכנה והדמיה חיה של ספרואידים מתחדשים של הידרה

כאן אנו מתארים את שיטות הבדיקה C. elegans למידה אסוציאטיבי זיכרון אסוציאטיבי קצר לטווח ארוך. אלה מבחני האוכלוסייה להעסיק את היכולות תולעים chemotax כלפי odorants נדיפים, וליצור אסוציאציות חיוביות על זיווג עם מזון butanone chemoattractant. הגדלת מספר תקופות מיזוג גורם זיכרון לטווח ארוך.

סי אלגנס למידה חיובית Butanone, לטווח קצר, לטווח ארוך מבחני זיכרון אסוציאטיבי

למדו שיטה משופצת לגידול והחזקה לטווח ארוך של הידרה חסרת עצבים באמצעות האכלה כפויה ושחרור ידני. טכניקה זו מאפשרת חקר תפקידי העצבים בהתנהגות ובתהליכים ביולוגיים ב-Hydra vulgaris.

דור ותחזוקה לטווח ארוך של עצבים ללא

גלה סרטונים נוספים