Name: שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח גין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: למדו כיצד לנתח פונקציות גנים בזחלי יתושים באמצעות מערכת משלוח ג'ין מבוססת Densovirus רקומביננטי. השיטה מאפשרת שכפול יעיל וארוך טווח של גנים ומיקרו-RNA לחקירת ביולוגיית היתושים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים לאשר תמיכה כספית מן המחקר הלאומי מפתח תוכנית הפיתוח של סין (2016YFC1200500 אל שיאו-גואנג חן), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81672054 ו- 81371846), התכנית צוות המחקר של הטבעי קרן המדע של גואנג-דונג (2014A030312016), התכנית המדעית והטכנולוגית של גואנגג'ואו (201508020263). אנו להכיר בהכרת תודה פרופסור ג'ונתן קרלסון (קולורדו סטייט) עבור מתבקשים לספק את פלסמידים ןלמה ו- p7NS1-GFP, אנושות קריאת כתב היד הזה.

כל הפרוטוקולים אושרו על-ידי אתי הוועדה של דרום רפואי האוניברסיטה.
 1. עיצוב אינטרון מלאכותי של הערה: אינטרון מלאכותי המשמש בעבודה זו הוא 65 bp ב אורך, ואודות הרצף הוא 5 &#39; - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 &#39;.
<ol><li>מקום Hpa אני הגבלה באתר בשני קצוות אינטרון מלאכותי אז זה Hpa אני העיכול יכול לשחרר את אינטרון של פלסמידים (ראה איור 1 א').</li>
	<li>מקום השני Xba אני הגבלת אתרי אינטרון אז זה Xba אני העיכול יכול לשמש כדי להוסיף ביטוי קטן-RNA רצפים.</li>
	<li>להזמין סינתזה כימית של רצפי DNA באורך מלא של אינטרון מלאכותי יצרן ה-DNA. סינתטיים DNA שנוצר הוא שיבוט לתוך פלסמיד pUC19 סטנדרטי. 
	הערה: מרכיבים חיוניים של אינטרון מלאכותית כוללים מספר רכיבי נוקלאוטיד קונצנזוס, כולל 5 &#39; אחוי התורם (DS) עם הרצף GUAAGAGU, רצף בנקודת הסתעפות שנשמרת (BPS) עם הרצף UACUAAC, פולי-פירימידין בדרכי (PPT) עם רצף ה-UCUUC(U) 10, ו- 3 &#39;-אתר splice מקבל (AS) עם הרצף GAUAUCCUGCAG ( איור 1 א'). שני Xba אני באתרים מגבלת הוצגו בין DS BPS שיכול לשמש להוספת רצפי ביטוי קטן-RNA. היכולת לבצע ביעילות אחוי הזה אינטרון מלאכותי מתאי מידע יונקים וכילה נגד יתושים כבר קודם לכן אישר 14.</li>
</ol> 2. עיצוב מלאכותית Intronic קטן RNA ביטוי קלטת הערה: ביטוי או נוקאאוט של miRNA אנדוגני, רצפים קידוד miRNA קודמן או ספוגית miRNA הוכנסו בין DS BPS. כדי לשמש דוגמה, miRNA קודמן אנדוגני של Ae. albopictus aal-תן-7 נבחר לבנות רקומביננטי וקטורים ויראלי ביטוי miRNA, נוקאאוט. ספוג אנטי-let-7 תוכנן על פי השיטות שתוארו 15. כדי להפיל את היעד גנים הזחלים, עיצבנו ספציפי miRNA מלאכותית (amiRNA) או סיכת ראש קצר רצפי RNA (shRNA) באמצעות תוכנה באינטרנט 16 , 17; כדי לשמש דוגמה, V-ATPase יחידת משנה של mRNA (ההצטרפות לא. AY864912) נבחר גן המטרה במחקר זה. AmiRNA יכונו כפי amiVTP להלן. כל הפרטים רצפים של טרום-miRNA, ספוג, amiRNA shRNA מתוארים משלימה טבלה 1-
<ol><li>להזמין את הסינתזה של רצפי cDNA באורך מלא של קודמן miRNAs, ספוגים miRNA, shRNA עם Xba אני הגבלת אתרים בשני הקצוות מיצרן דנ א.</li>
	<li>לאחר קבלת ה-DNA מסודרות, ספין הצינורות המכילה DNA רחובות ב- 10,000-14,000 x g עבור 1 דקות להבטיח כי מיובש הדנ א הוא בתחתית השפופרת.</li>
	<li>Resuspend ה-DNA מיובשים במים נטולי DNase להשגת ריכוז סופי של 10 ng/µL.</li>
	<li>לעכל את עמוד השדרה של פלסמיד ו DNA וחלבונים בעלי Xba אני ב 37 ° C עבור 1 h ולאחר מכן dephosphorylate 5 &#39; הקצוות של עמוד השדרה פלסמיד ליניארית עם עגל מעיים אלקליין פוספטאז (CIAP) על פי היצרן &#39; פרוטוקול s .</li>
	<li>בטל CIAP על ידי חימום עבור 60 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס</li>
	<li>לרוץ ג'ל agarose 1.0% וחותכים את עמוד השדרה ליניארית. ואז לחלץ את ה-DNA של הפרוסה ג'ל באמצעות ערכת חילוץ ג'ל בעקבות היצרן &#39; הוראות s.</li>
	<li>Ligate מקטע DNA לתוך ליגאז T4 DNA backboneby (U 5/µL) ב 22 ° C עבור ה 1</li>
	<li>להפוך את המוצרים של התגובה מצדו של תאים הצעד 2.7 המוסמכת Escherichia coli (e. coli) וצלחת על צלחת אגר Lysogeny מרק (LB) המכיל אמפיצילין (על ריכוז של µg 100/mL).
	זן <ol><li>לבצע השינוי דרך שיטת הלם חום 18, שימוש המתאים e. coli. לדוגמה, השתמש e. coli זן DH5α לשינוי הלם חום.</li>
	</ol></li> <li>פיק מושבה בודדת של צעד 2.8, דגירה בתרבות של 3 מ ל מועשרים בינוני המכיל אמפיצילין (על ריכוז של µg 100/mL).</li>
	<li>לחלץ את פלסמיד ה-DNA של התרבות חיידקי באמצעות ערכת הכנה מיני בעקבות היצרן &#39; s הוראות. לשלוח את הדגימה חברה רצפי דנ א. 
	הערה: עבור ביטוי או נוקאאוט של miRNA אנדוגני, הרצפים קידוד miRNA קודמן או ספוגית miRNA הוכנסו בין השניים Xba אני אתרים. כל המבנים ביטוי או ספוג miRNA צריך להיות קצר יותר 400 bp (10% של אורך גנום ויראלי) עקב המגבלה אריזה של וירוס 19.</li>
</ol> 3. יצירת rAeaDV לבנות על-ידי שיבוט של miRNA או shRNA ביטוי קלטת לתוך עמוד השדרה פלסמיד הערה: ןלמה, שיבוט זיהומיות המורכב פלסמיד ןלמה המכיל את הגנום AaeDV (3,981 nt) 19. הינכם מתבקשים באדיבות סופק על ידי פרופסור ג'ונתן קרלסון, תוארה בעבר פירוט 11. p7NS1-DsRed מבטא חלבון שאינן מבניות 1 (NS1)-חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed) חלבון כימרי מן האמרגן p7 כבר מתוארות בפרוטרוט במקום 14. אדם ספציפי מיר-941-1 קודמן 20 ו שלה ספוג, shRNA מקושקשות (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), היו גם subcloned לתוך AaeDV כפקד שלילי.
<ol><li>מאתרים ומפסיקים את pre-miRNA, ספוג, shRNA או קלטת הביטוי של amiVTP לתוך Hpa אני באתר של האזור AaeDV NS1-קידוד ב עמוד השדרה פלסמיד ןלמה כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 2.4-2.7.</li>
	<li>להפוך את ה-DNA Stbl3 המוסמכת e. coli תאים, בחר שיבוט חיובי כפי שמתואר בשלב 2.8 ל 2.10.</li>
	<li>בעקבות זה, לחלץ את פלסמיד rAaeDV של תאי חיידקים באמצעות ערכת ההכנה maxi בעקבות היצרן &#39; הוראות s. 
	הערה: תאים Stbl3 או Stbl4 e. coli צריך להיות מנוצל עבור rAaeDV שינוי ה-DNA למזער רקומבינציה ITR רצויה. הכנה מקסי אמור לשמש כדי לחלץ את פלסמיד rAaeDV להשיג כמות גדולה של ה-DNA (&#62; 100 µg). לפני יצירת הנגיף, רצף בשלמות פלסמיד rAaeDV צריך תמיד להיות נותחו על ידי רצף הדנ א 21-</li>
</ol> 4. Transfecting C6/36 תאים עם פלסמידים rAaeDV <ol><li>תרבות C6/36 תאים ב מכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין ב חממה 28 ° C.</li>
	<li>ביום 0, צלחת התאים 10 מבחנות תרבות של 25 ס מ 2 18-20 h לפני תרביות תאים על-ידי פיצול תאים confluent 90-95% לדילול 1:2. 
	הערה: ביום 1, התאים אמורים להגיע למפגש 90-95%.</li>
	<li>ביום 1, transfect את התאים עם הסדרה של פלסמידים rAaeDV 22-
	<ol><li>לדלל 10 µg DNA ב 600 µL של RPMI-1640 בינוני צינור microcentrifuge ומערבבים בעדינות. . בינתיים, מכינים 600 µL של RPMI-1640 בינוני של 25 µL של תרביות תאים ריאגנט לפי תקנים.</li>
		<li>Incubate למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, הוסף µL 625 של תערובת 1640-תקנים ריאגנט לתערובת 1640-פלסמיד דנ א.</li>
		<li>דגירה תערובת זו למשך 20-30 דקות ב- RT. לפני תרביות תאים, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ של RPMI-1640 בינונית.</li>
		<li>לאחר RT דגירה (שלב 4.3.3), להוסיף the1640-תקנים ריאגנט דנ א פלסמיד תערובת הבקבוקון תרבות 2 25 ס מ, תקופת דגירה של 6-אייץ '-28 מעלות צלזיוס</li>
		<li>-כ 6-אייץ ' פוסט-תרביות תאים, להסיר התקשורת תרביות תאים, לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ של RPMI-1640 בינוני, ולאחר מכן להוסיף RPMI-1640 בינוני עם 10% FBS. 
		הערה: rAaeDV מציגה את שיעור גבוה של זיהום (95%) albopictus Ae. הזחלים; עם זאת, בחוויה שלנו, כמעט 50% של הזחלים נגוע, הזיהום היה מוגבל לאתרי זיהום ראשי, (למשל, אנאלי ואדומות סטיגמטה והיו שלמים ותאים זיפים) ללא הפצת 23. לכן, אם יש צורך להדביק את הזחלים ברקמות מרובים, וירוס רקומביננטי פגומים ביטוי חלבון פלואורסצנטי צריך להיות שותף הנגוע כדי לאפשר את הפריט החזותי של זיהום אתרים. לדוגמה, כדי לייצר וירוס רקומביננטי פגומים לבטא DsRed, p7NS1-DsRed צריך להיות שותף transfected עם פלסמיד העוזר C6/36 תאים על-פי ההליך המתואר לעיל (היחס בין ריכוז cotransfection צריך להיות 2:1).</li>
	</ol></li></ol> 5. קציר rAaeDV Virions מתאי C6/36 Transfected <ol><li>לקצור את התאים 5 ימים לאחר תרביות תאים. מכך, להשעות הכלים על ידי טפטפת זכוכית 5 מ ל, pipetting למעלה ולמטה עם המדיום התרבות התאים. להעביר את כל המתלים תא צינורות סטרילי 15-mL-</li>
	<li>להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס או באמבט קרח יבש/אתנול למשך 30 דקות, ואז להפשיר ב 37 ° C. מערבולת עבור מינימלית 1 חוזר את הליך ההקפאה-הפשרה 3 פעמים.</li>
	<li>Centrifuge הדגימה ב-4,800 פגישות g x עבור 20 דקות ב 4 °C.Collect תגובת שיקוע וזורקים בגדר. . אז, תני את תגובת שיקוע דרך מסנן 0.22 של מזרק חד פעמיות מיקרומטר. Aliquot וחנות virion מטוהרים הסופי מניות ב-80 מעלות צלזיוס 
	הערה: להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.</li>
</ol> 6. לכימות rAaeDV <ol><li>להכין ה-DNA סטנדרטים. Linearize כל rAaeDV פלסמידים עם Hpa, ולטהר את המוצרים מתעכל עם ערכת חילוץ ג'ל 24.</li>
	<li>לבנות העקומה סטנדרט כמותי מוחלט ולמדוד את כייל של וירוס לפי השיטות שתוארו 25.</li>
</ol> 7. התמרה חושית יתוש <ol><li>ווש 100 1 סנט לחלל Ae. albopictus הזחלים שלוש פעמים באמצעות יונים מים, ולאחר מכן, להעביר את הזחלים לתוך גביע המכיל יונים 95 מ"ל מים. הוסף 5 מ של המניות rAaeDV (ריכוז סופי של 1.00 x 10 10 עותקים/mL).</li>
	<li>דגירה עבור 24 h ב- 28 ° C, לשטוף את הזחלים שלוש פעמים באמצעות מים יונים, ולאחר מכן להעביר את הזחלים בחזרה אל הגלופות. ולהאכיל בקביעות.</li>
	<li>לנטר את רמת היעד גנים ב הזחלים עם qPCR או תספיג חלבון (נציג תוצאות, מוצגות באיור דמויות 3 ו- 4). 
	הערה: שיטת זיהוי האות פלורסצנטיות יכול לשמש כדי לבודד את הזחלים נגועים בצורה מדויקת יותר. לדוגמה, כדי לאתר את אותות פלואורסצנט הזחלים נגוע בווירוס רקומביננטי לבטא DsRed, הזחלים ניתן להציב בשקופית השקערורית ו שנצפו תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה כל 8 שעות עד יומיים לאחר הפגיעה. ברגע הזחלים פלורסנט מזוהים, הם להפרידם לכוסות פלסטיק בדיקה אישית כדי לאפשר השגחה מתמדת עוקבות. הזחלים עם רקמות מרובים נגוע ניתן לזהות באמצעות שיטה זו.</li>
</ol>

<ol><li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.cppah.com/article/S1538-5442(09)00014-5/fulltext">Mosquito-borne diseases.</a> Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).</li>
<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).</li>
<li>Roberts, D. R., Andre, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+resistance+issues+in+vector-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">Insecticide resistance issues in vector-borne disease control.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).</li>
<li>Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+risks+on+the+backs+of+the+poor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing risks on the backs of the poor.</a> Nature medicine. 6, 729-731 (2000).</li>
<li>Volohonsky, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+the+Anti-parasitic+Factor+TEP1+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS pathogens. 13, 1006113(2017).</li>
<li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature communications. 5, 3977(2014).</li>
<li>Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+one+rabbit+out+of+the+hat%3A+Radiation%2C+transgenic+and+symbiont-based+approaches+for+sustainable+management+of+mosquito+and+tsetse+fly+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+tropica%22%5BJournal%5D)">More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations.</a> Acta tropica. 157, 115-130 (2016).</li>
<li>Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvised+microinjection+technique+for+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+journal+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Improvised microinjection technique for mosquito vectors.</a> The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).</li>
<li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).</li>
<li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%3A+implications+for+pest+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+science%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> Journal of insect science. 13, (Online) 69(2013).</li>
<li>Ward, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+transducing+densovirus+pathogenesis+and+expression+in+Aedes+aegypti+and+Anopheles+gambiae+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae.</a> Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).</li>
<li>Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densoviruses+for+control+and+genetic+manipulation+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+virus+research%22%5BJournal%5D)">Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes.</a> Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).</li>
<li>Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+the+Aedes+albopictus+parvovirus+%28AaPV%29%2C+a+denso-like+virus%2C+for+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes.</a> Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+non-defective+recombinant+densovirus+vectors+for+microRNA+delivery+in+the+invasive+vector+mosquito%2C+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus.</a> Scientific reports. 6, 20979(2016).</li>
<li>Ortega, M. M., Bouamar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+Designing+MicroRNA+Sponges%3A+From+Construction+to+Stable+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line.</a> Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).</li>
<li>BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/">http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/</a> (2017).</li>
<li>GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e253(2007).</li>
<li>Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densovirus+of+Aedes+aegypti+as+an+expression+vector+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells.</a> Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).</li>
<li>Hu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+human-specific+microRNA+miR-941%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Evolution of the human-specific microRNA miR-941.</a> Nature communications. 3, 1145(2012).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).</li>
<li>Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+AeDNA+containing+the+insect-specific+toxin%2C+BmK+IT1%2C+displayed+an+increasing+pathogenicity+on+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).</li>
<li>Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serious+overestimation+in+quantitative+PCR+by+circular+%28supercoiled%29+plasmid+standard%3A+microalgal+pcna+as+the+model+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene.</a> PloS one. 5, 9545(2010).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

חשוב להתגבר על שני המחסומים מפתח המגבילות בנייה rAaeDV. הראשון הוא הייצור של וירוס רקומביננטי פגומה. בעבר דווח כי MDV יכול לשמש וקטור לבטא כראוי בגודל גנים זרים, כגון עקרב חרקים ייחודיות neurotoxins20 החלבון GFP; עם זאת, משנה האסטרטגיה הבנייה, ברגע ORFs של MDV נוספו או מוחלף גנים אקסוגני, virions לא יכול ליצור באופן עצמאי אלא אם כן פלסמיד helper הוא cotransfected לספק את חסרים חלבונים ויראלי הכרחית. הנגיף הפגום אין אפשרות לעסוק שידור משני, המופיעה ויוו יתושים עם הגנום הפגום. התוצאות שלנו לאמת אסטרטגיית ביטוי int...

בעקיצות יתוש מחלות כמו מלריה, קדחת דנגי, קדחת zika, קדחת צהובה, הן בעיות בריאות הציבור הבינלאומיים הגדולים ימשיך להביא בחשבון חלק משמעותי של מחלה זיהומית העולמי נטל1,2. חומרי הדברה קונבנציונאליים, אשר שימשו בתגובה וקטורים, הם מרכיב מרכזי של קיימא יתושים משולבת אסטרטגיה הבקרה למניעת מחלות בעקיצות יתוש. עם זאת, אסטרטגיות מעין אלו הוכיחו להיות יחסית לא יעילה או לא רצוי בשל את המשויך השפעות סביבתיות שליליות, כמו גם את האבולוציה של עמידות נגד יתושים אוכלוסיות3,4. מסיבות אלו, יש צורך דחוף שיטות אלטרנטיביות של יתוש שליטה, וכן השימוש בשיטות הטרנסגניים לייצר יתושים זכרים מעוקרים, שחרורו של יתושים פתוגן עמיד שהתעוררו כמו אסטרטגיות שליטה חדש מבטיח. לפתח אפקטיבי חדש לשלוט בשיטות, כגון גישות בטוח ויעיל עבור ויוו המסירה הגן, ניתוח מקיף של יתוש ג'ין פונקציה זו נדרשת.
Microinjection ישירה של פלסמיד ה-DNA, כפול תקועים RNA (dsRNA) או RNA קטנים מפריעות (siRNA) היא הנפוצה ביותר ויוו ג'ין משלוח השיטה יתושים. למעשה, ייצור הטרנסגניים זנים של יתושים עדיין מסתמכים על תהליך של העובר microinjection5,6,7. עם זאת, microinjection יש מספר מגבלות. ראשית, טכניקה זו הוא תובעני מבחינה טכנית, כרוך פרוצדורות מסובכות. שנית, הזרקת גורם של עלבון פיזית אל העובר, הזחלים, גלמים, מבוגר, אשר משפיע ישירות על הכדאיות של האורגניזם היעד. שלישית, קשה לשתק רימות היתוש עבור microinjection כי רוב לגור גידול מימיים והינם בעלי מאפיין נזחל התנועה. רביעית, בגודל של 1סנט-2nd לחלל הזחלים היא 10 - עד 20 פי קטן יותר מזה של 4th לחלל הזחלים בוגרים, ואת את ציפורנייך של לשעבר הם עדינים יותר. תכונות אלה מקשות לתמרן 1סנט-2nd לחלל הזחלים בהשוואה לאלו בשלבים בוגרים. משולב, גורמים אלה תורמים סיכויי הישרדות שלאחר הזרקת מופחת עבור הזחלים (כ- 5%) לעומת מבוגרים8. מערכות מבוססות ויראלי משלוח פותחו כדי להתגבר על המחסומים חוץ-תאית, תאיים הקשורים. המערכות הללו יש את היתרונות של טיפול קל, יעילות גבוהה התמרה חושית, לטווח ארוך וחזק רמות ביטוי ביכולתה לייצר תופעות מתמשכות ויוו. לכן, ג'ין מערכות אספקה ניצול רטרווירוסים, lentiviruses ו- adenoviruses היה נרחב בשימוש שורות תאים inmammalian ומינים מודל. מערכת ביטוי ויראלי Sindbis היה בשימוש בעבר כדי לנתח את פונקציית ג'ין היתוש למבוגרים; מלבד החשש אבטחה, הזרקת זאת, עדיין תהליך הכרחי עבור זיהום ויראלי9. אמנם, משלוח אוראלי למסמס את הזחלים בפתרון dsRNA דווחה בעבר שיטת משלוח ריאלי, זה מתאים ניתוח פונקציה RNA קטנים10. אז, יש עדיין לפתח שיטות משלוח ויראלי יעיל ליתושים.
יתוש densoviruses (MDVs) הם חלק תת משפחה Densovirinae Parvoviridae, ונפילתה, כולם בתוך הסוג של Brevidensovirus11. MDV virions שאינו אפוף הינם מורכבים של גנום חד גדילי הדנ א (ssDNA), של capsid icosahedral (20 ננומטר בקוטר). הגנום הנגיפי משוכפל בתוך הגרעינים של התאים המארחים והיא בגודל של-4 kb. MDVs יציבים יחסית בסביבת ולהציג מגוון מארח צר עם ירידה לפרטים גבוה ליתושים. וירוסים אלה יש פוטנציאל התפשטה, מתעקש באופן טבעי אוכלוסיות יתוש, יכול לפלוש כמעט כל איברים ורקמות של חרקים אלה, לרבות פיתול, Malpighian בקוריאנית, שומן הגוף, מערכת השרירים, נוירונים, בלוטות הרוק12.
הגנום MDV שלם יכול להיות subcloned לתוך פלסמיד וקטורים לייצר שיבוטים זיהומיות המבוסס על פלסמיד; כאשר שיבוטים אלה מועברים לתאים יתושים, הגנום הנגיפי מופק מן הווקטור פלסמיד, נגיפים זיהומיות מיוצרים. מכיוון MDV יש גנום קטן ssDNA, שיבוטים זיהומיות נבנות בקלות וניתן הגנום הנגיפי בקלות בעורמה11,13. מאפיינים אלה להפוך MDV סוכן יקר לבחינת ביולוגיה נגד יתושים. עם זאת, כי כמעט את כל רצף הגנום הנגיפי חיונית עבור הפצה ויראלית, היצירה של וירוס רקומביננטי באמצעות החלפת או החדרת גנים זרים גורמת הפסד יכולות אריזה ו/או שכפול ויראלי, אשר יוצר מכשול להתפתחות של MDVs כמו ג'ין משלוח וקטורים. במסמך זה, אנחנו מדווחים באמצעות אסטרטגיית מלאכותי ביטוי קטן-RNA intronic לפתח מפורמטת rAaeDV ויוו RNA משלוח מערכת בעלת היתרונות של בנייה קלה פלסמיד ותחזוקה של וירוס פונקציונלי יכול לייצר ביטוי ארוכות טווח ויציבה בתאי המארח ללא צורך פראי-סוג וירוס. בנוסף, שיטה זו מאפשרת התמרה חושית קל של הזחלים.
הפרוטוקולים עבור השלבים הבאים מתוארים במחקר זה: שורה 1) העיצוב של rAaeDVs קידוד של קלטת ביטוי קטן-RNA intronic, 2) לייצור חלקיקי וירוס רקומביננטי שימוש בתא C6/36 אריזה, 3) ניתוח כמותי של התא-חופשית הגנום rAaeDV להעתיק מספרים ו- 4) זיהום של Ae. albopictus הזחלים על ידי ישיר החדרת וירוס לתוך הגוף מים של הגידול הזחל. בסך הכל, עבודה זו הוכיחה כי RNAs קטן מסוים או גנים היעד שניתן overexpressed או הפיל ב הזחלים יתושים באמצעות מערכת מפותחת של משלוח MDV.

<table><tbody><tr><td>מכונת צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>מערכת צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. ערכת מידי פלסמיד</td><td>אומגה ביוטק</td><td>D6904</td><td></td></tr><tr><td>מטוהר</td><td>אגר OXOID</td><td>LP0028A</td><td></td></tr><tr><td>FastAP אלקליין רגיש לחום (1 U/&micro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HpaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1034</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest XbaIThermo</td> <td>Scientific</td><td>FD0684</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TransStbl3 תא מוכשר כימית</td><td>בייג'ינג Transgen Biotech</td><td>CD521-01</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>בייג'ינג Tiangen Biotech</td><td>RT501</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>MC5008</td><td></td></tr><tr><td>SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)</td><td>בייג'ינג Tiangen Biotech</td><td>FP205</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

Microinjection in vivo הוא הטכניקה העברת גנים הנפוצות ביותר לניתוח הפונקציות ג'ין יתושים בודדים. אולם, שיטה זו דורשת יותר טכנית בדרישה מבצע, כרוך פרוצדורות מסובכות, במיוחד כשמשתמשים בהם הזחלים שלהם גודל קטן, יחסית דק ושברירי לציפורן וכתוצאה תמותה גבוהה, אשר להגביל היישום שלה. לעומת זאת, וקטורים ויראלי למסירה גן פותחו כדי להתגבר על המחסומים חוץ-תאית, תאיים. המערכות הללו יש את היתרונות של טיפול קל, ג'ין גבוה התמרה חושית יעילות, תחזוקה לטווח הארוך של ביטוי גנים, את היכולת לייצר תופעות מתמשכות ויוו. יתוש densoviruses (MDVs) הם וירוסים דנ א חד גדילי ספציפי נגד יתושים, קטנים שיכולים לספק ביעילות חומצות גרעין זר לתוך תאים יתושים; עם זאת, החלפת או החדרת גנים זרים כדי ליצור וירוסים רקומביננטי בדרך כלל גורמת לאובדן יכולות אריזה ו/או שכפול, המהווה מחסום לפיתוח של וירוסים אלה כמו משלוח וקטורים.
במסמך זה, מדווחים באמצעות אסטרטגיית מלאכותי ביטוי קטן-RNA intronic לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. מתוארים הליכים מפורטים עבור בנייה, אריזה אנליזה כמותית של הווקטורים rAaeDV, זיהום זחל.
מחקר זה מדגים, בפעם הראשונה, את הכדאיות של פיתוח מפורמטת רקומביננטי MDV מיקרו RNA (miRNA) ביטוי מערכת, ובכך לספק כלי רב עוצמה לניתוח פונקציונלי של גנים יתושים ואת הקמת בסיס יישום של נגיפי paratransgenesis לפיקוח על מחלות בעקיצות יתוש. הפגנו כי אדס 1סנט לחלל הזחלים יכול להיות בקלות וביעילות נגוע על ידי החדרת הנגיף לגוף מים הזחלים רבייה אתר, כי rAaeDVs מפותחת יכול לשמש overexpress או להפיל ביטוי של גנים יעד ספציפיות של הזחלים, מתן כלי לניתוח פונקציונלי של יתוש גנים.

אסטרטגיות לבנייה rAaeDV וקטור rAaeDV פגומים נוצר כדי לבטא את הגן DsRed ב רימות היתוש. פלסמיד וכתוצאה מכך הכיל קלטת חלבון NS1-DsRed פיוז'ן עם החלבון סמנכ ל שנמחקו (איור 1א'). פלסמידים rAaeDV המכיל ביטוי בונה עבור miRNA, miRNA ספוג, shRNA, amiRNA עוצבו (ראה איור 1B). לדוגמה, וקטור rAaeDV נוצר כדי overexpress שלומי אלחרר-תן-7 בבית. יתושים הזחלים. פלסמיד וכתוצאה מכך הכיל של קלטת ט...

. מדווחים באמצעות מלאכותיים intronic קטן RNA ביטוי אסטרטגיית לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. הליך מפורט עבור בנייה, אריזה, ניתוח כמותי של וקטורים rAaeDV כמו גם כ נגוע זחל מתואר.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לנתח את תפקוד הגנים של זחלי יתוש, תוך שימוש ב-mosquito densovirus רקומביננטי כמערכת להעברת גנים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במערכות העברה מבוססות נגיפים, כגון כיצד להתגבר על המחסומים התאיים והחוץ-תאיים הנלווים לכך. היתרונות העיקריים של טכניקות אלו הם מניפולציה קלה, יעילות טרנסדוקציה גבוהה, ביטוי גני עמיד וארוך טווח, והיכולת להשיג השפעות מתמשכות in vivo.עבודה זו הדגימה כי ניתן לבצע ביטוי יתר או השתקה של RNAs קטנים ספציפיים או של גנים מטרה בזבובים בשלב ה larvae, באמצעות מערכת ההעברה המבוססת על densovirus שפותחה. ההשלכות של טכניקה זו מרחיבות את היישומים של אסטרטגיית הביטוי המתוארת לחקר הביולוגיה של יתושים, שכן שיטה זו מאפשרת טרנסדוקציה קלה של larvae. את הפרוצדורה תדגים Pei-Wen Liu, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו.התחילו בהזמנת סינתזה כימית של רצפי cDNA מלאים עבור ה-miRNA precursors, ה-miRNA sponges וה-shRNA, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר קבלת ה-DNA שהוזמן, סובבו במצנטריפוגה את המבחנות המכילות את בלוקי ה-DNA כדי להבטיח שכל ה-DNA המיובש נמצא בתחתית המבחנה. לאחר מכן, המיסו מחדש את ה-DNA במים נקיים מ-DNase כדי להגיע לריכוז סופי של 10 nanograms per microliter.הוסף שש µL של XbaI כדי לעיקר את רצפי ה-cDNA ואת שלד הפלסמיד, והשאר את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, בצע דה-פוספורילציה של הקצוות במיקום 5' של שלד הפלסמיד הלינארי באמצעות calf-intestinal alkaline phosphatase, בהתאם להוראות היצרן. לצורך אריזה יעילה, גודל הגנום אינו יכול לעלות על 4,400 נוקלאוטידים, המהווים 110% מאורכו של גנום נגיף הדנסו (densovirus) של יתוש מסוג בר, או שניתן להחדיר לגנום של Aedes aegypti ביטוי של microRNA אינטרוני באורך של עד 400 נוקלאוטידים.בשלב הבא, בצעו אינאקטיבציה תרמית של הפוספטאז האלקלי בטמפרטורה של 65 degrees Celsius. לאחר מכן, הריצו את ה-DNA על ג'ל אגרוז בריכוז של 1%, וגזרו את רצועת השדרה (backbone) הלינארית. חלצו את ה-DNA מפרוסת הג'ל באמצעות ערכה לחילוץ ג'ל, בהתאם להוראות היצרן.לאחר המיצוי, חברו את מקטע ה-DNA למסגרת (backbone) באמצעות T4 DNA ligase. לאחר מכן, השתמשו בהלם תרמי כדי להחדיר (transform) את תוצרי תגובת הליגציה לתאי E.coli מסוג DH5-alpha competent. זרעו את החיידקים שעברו טרנספורמציה על צלחת LB agar המכילה 100 micrograms per milliliter של ampicillin.ביום למחרת, בחר מושבה אחת מהצלחת והכן תרבית התנעה, תוך שימוש ב-3 mL מצע מועשר המכיל 100 µg/mL של ampicillin. לבסוף, הוצא את ה-plasmid DNA מהתרבית הבקטריאלית, באמצעות ערכת miniprep, בהתאם להוראות היצרן. שלח דגימה של ה-DNA לחברת ריצוף DNA לצורך אימות.בצעו ליגציה של pre-miRNA או shRNA לאתר ה-HpaI באזור המקודד של NS1 ב-AaeDV בתוך השלדה של פלסמיד pUCA, תוך שימוש בשיטות שהוצגו עבור קסטת הביטוי של RNA קטן אינטרוני מלאכותי. במקום שימוש בתאי DH5-alpha, טרנספורמציה של ה-DNA תבוצע לתאי E.coli קומפטנטיים מסוג Stbl3. לאחר מכן, פזרו את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחת LB agar המכילה 100 µg/mL של אמפיסילין, והכינו תרבית התנעה מקלון חיובי. לאחר מכן, הוציאו את פלסמיד rAaeDV מהתאים הבקטריאליים באמצעות ערכת maxiprep, בהתאם להוראות היצרן.ביום אפס, פצלו בקבוקים של תאי C6/36 שהגיעו ל-90 עד 95% התמסכות (confluence) ביחס של אחד לשניים לתוך 10 בקבוקי תרבית מסוג T-25. דגרו את הבקבוקים במשך 18 עד 20 שעות בטמפרטורה של 28 °C עד שהם יגיעו שוב ל-90 עד 95% התמסכות.ביום הראשון, בצע טרנספקציה לתאים עם פלסמידי ה-rAaeDV שהופקו. לשם כך, דלל 10 micrograms של DNA לתוך 600 microliters של מצע RPMI-1640, וערבב את התמיסה בעדינות. במקביל, הכן 600 microliters של מצע RPMI-1640 ו-25 microliters של ריאגנט טרנספקציה עבור כל טרנספקציה.דגרו את התאים עם ה-DNA למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 625 µL של תערובת ריאגנט הטרנספקציה ב-RPMI-1640 לתערובת ה-plasmid DNA, ודגרו תערובת זו למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם מצע RPMI-1640, ולאחר מכן הוסיפו את תערובת הטרנספקציה לכל אחד מבקבוקי השבילה (T-25 culture flasks).דגרו את התאים בתערובת הטרנספקציה במשך שש שעות בטמפרטורה של 28 °C. לאחר שש שעות, הסירו את מצע הטרנספקציה, שטפו את התאים פעמיים עם 5 mL של מצע RPMI-1640, ולאחר מכן הוסיפו מצע RPMI-1640 טרי המכיל 10% FBS. חמישה ימים לאחר הטרנספקציה, השתמשו בטפטפת זכוכית של 5 mL כדי לשחרר ולהשעות את התאים בצלחות על ידי פיפטינג (שאיבה ושחרור) של מצע התרבית.העבירו את תרחיפי התאים מכל בקבוק לשפופרת סטרילית נפרדת בנפח 50 מיליליטר. כדי לקצור נגיף התלוי בסף גבוה (high threshold dependent virus), יש לתחזק את התאים למשך חמישה ימים לאחר הטרנספקציה. הקפיאו את השפופרות הבודדות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס או באמבטיית אתנול עם קרח יבש למשך 30 דקות.לאחר מכן, הפשיר אותם במהירות בטמפרטורה של 37 °C, וערבב את תרחיף התאים במכשיר וורטקס למשך דקה אחת. לאחר מכן, אסוף את העילאי מהמדגם שעבר צנטריפוגה, והשלך את המשקע. לבסוף, העבר את העילאי דרך מסנן מזרקה חד-פעמי של 0.22 µm.יש לחלק למנבובות (Aliquot) ולאחסן את מלאי הויריונים המנוקים הסופי בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. שטפו שלוש פעמים 100 זחלי *A. albopictus* בשלב גדילה ראשון, באמצעות מים דה-יוניים. לאחר מכן, העבירו את הזחלים לכלי כימי המכיל 95 milliliters של מים דה-יוניים.הוסיפו חמישה מיליליטר של מלאי rAaeDV, והדגירו את הזחלים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 28 °C. להצלחת זיהום הזחלים, חיוני שהזחלים יהיו במגע עם חלקיקי הווירוס המדביקים למשך 24 עד 36 שעות כדי להבטיח שיעורי הדבקה גבוהים. לאחר הדגירה, שטפו את הזחלים שלוש פעמים במים דה-יוניים, ולאחר מכן העבירו את הזחלים בחזרה לצלחות. האכילו את הזחלים באופן קבוע. עקבו אחר רמת הביטוי של הגן המטרה בזחלים באמצעות quantitative PCR או western blot, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות.בדוגמה זו, נותחו 100 פשפשים בשלב הזחלים הראשון (first-instar larvae) כדי לבחון את ביטוי ה-miRNA האנדוגני שלהם לאחר הדבקה בווירוס רקומביננטי המכיל את קסרת הביטוי aal-let-7 המראה ביטוי יתר.היעילות של מבנה ה-anti-let-7 מוצגת מימין, ומדגישה את יכולות השתיקה (knockdown) שלו. כדי לנטר את יעילות השתיקה של mRNA של V-ATPase באמצעות וקטורי rAaeDV, סך של 100 זחלים בשלב גיל ראשון טופלו בכמויות שוות של סוגים שונים של rAaeDV, על ידי הוספת הנגיף לגוף המים של בית גידול הזחלים. רמות ה-mRNA של V-ATPase הופחתו באופן משמעותי על ידי rAaeDV המבטא miRNA ועל ידי rAaeDV המבטא intronic shRNA.התוצאות שלנו מתקפות אסטרטגיית ביטוי אינטרונית המציעה פרדיגמה חדשה, המסוגלת להתגבר על המגבלות של וירוסי דנסו של יתושים עם גנום פגום, כדי לאפשר הובלה יעילה של גנים זרים לתוך יתושים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שניתן להחדיר קסטת ביטוי של microRNA אינטרונית באורך של לא יותר מ-400 nt אל תוך הגנום של וירוס הדנסו של Aedes aegypti. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך למחקרים בייצור של וירוסי דנסו רקומביננטיים של יתושים שאינם פגומים, המסוגלים לבטא באופן יתר או להפחית את הביטוי של microRNAs ושל הגנים המטרה, כדי לחקור ניתוח פונקציונלי של גנים ביתושים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש במערכת העברת ה-densovirus של יתוש שפותחה, כדי לנתח תפקודי גנים בזחלי יתוש.

use-recombinant-mosquito-densovirus-as-gene-delivery-vector-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה ג'יימס להזריק dsRNA לנקבה א aegypti יתושים, אשר בנמל וירוס דנגה. הטכניקה לכיול מחטי הזרקה, מניפולציה של ההתקנה הזרקה, והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.

הזרקת dsRNA לתוך יתושים א נקבה aegypti

גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה Dimopoulos להזריק לתוך dsRNA אנופלס gambiae יתושים, אשר בנמל טפיל המלריה. הטכניקה מניפולציה ההתקנה הזרקה והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

בראיון זה, ג'ורג' Dimopoulos מתמקד מנגנונים פיזיולוגיים בשימוש על ידי יתושים להילחם Plasmodium falciparum וזיהומים וירוס דנגה. הסבר ניתנת כמה גנים עקשן מפתח, אותם גנים המקנה עמידות פתוגנים וקטור, מזוהות היתוש ועד כמה הידע הזה יכול לשמש כדי ליצור יתושים מהונדס כי אינם יכולים לשאת את טפיל המלריה או וירוס דנגה.

בניית יתוש עדיף: זיהוי הגנים הפעלת מלריה קדחת דנגי ההתנגדות ב א gambiae וא aegypti יתושים

Oligonucleotides ניתן להשתמש כדי לאתר ספציפי תחליף נוקלאוטיד בודד של גני מטרה transfected...

Transfection ו mutagenesis של גני מטרה של תאים על ידי יתוש נעול חומצה שונה oligonucleotides גרעין

בפרוטוקול זה אנו משלבים RNAi בתיווך להשתקת גנים...

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

בסרטון זה, אנו מדגימים את העברת מבנה כונן הגן לעובר של יתוש אנופלס גמביה באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה עוברית. הליך זה מאפשר שילוב של מבנה DNA מועבר, באמצעות רקומבינציה הומולוגית, לתוך תאי הנבט כדי ליצור אוכלוסיית יתושים מותמרת.

מיקרו-הזרקה של עובר יתוש: טכניקה להעברת DNA אקסוגני לחלמון עובר של אנופלס גמביה ליצירת מוטציות בקו הנבט

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

RNA interference (RNAi) הוא כלי בעל ערך רב לחשיפת תפקוד הגנים. עם זאת, היכולת למקד גנים באמצעות RNAi בשלבים טרום-בוגרים מוגבלת בווקטור המלריה האנושי העיקרי Anopheles gambiae. אנו מתארים פרוטוקול RNAi להפחתת תפקוד הגנים באמצעות הזרקה ישירה במהלך התפתחות הגולם.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה microinjection לנו יש סטנדרטית, ומשמש מזה מספר שנים כדי לספק כמויות מסוימות של חומצות גרעין ישירות hemolymph של יתושים וזבובים הבית. פרוטוקול זה תוצאות בתמותה הזרקת מינימלית ומאפשר במינון בקורלציה מדידות של פוריות.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

מערכת GAL4-UAS הדו-צדדית היא כלי רב-תכליתי לשינוי ביטוי גנים באופן ספתיוטמפורלי מבוקר המאפשר ניתוח גנטי תפקודי בגמביה אנופלס. ההליכים המתוארים לשימוש במערכת זו הם אסטרטגיית שיבוט סטנדרטית למחצה, סקס וסינון של גלמים עבור סמני חלבון פלואורסצנטיים קיבעון עובר.

שימוש במערכת GAL4-UAS לגנטיקה תפקודית בגמביה אנופלס

למדו כיצד לנתח פונקציות גנים בזחלי יתושים באמצעות מערכת משלוח ג'ין מבוססת Densovirus רקומביננטי. השיטה מאפשרת שכפול יעיל וארוך טווח של גנים ומיקרו-RNA לחקירת ביולוגיית היתושים.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

גלה סרטונים נוספים