שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש
6 באוקטובר 2017
. מדווחים באמצעות מלאכותיים intronic קטן RNA ביטוי אסטרטגיית לפתח חלבון תקינה densovirus (AaeDV) Aedes aegypti ויוו מערכת המשלוח. הליך מפורט עבור בנייה, אריזה, ניתוח כמותי של וקטורים rAaeDV כמו גם כ נגוע זחל מתואר.
המטרה הכללית של הליך זה היא לנתח את תפקוד הגנים של זחלי יתוש, תוך שימוש ב-mosquito densovirus רקומביננטי כמערכת להעברת גנים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במערכות העברה מבוססות נגיפים, כגון כיצד להתגבר על המחסומים התאיים והחוץ-תאיים הנלווים לכך. היתרונות העיקריים של טכניקות אלו הם מניפולציה קלה, יעילות טרנסדוקציה גבוהה, ביטוי גני עמיד וארוך טווח, והיכולת להשיג השפעות מתמשכות in vivo.
עבודה זו הדגימה כי ניתן לבצע ביטוי יתר או השתקה של RNAs קטנים ספציפיים או של גנים מטרה בזבובים בשלב ה larvae, באמצעות מערכת ההעברה המבוססת על densovirus שפותחה. ההשלכות של טכניקה זו מרחיבות את היישומים של אסטרטגיית הביטוי המתוארת לחקר הביולוגיה של יתושים, שכן שיטה זו מאפשרת טרנסדוקציה קלה של larvae. את הפרוצדורה תדגים Pei-Wen Liu, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו.
התחילו בהזמנת סינתזה כימית של רצפי cDNA מלאים עבור ה-miRNA precursors, ה-miRNA sponges וה-shRNA, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר קבלת ה-DNA שהוזמן, סובבו במצנטריפוגה את המבחנות המכילות את בלוקי ה-DNA כדי להבטיח שכל ה-DNA המיובש נמצא בתחתית המבחנה. לאחר מכן, המיסו מחדש את ה-DNA במים נקיים מ-DNase כדי להגיע לריכוז סופי של 10 nanograms per microliter.
הוסף שש µL של XbaI כדי לעיקר את רצפי ה-cDNA ואת שלד הפלסמיד, והשאר את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, בצע דה-פוספורילציה של הקצוות במיקום 5' של שלד הפלסמיד הלינארי באמצעות calf-intestinal alkaline phosphatase, בהתאם להוראות היצרן. לצורך אריזה יעילה, גודל הגנום אינו יכול לעלות על 4,400 נוקלאוטידים, המהווים 110% מאורכו של גנום נגיף הדנסו (densovirus) של יתוש מסוג בר, או שניתן להחדיר לגנום של Aedes aegypti ביטוי של microRNA אינטרוני באורך של עד 400 נוקלאוטידים.
בשלב הבא, בצעו אינאקטיבציה תרמית של הפוספטאז האלקלי בטמפרטורה של 65 degrees Celsius. לאחר מכן, הריצו את ה-DNA על ג'ל אגרוז בריכוז של 1%, וגזרו את רצועת השדרה (backbone) הלינארית. חלצו את ה-DNA מפרוסת הג'ל באמצעות ערכה לחילוץ ג'ל, בהתאם להוראות היצרן.
לאחר המיצוי, חברו את מקטע ה-DNA למסגרת (backbone) באמצעות T4 DNA ligase. לאחר מכן, השתמשו בהלם תרמי כדי להחדיר (transform) את תוצרי תגובת הליגציה לתאי E.coli מסוג DH5-alpha competent. זרעו את החיידקים שעברו טרנספורמציה על צלחת LB agar המכילה 100 micrograms per milliliter של ampicillin.
ביום למחרת, בחר מושבה אחת מהצלחת והכן תרבית התנעה, תוך שימוש ב-3 mL מצע מועשר המכיל 100 µg/mL של ampicillin. לבסוף, הוצא את ה-plasmid DNA מהתרבית הבקטריאלית, באמצעות ערכת miniprep, בהתאם להוראות היצרן. שלח דגימה של ה-DNA לחברת ריצוף DNA לצורך אימות.
בצעו ליגציה של pre-miRNA או shRNA לאתר ה-HpaI באזור המקודד של NS1 ב-AaeDV בתוך השלדה של פלסמיד pUCA, תוך שימוש בשיטות שהוצגו עבור קסטת הביטוי של RNA קטן אינטרוני מלאכותי. במקום שימוש בתאי DH5-alpha, טרנספורמציה של ה-DNA תבוצע לתאי E.coli קומפטנטיים מסוג Stbl3. לאחר מכן, פזרו את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחת LB agar המכילה 100 µg/mL של אמפיסילין, והכינו תרבית התנעה מקלון חיובי. לאחר מכן, הוציאו את פלסמיד rAaeDV מהתאים הבקטריאליים באמצעות ערכת maxiprep, בהתאם להוראות היצרן.
ביום אפס, פצלו בקבוקים של תאי C6/36 שהגיעו ל-90 עד 95% התמסכות (confluence) ביחס של אחד לשניים לתוך 10 בקבוקי תרבית מסוג T-25. דגרו את הבקבוקים במשך 18 עד 20 שעות בטמפרטורה של 28 °C עד שהם יגיעו שוב ל-90 עד 95% התמסכות.
ביום הראשון, בצע טרנספקציה לתאים עם פלסמידי ה-rAaeDV שהופקו. לשם כך, דלל 10 micrograms של DNA לתוך 600 microliters של מצע RPMI-1640, וערבב את התמיסה בעדינות. במקביל, הכן 600 microliters של מצע RPMI-1640 ו-25 microliters של ריאגנט טרנספקציה עבור כל טרנספקציה.
דגרו את התאים עם ה-DNA למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 625 µL של תערובת ריאגנט הטרנספקציה ב-RPMI-1640 לתערובת ה-plasmid DNA, ודגרו תערובת זו למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם מצע RPMI-1640, ולאחר מכן הוסיפו את תערובת הטרנספקציה לכל אחד מבקבוקי השבילה (T-25 culture flasks).
דגרו את התאים בתערובת הטרנספקציה במשך שש שעות בטמפרטורה של 28 °C. לאחר שש שעות, הסירו את מצע הטרנספקציה, שטפו את התאים פעמיים עם 5 mL של מצע RPMI-1640, ולאחר מכן הוסיפו מצע RPMI-1640 טרי המכיל 10% FBS. חמישה ימים לאחר הטרנספקציה, השתמשו בטפטפת זכוכית של 5 mL כדי לשחרר ולהשעות את התאים בצלחות על ידי פיפטינג (שאיבה ושחרור) של מצע התרבית.
העבירו את תרחיפי התאים מכל בקבוק לשפופרת סטרילית נפרדת בנפח 50 מיליליטר. כדי לקצור נגיף התלוי בסף גבוה (high threshold dependent virus), יש לתחזק את התאים למשך חמישה ימים לאחר הטרנספקציה. הקפיאו את השפופרות הבודדות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס או באמבטיית אתנול עם קרח יבש למשך 30 דקות.
לאחר מכן, הפשיר אותם במהירות בטמפרטורה של 37 °C, וערבב את תרחיף התאים במכשיר וורטקס למשך דקה אחת. לאחר מכן, אסוף את העילאי מהמדגם שעבר צנטריפוגה, והשלך את המשקע. לבסוף, העבר את העילאי דרך מסנן מזרקה חד-פעמי של 0.22 µm.
יש לחלק למנבובות (Aliquot) ולאחסן את מלאי הויריונים המנוקים הסופי בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. שטפו שלוש פעמים 100 זחלי *A. albopictus* בשלב גדילה ראשון, באמצעות מים דה-יוניים. לאחר מכן, העבירו את הזחלים לכלי כימי המכיל 95 milliliters של מים דה-יוניים.
הוסיפו חמישה מיליליטר של מלאי rAaeDV, והדגירו את הזחלים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 28 °C. להצלחת זיהום הזחלים, חיוני שהזחלים יהיו במגע עם חלקיקי הווירוס המדביקים למשך 24 עד 36 שעות כדי להבטיח שיעורי הדבקה גבוהים. לאחר הדגירה, שטפו את הזחלים שלוש פעמים במים דה-יוניים, ולאחר מכן העבירו את הזחלים בחזרה לצלחות. האכילו את הזחלים באופן קבוע. עקבו אחר רמת הביטוי של הגן המטרה בזחלים באמצעות quantitative PCR או western blot, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות.
בדוגמה זו, נותחו 100 פשפשים בשלב הזחלים הראשון (first-instar larvae) כדי לבחון את ביטוי ה-miRNA האנדוגני שלהם לאחר הדבקה בווירוס רקומביננטי המכיל את קסרת הביטוי aal-let-7 המראה ביטוי יתר.
היעילות של מבנה ה-anti-let-7 מוצגת מימין, ומדגישה את יכולות השתיקה (knockdown) שלו. כדי לנטר את יעילות השתיקה של mRNA של V-ATPase באמצעות וקטורי rAaeDV, סך של 100 זחלים בשלב גיל ראשון טופלו בכמויות שוות של סוגים שונים של rAaeDV, על ידי הוספת הנגיף לגוף המים של בית גידול הזחלים. רמות ה-mRNA של V-ATPase הופחתו באופן משמעותי על ידי rAaeDV המבטא miRNA ועל ידי rAaeDV המבטא intronic shRNA.
התוצאות שלנו מתקפות אסטרטגיית ביטוי אינטרונית המציעה פרדיגמה חדשה, המסוגלת להתגבר על המגבלות של וירוסי דנסו של יתושים עם גנום פגום, כדי לאפשר הובלה יעילה של גנים זרים לתוך יתושים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שניתן להחדיר קסטת ביטוי של microRNA אינטרונית באורך של לא יותר מ-400 nt אל תוך הגנום של וירוס הדנסו של Aedes aegypti. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך למחקרים בייצור של וירוסי דנסו רקומביננטיים של יתושים שאינם פגומים, המסוגלים לבטא באופן יתר או להפחית את הביטוי של microRNAs ושל הגנים המטרה, כדי לחקור ניתוח פונקציונלי של גנים ביתושים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש במערכת העברת ה-densovirus של יתוש שפותחה, כדי לנתח תפקודי גנים בזחלי יתוש.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לניתוח תפקוד גנים בזחלי יתוש באמצעות שימוש בווירוס דנסו של Aedes aegypti רקומביננטי (AaeDV) כמערכת להעברת גנים. האסטרטגיה שפותחה מאפשרת מניפולציה יעילה של ביטוי גנים in vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מערכות להעברת גנים
- פיתוח וקטורים
- ביולוגיה של יתושים
רקע
- ניתן להשתמש בנגיפים רקומביננטיים להעברת גנים באורגניזמים שונים.
- הבנת תפקוד הגנים בזחלי יתוש היא קריטית לבקרת וקטורים.
- מחסומים חוץ-תאיים ותוך-תאיים מציבים אתגרים בהעברת גנים.
- ניתן להשתמש ב-Small RNAs לצורך ביטוי יתר (overexpression) או השתקה (knockdown) של גנים.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת הובלה רקומביננטית תקינה של AaeDV.
- הסהלה של חקר תפקודי גנים בזחלי יתוש.
- שיפור של מערכות הובלה מבוססות נגיפים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה ואריזה של וקטורי rAaeDV.
- ניתוח כמותי של יעילות הוקטור.
- נהלי הדבקה של זחליים in vivo.
- הערכה של מניפולציה של ביטוי גנים.
תוצאות עיקריות
- פיתוח מוצלח של מערכת הובלה רקומיננטית של AaeDV.
- נצפתה יעילות טרנסדוקציה גבוהה בזחלי יתוש.
- הודגמה יכולת לביטוי יתר או להשתקה של גנים ספציפיים.
- הושגו השפעות ארוכות טווח של מניפולציה גנטית.
מסקנות
- המערכת שפותחה משפרת את חקר הביולוגיה של היתושים.
- היא מספקת כלי חסון לניתוח תפקוד גנים.
- טכניקה זו עשויה להוביל להתקדמות באסטרטגיות לבקרת וקטורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
העברה של גנים באמצעות נגיף דנסו של יתוש רקומביננטי (rAaeDV) מאפשרת ביצוע של גנומיקה פונקציונלית חסונה וניתנת להרחבה בזחלי יתושים, ובכך היא עוקפת מחסומים טכניים של מיקרו-הזרקה ווקטורים ויראליים פגומים. מערכת זו תומכת במודולציה גנטית עמידה ובעלת יעילות גבוהה, המשפיעה ישירות על שלבי הגילוי המוקדמים ותיקוף מטרות עבור ביולוגיה של וקטורים ובקרת מחלות. הפלטים הכמותיים והשחזוריות שלה ממצבים אותה כפלטפורמה לשימוש חוזר לחקירת תפקודי גנים בתיקי מחקר של מחלות המועברות על ידי וקטורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה פונקציונלית ישירה של גנים ביתושים באמצעות ביטוי יתר או השתקה in vivo.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת תפקידי הגנים בביולוגיה של הווקטורים ובהעברת מחלות.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת מטרות עבור אסטרטגיות לבקרת ווקטורים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספקת חלופה סטנדרטית בעלת תפוקה גבוהה להזרקה מיקרוסקופית (microinjection) להחדרת גנים לזחלים.
- מאפשרת ויסות כמותי וניתן לשחזור של ביטוי גנים עבור בדיקות פנוטיפיות המשך.
- מאפשרת סריקה ניתנת להרחבה של תפקודי גנים וניתוח מסלולים במודלים של יתושים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם גילוי ביומרקרים תרגומיים על ידי אפשור מודולציה גנטית מתמשכת במערכות יתושים רלוונטיות למחלה.
- תומך ברצף שלבים מגילוי גנים ועד לאישור פרה-קליני של מטרות לבקרת וקטורים.
- מפחית את הסיכון בקידום מטרות גנטיות באמצעות אספקת נתונים פונקציונליים חסונים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מערכת rAaeDV זו משלבת שלבים החל מגילוי גנים מוקדם, דרך תיקוף מטרה ועד למחקר ביולוגיה של וקטורים בשלב הפרה-קליני, ובכך היא מאפשרת בדיקה רציפה של היפותזות וסריקה תפקודית בזחלי יתוש.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בניתוח תפקודי של גנים המונחה על ידי היפותזות ובבירור מסלולים in vivo.
- סקרים: מספקת מודולציה גנטית כמותית וניתנת לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת קריאות של quantitative PCR ו-western blot למדידה מדויקת של שינויים בביטוי גנים.
- מחקר תרגומי: מספקת מודולציה גנטית עמידה במודלים של יתושים הרלוונטיים למחקר של מחלות המועברות על ידי וקטורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשחזור ולהרחבה להעברת גנים עבור יישומים מגוונים של גנומיקה תפקודית ביתושים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תפקוד של גנים בווקטורים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הובלת גנים, שיפור השחזוריות ומאפשרת יכולת הרחבה לסריקה בסביבת תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון בשרשראות מחקר של ביולוגיה של וקטורים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום מטרות לבקרת וקטורים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בשיבוט מולקולרי, בניית וקטורים ויראליים וטיפול בזחלי יתוש.
- נדרשת גישה לתשתיות תרביות תאים, טרנספקציה ואנליזה כמותית (qPCR, western blot).
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולי הכנת וקטורים והדבקה.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמות עבור מיני יתושים שונים או מטרות גניות שונות בתוך הביולוגיה של הווקטור.
- יש להקפיד על מגבלות גודל הגנום ואורך המקטע המוכנס (insert) כדי לשמר את יעילות האריזה והשכפול של הווקטור.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Designing an Artificial Intronic Small RNA Expression Cassette
11:14
Conclusion
10:10
Results: Overexpression and Knockdown Efficiency of rAaeDV Vectors
4:22
Generating a rAaeDV Construct by Cloning a miRNA or shRNA Expression Cassette into a Plasmid Backbone
7:33
Harvesting rAaeDV Virions from Transfected C6/36 Cells
8:53
Mosquito Transduction
5:19
Transfecting C6/36 Cells with rAaeDV Plasmids
