Name: פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד תסיסנית נוירון מוטון ניוון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: למד שיטה פשוטה לפציעה מכנית של עצבים סגמנטליים בזחלי Drosophila לחקר ניוון נוירונים מוטורים. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות של ניוון עצבי בחיבור הנוירומוסקולרי ומספקת כלי נגיש לחקר מנגנוני ניוון עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לכל חברי המעבדות קלר ומגי באוניברסיטת קוויניפיאק להצעות מועילות. בפרט, ברצוננו להודות Barron L. לינקולן II לפיתוח assay זה פגיעה בתוך המעבדה קלר. כמו כן, ברצוננו להודות Quinnipiac אוניברסיטת קולג &#39;לאמנויות ומדע גרנט- In-Aid הוענק ל LC קלר.

1. הכנה של ריאגנטים וציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x הצפת Dissection (70 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 0.02 מ&quot;מ CaCl 2 , 20 מ&quot;מ MgCl 2 , 10 מ&quot;מ NaHCO 3 , סוכרוז 115 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ טרילהוז, 5 מ&quot;מ HEPES, pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x PBT באמצעות 1x PBS עם 0.01% Triton X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מיץ פירות אגר צלחות. 14 בקצרה, לערבב אגר 30 גרם 700 מ&quot;ל של H 2 O ו החיטוי. ממיסים 0.5 גרם של Paraben מתיל 10 מ&quot;ל של אתנול ולהוסיף פתרון 300 מ&quot;ל של מיץ פירות להתרכז (ענבים או תפוח). מערבבים להתרכז פתרון אגר autoclaved ויוצקים לתוך המכסים של 10 מ&quot;מ x 35 מ&quot;מ צלחות פטרי. הערה: פריקקס אגר ענבים כוח ניתן גם לרכוש מחברות שונות (ראה Tabls של חומרים ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג גודל 5 מלקחיים המאפשרים אחד מכני לפגוע בזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תקן תסיסנית CO 2 </sUb&gt; מכשיר הרדמה מבוסס. </li></ol> 2. בחירת זחלים תסיסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בקבוקון או בקבוק תסיסנית המכיל זחלים instar השלישי נודדים כי כבר מתורבת ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10 בודדים 2 nd או 3 rd insta הזחלים מבוסס על המראה. הזחלים instar השלישי יכול להיות מזוהה על ידי המראה של spiracles מסועף הקדמי, בעוד הזחלים instar השני הם קטנים יותר יש יותר כמו מועדון spiracles הקדמי. הערה: ניתן לזהות את שלבי הזחל גם על ידי תזמון. ב 25 ° C, הזחלים instar השני מופיעים כ 48 שעות לאחר הבקיעה, ואת השלישי זחלי instar זחילה כ 24 שעות מאוחר יותר. אם מעוניינים לבחון neurodegeneration ב NMJ, הזחלים instar השני צריך להיפגע. </li></ol> הכנת זחלים תסיסנית עבור פגיעה מכנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לבחור זחלים בודדים על ידי מלקחיים או מכחול, להיות זהיריםלא לדחוס אותו בכל מקרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ישר עשר זחלים לתוך צלחת זכוכית המכיל קר 1X PBS או חיץ לנתיחה להסיר כל פסולת מזון כדי להאט את תנועת הזחל. </li></ol> 4. מכני פגיעה וטיפול של זחלים תסיסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל זחל בודדים על מנגנון הרדמה CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, בזהירות לגלגל כל זחל על הצד הגבי שלהם כדי לדמיין את עצבי הסגמנטלי דרך לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום בגודל 5 מלקחיים כ 1/2 ל 2/3 דרך לאורך הזחל החל בפה ווים. לאחר מיקומו, קמצוץ כ 1/3 של לציפורן הגחון המכיל את העצבים הסגמנטליים עם גודל 5 מלקחיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח עצבים סגמנטליים הזחל נפצעו, להחיל כוח מספיק כדי למחוץ את עצבי הסגמנטלי אבל לעזוב את לציפורן ללא פגע. כדי לקבוע את הכמות הנכונה של כוח, לרסק 10 זחלים ולהבטיחשיעור התמותה לאחר 5 שעות מתחת ל -50%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פגיעה, בזהירות להעביר זחלים לצלחת אגר מיץ פירות המכיל כ 0.5 גרם של שמרים להדביק. מניחים כל זחל כך הקצה הקדמי שלה על הדבק שמרים, להמשך האכלה למרות תנועתיות משובשת. הערה: כדי להבטיח עצבים סגמנטליים הזחל נפגעו, תנועתיות הזחל שיבשו ניתן לראות לאחר העברת צלחת אגר. הזחל נפגע משותק למעשה האחורי לאתר הפציעה, אבל עדיין יכול להזיז את הפה ווים שלהם להאכיל. שיעור תמותה גבוה של בעלי חיים לאחר פגיעה הוא נפוץ ולכן עדיף לפגוע 20-50% יותר בעלי חיים ממה שנחוץ לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום צלחות אגר המכיל להדביק שמרים 10 זחלים פצע לתוך תחתית של צלחת פטרי 100 x 15 מ&quot;מ ריקה. מכסים את צלחת פטרי, המכיל עכשיו את הזחלים הפגועים על צלחת אגר עם מגבת נייר לחה, להבטיח כי מגבת נייר לא לגעת הזחלים או צלחות אגר. מקום זהצלחת פטרי לתוך מיכל חזק יותר אוויר, ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר זחלים לנתיחה לאחר תקופות שנקבעו (6, 12, או 24 שעות) שלאחר הפציעה. הערה: כדי לבחון את ההשפעות המיידיות של פגיעה על השלד של axonal, הזחלים ניתן לגזור ישירות לאחר הפציעה. כדי לבחון פגמים הובלה אקסונל, הזחלים ניתן לגזור כ 6 שעות לאחר הפציעה. בערך 12 שעות לאחר הפציעה הצטברות של חלבונים אוביקטיניטד ניתן לראות, ו 24 שעות לאחר הפציעה, ניוון של נוירונים המנוע ב NMJ ניתן לצפות. </li></ol> 5. ניתוח של Neurodegeneration ב NMJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תסיסנית הזחל NMJ כפי שתואר לעיל. 15 , 16 בקצרה, הזחלים פין על צלחת Sylgard, לחתוך לאורך פני הגבי, ואת פילה עם סיכות בטיפה של חיץ לנתיחה לחשוף את שרירי הגוף בגוף. תקן הזחלים או paraformaldehyde 4% (PFA) או פתרון של בויין בהתאם אנטיגופים המשמשים לדמיין נוירונים ושרירים. הערה: קיבוע PFA יש להשתמש אם תגי חלבון ניאון, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא להיות דמיינו כמו מקבע של בווין יכול להיות קשה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע immunofluorescence, אשר תוארה בעבר 11 , 13 , 16 , כדי לסמן בו זמנית נוירונים המנוע presynaptic ו סמינרי (SSR) סף שרירים. דמיינו קרום presynaptic ו אקסונים עם peroxidase חזרת פלואורסצנטי מצומדות (HRP) (1: 300) 17 אזורי פעיל יכול להיות מוכתם באמצעות נוגדנים נגד ברוכפילוט (Brp) (nc82, 1: 100, מחקרים התפתחותיים היברידומה בנק). במקביל, תווית שרירים פוסט-סינפטיים עם נוגדנים נוגדי-דיכאון גדולים (D: 1) (1: 10,000). 18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay הוקמה לכימות neurodegeneration ב NMJ כפי שתואר לעיל. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 בקצרה, במקביל לדמיין NMJs בודדים הן לפני ואחרי תאים סינפטיים. כל boutons שכותרתו עם סמנים postsynaptic אבל לא סמנים presynaptic מצביעים על אתרים של neurodegeneration ( איור 1 ). המספר הממוצע של boutons לכל NMJ כמו גם את המספר הממוצע של NMJs לכל חיה ניתן לכמת. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophilia%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li>
<li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li>
<li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda%2FDLK+MAP+kinase+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li>
<li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li>
<li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin%2Fankryin%2Fmicrotubule+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li>
<li>Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.rec065672.short">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19329927">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

פגיעה מכנית העצבית שתוארה קודם לכן הפגינו כאן יכול לשמש כדי לגרום לפציעה / מתח העצבים הסגמנטליים של הזחלים תסיסנית . 4 , 5 , 6 , 14 טכניקה זו ניסיוני כבר מועסקים בעבר לנתח את הרצף הזמני של אירועים המוביל neurodegeneration, כמו גם לבחון שינויים תעתיק בגופם התא הנייד נוירון שלאחר הפציעה. 5 , 14<...

ניוון עצבי מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית יכול להיגרם על ידי תהליך ההזדקנות הטבעי, פציעה, מתח, או מצבי מחלה. תסיסנית melanogaster , זבוב הפירות המשותף, מספק אורגניזם מודל פשוט וחזק ללמוד neurodegeneration בשל הדמיון המדהים של המנגנונים המולקולריים המניעים את התנוונות של נוירונים. קווי דמיון אלה מודגשים על ידי העובדה כי כ -70% של גנים אנושיים הקשורים המחלה יש הומולוג תסיסנית . 1 בנוסף, מבחני רבים וכלים טכנולוגיים ללמוד מחלות נוירודגנרטיביות אנושית פותחו וניצל תסיסנית . 2 , 3 בתוך תסיסנית , צומת neuromuscular (NMJ) מאפשר ניתוח של תכונות הסלולר והן אלקטרופיזיולוגיים הוכיח להיות מערכת חשובה ללמוד מחלות neuromuscular בשל n גלויחיבורי שריר יורון. 2 במחקר זה, אנו מתארים את assay פגיעה vivo נוירון בזחלים תסיסנית המאפשר הפציעה לשחזור של עצבים סגמנטליים. זו פגיעה motoneuron התוצאות ברצף הזמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך neurodegeneration ב NMJ 24 שעות לאחר הפציעה. היכולת לשכפל מוטורונורונים פגמים וכתוצאה מכך neurodegeneration יש יישומים מגוונים כגון זיהוי גנים ספציפיים הנדרשים לתהליך ניוונית, דיסקציה של תגובות תעתיק פציעה עצבית, וניתוח של מפלים איתות מגן. 4 , 5 , 6 שיטה זו שימשה גם בשילוב עם microfluidics ללמוד ניוון העצב התחדשות בבעלי חיים. 7 אנו מנצלים assay כמותי הוקמה לבחון degenerat נוירון המנועיון ב NMJ תסיסנית לאחר פגיעה מכנית. Assay זה מבוסס על העובדה כי אובדן של קרום presynaptic וחלבונים קודמת פירוק של reticulum subsynaptic (SSR) המאופיינת על ידי foldynaptic קרום שרירי הקפלים. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 assay זה מאפשר כימות של &quot;טביעות רגליים סינפטי&quot; שבו נוירון מראש סינפטי איבד את הקשר השריר postsynaptic הסמוך. תהליך ניוונית הוכח להיות פרוגרסיבי לאורך התפתחות הזחל 12 ולא ניתן להסביר על ידי שינוי סינפסה שינוי או נבטים. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 המודעההתצפית של שימוש פגיעה מכנית על מוטציות preexisting היא שזה מאפשר לנתיחה של רצף הזמני של אירועים סלולריים המוביל עד neurodegeneration ב NMJ. 13

<table><tbody><tr><td>מספריים מיקרו-מנתחים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11231-30</td><td>יש אנשים שמעדיפים מידה 3, בעוד שאחרים מעדיפים מידה 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>יש אנשים שמעדיפים מידה 3, בעוד שאחרים מעדיפים מידה 5</td></tr><tr><td>CO2 Air</td><td>Tank Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>ניתן לרכוש גדלי מיכל שונים</td></tr><tr><td>CO2 מכשיר הרדמה</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>סיכות נירוסטה, גודל 0.1</td><td>Fine Science</td><td>Tools 26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 סיליקון אלסטומר, בסיס וחומר ריפוי</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>למזיגת צלחות חיתוך</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>יש לבדוק נוגדנים ליעילותם ב-Bouin ו-PFA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA) בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>יש לבדוק את יעילותם ב-Bouin ו-PFA</td></tr><tr><td>ניתוח סטריאו MIcroscope</td><td></td><td>AmScope SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד nc82</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>אנטי דיסקים נוגדנים גדולים</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>אלקסה פלואור אנטי חזרת פרוקסידאז</td><td>ג'קסון אימונוסקר</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>One can you Alexa Fluor&reg; 488, 594 או 647</td></tr><tr><td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>משמש ליצירת תא לח לשחזור זחלים</td></tr></tbody></table>

פשוט neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

ניוון של נוירונים מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית בתגובה על פגיעה, מתח, מחלה. סימפטומים הסלולר של התנוונות העצבית דומים להפליא אצל בני אדם וחסרי חוליות כמו המנגנונים המולקולריים המניעים תהליכים אלה. זבוב הפירות, תסיסנית melanogaster , מספק אורגניזם מודל גנטי פשוט אך פשוט כדי לחקור את המורכבות הסלולרית של מחלות נוירודגנרטיבי. למעשה, כ 70% מכלל גנים אנושיים הקשורים למחלה יש homolog דרוזופילה וכן שפע של כלי מבחנים תוארו באמצעות זבובים כדי לחקור מחלות ניווניות אנושיות. באופן ספציפי יותר הצומת neuromuscular (NMJ) ב תסיסנית הוכיחה להיות מערכת יעילה ללמוד מחלות neuromuscular בגלל היכולת לנתח את הקשרים המבניים בין הנוירון לשריר. הנה, אנו מדווחים על vivo המנוע assay פגיעה נוירון תסיסנית , אשרReproducibly גורם neurodegeneration ב NMJ על ידי 24 שעות. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו רצף זמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך ניוון נוירונים מוטוריים. שיטת הפציעה יש יישומים מגוונים יש גם נוצלו כדי לזהות גנים ספציפיים הדרושים neurodegeneration ו לנתח תגובות תמליל לפציעה העצבית.

באמצעות הנוהל המוצג כאן, יש לנו הוכיח כי פגיעה מכנית העצבית מאפשרת לנתיחה הזמני של אירועים נוירודגנרטיביים. 14 , 18 רצף האירועים כבר מאופיין בעבר ומתחיל עם הפרעה מיידית של השלד, ואחריו פגמים הסחר אקסונל, הצטברות של חלבונים הנמצאים ubiquitinated, ו neurodegeneration הבאים 24 שעות לאחר הפציעה. לפני הפציעה, WT NMJs להראות את האזור presynaptic פעיל סמן ברפ ב אפוזיציה סמן postsynaptic Dlg בכל NM...

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה באופן נרחב לפגוע עצבים סגמנטליים בזחלים תסיסנית לדמיין לכמת neurodegeneration של נוירונים המנוע בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחלים instar השלישי.

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשרות פגיעה מכנית של נוירונים מוטוריים בזחלי Drosophila. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המחקר של מחלות ניוון עצבי, כגון הרצף הכרונולוגי של האירועים התאיים המובילים לניוון עצבי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם עלותה הנמוכה והשימוש בציוד שקיים ברוב המעבדות העובדות עם Drosophila.ההשלכות של טכניקה זו פונות לעבר הבנת המנגנונים המולקולריים המניעים ניוון עצבי. כדי להתחיל את הפרוטוקול, בחרו 10 זחלים בשלב גוזל (instar) שני או שלישי מבקבוקון או מבקבוק של Drosophila המכיל זחלים בשלב גוזל שלישי נודדים שגודלו ב-25 degrees Celsius. השתמשו בפינצטה כדי להרים בזהירות זחלים בודדים באמצעות פינצטה או מכחול, ללא לחיצה עליהם.העבירו ישירות את 10 ה larvae למנתית זכוכית המכילה 1x PBS קר כדי להסיר שאריות מזון ולהאט את תנועת ה larvae. זהו larvae של השלב השלישי (third instar) על פי ה-anterior branch spiracles שלהם, ו-larvae של השלב השני (second instar) על פי גודלם הקטן יותר וה-anterior spiracles הדמויי אלטורה. הניחו כל larva על מכשיר הרדמה ב-CO2.תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, גללו בזהירות כל זחל על גבו כדי להנמיך את העצבים הסגמנטליים לאורך הקוטיקולה. חשוב לגלול בזהירות כל זחל על גבו כדי שניתן יהיה לראות את העצבים הסגמנטליים דרך הקוטיקולה לפני הפגיעה. החל מקרסי הפה, מקמו פינצטה בגודל 5 בערך במחצית עד לשני שלישים מאורך הזחל.לאחר המיקום, צבטו בפינצטה גודל 5 כשליש מהקוטיקולה הוונטרלית המכילה את העצבים הסגמנטליים. כדי להבטיח פגיעה בעצבים הסגמנטליים של הזחלים, הפילו כוח מספיק כדי למעוך את העצבים הסגמנטליים אך השאירו את הקוטיקולה שלמה. כדי לקבוע את כמות הכוח הנכונה, מעכו 10 זחלים וודאו ששיעור התמותה לאחר חמש שעות הוא נמוך מ-50%. לאחר הפגיעה, העבירו בזהירות את הזחלים לצלחת אגר של מיץ פירות המכילה כ-0.5 גרם של משחת שמרים.הניחו כל זחל כך שקצהו הקדמי נמצא על משחת השמרים להמשך האכלה. הניחו צלחות אגר המכילות משחת שמרים ו-10 זחלים פגועים בתחתית של צלחת פטרי ריקה בגודל 100 על 15 מילימטר. כסו את צלחת הפטרי בנייר סופג לח, תוך וידוא שנייר הסופג אינו נוגע בזחלים או בצלחות האגר.לאחר מכן, הניחו את פטריית הפטרי בתוך מכל אטום בטמפרטורת החדר. לבסוף, הוציאו את הזחלים לצורך נתיחה לאחר פרקי זמן מוגדרים מהפציעה. לפני הפציעה, חיבורים עצביים-שריריים (neuromuscular junctions, או NMJs) מסוג wild-type מראים את סמן האזור הפעיל הפרסינפטי Brp בסמיכות לסמן הפוסטסינפטי Dlg לאורך ה-NMJ כולו.פגיעה מכנית של עצבים סגמנטליים עלולה להוביל לניוון עצבי בינוני עד חמור, שבו כפתורים שצבעו עם Dlg חסרים כעת את החלבון Brp של האזור הפעיל הפרה-סינפטי. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים הלומדים פגיעות נוירונליות לבחון את הרצף הכרונולוגי של האירועים התאיים המובילים לניוון העצבי בחיבור העצבי-שרירי ב-Drosophila.

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

צומת נוירומוסקולרי דרוזופילה (NMJ) משמש כמודל לחקר המורפולוגיה והתפקוד של סינפסות. סרטון זה מתאר תכונות חשובות שהחוקרים מכמתים כדי לאפיין את NMJ. הפרוטוקול לדוגמה מדגים תוכנה המסוגלת לבצע את הכימות באופן אוטומטי.

דרוזופילה כימות צומת נוירומוסקולרי (NMJ): שיטה להערכת מורפולוגיה ותפקוד סינפטיים

סרטון זה מתאר אבלציה של אקסונים בלייזר דו-פוטוני בזחל Drosophila melanogaster ופרוטוקול לדוגמה לגרימת פציעה ותמונה של אתר הפגיעה.

פגיעה עצבית הנגרמת על ידי לייזר בשני פוטונים: שיטה לצפייה בניוון והתחדשות אקסונים בזחלי דרוזופילה

הסרטון מדגים גרימת ניוון עצבי בעצבים סגמנטליים של זחל דרוזופילה  באמצעות פגיעה מכנית. הציפורן הגחונית של זחלים מורדמים נצבטת באמצעות מלקחיים כדי לגרום לפגיעה בעצבים הסגמנטליים. הזחלים הפגועים נשמרים עם מזון, מה שמאפשר לפגיעה לגרום לניוון של הנוירונים המוטוריים בעצבים, ולגרום להפרעה בצמתים העצביים-שריריים שלהם (NMJs).

פגיעה מכנית בזחלי דרוזופילה עצבים סגמנטליים כדי לגרום לניוון עצבי

סרטון זה מדגים פרוטוקול להערכת השלמות המבנית של צמתים עצביים-שריריים בשרירי האורך הגביים של דרוזופילה. ההליך כולל צביעת נוירונים ושרירים בשני נוגדנים נפרדים והשוואת דפוסי פלואורסצנטיות בין זבובים מוטנטיים לזבובי בר. הפחתה בכתמים עצביים בזבובים מוטנטיים מצביעה על ניוון עצבי, בעוד מבנה השריר נשאר שלם.

הערכת השלמות המבנית של הצמתים העצביים-שריריים האורכיים הגביים בדרוזופילה

הפרדיגמה פציעה באמצעות כבל עצב גחון תסיסנית הזחל לחקור התחדשות במערכת עצבים מרכזיות ותיקון מתואר. דקירה ואחרי סריקת הליזר מיקרוסקופיה confocal בדגימות זמן לשגות וקבועים, בשילוב עם ניתוח הכמותי עם תוכנה שפותחה בתכליתיות וגנטיקה, משמשת כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול שימוש דרוזופילה נוירון חישה - דנדריטים arborization (da) נוירון פציעה דגם, אשר משלב ויוו לחיות הדמיה, שני הפוטונים לייזר axotomy/dendriotomy ואת הכלים גנטי לטוס עוצמה, פלטפורמה לסינון היזמים הפוטנציאליים, מעכבי של neuroregeneration.

מודל פציעה דרוזופילה In Vivo ללמוד Neuroregeneration ב ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע שלושה המושרה הנגרמת לפציעה מניוון (אקסון מוות) בחני ילה melanogaster כדי להעריך את השימור מורפולוגית ופונקציונלית של אקסונים קטוע הסינפסות שלהם.

הערכה מורפולוגית ופונקציונלית של Axons וסינפסות שלהם במהלך מוות Axons בדרוסופילה מלאנוסטר

המטרה של הליך זה היא לנתח את רקמת שריר האורך גב (DLM) כדי להעריך את השלמות המבנית של צמתים עצביים שריריים DLM (NMJs) במודלים של מחלות ניווניות באמצעות מלנוגסטר Drosophila.

הדמיה ניוון סינפטי ב דרוזופילה למבוגרים בשיתוף עם ניוון עצבי

אנו מתארים טכניקת ניתוח המשמרת את הארכיטקטורה של הצומת הנוירו-שרירי ומאפשרת מחקר אימונוציטוכימי מפורט של נוירונים מוטוריים ברגלו הבוגרת של דרוסופילה .

ניתוח ואימונוהיסטוכימיה של הרגל הבוגרת של דרוסופילה לזיהוי שינויים בצומת הנוירו-שרירי עבור נוירון מוטורי מזוהה

למד שיטה פשוטה לפציעה מכנית של עצבים סגמנטליים בזחלי Drosophila לחקר ניוון נוירונים מוטורים. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות של ניוון עצבי בחיבור הנוירומוסקולרי ומספקת כלי נגיש לחקר מנגנוני ניוון עצבי.

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד

גלה סרטונים נוספים