בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את המיקום, השפע והפנוטיפ של תאי T חיוביים CD8 ספציפיים לאנטיגן בתוך רקמות מעניינות. שיטה זו עוזרת לענות על שאלות מהירות על תאי CD8 T על ידי מתן אמצעי לאיתור, כימות ופנוטיפ כמעט כל תא CD8 T ספציפי לאנטיגן וכל רקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לקבוע את ההתפלגות המרחבית של תאי T חיוביים CD8 ספציפיים לאנטיגן ביחס לתאים ומבנים אחרים בתוך רקמות מעניינות.

מי שתדגים את ההליך עם שנגבין לי תהיה גוואנטווה מווקלונדווה. ביום הראשון של ההליך, השתמש באזמל כדי לחתוך את הרקמה הטרייה לחתיכות בגודל של כ-0.5X0.5 סנטימטר. כאן מוצגת רקמת טחול מקוק רזוס.

הדביקו בנפרד כל שבר רקמה באמצע החלק העליון של בוכנה והטמיעו את הדגימות בשלושה עד חמישה מיליליטר של אגרוז נמס נמוך חם של 4% ב-PBS. סמן את הבוכנות במידע הרקמה הרלוונטי. לאחר מכן, הניחו את הדגימות במחזיק צונן בדלי קרח.

כאשר האגר התמצק, הפעל את המיקרוטום והגדר את הגדרת העובי ל-200 מיקרומטר. לאחר התקנת סכין גילוח חדש, הכנס את הבוכנות לאמבט המיקרוטום. מלאו את אמבט המיקרוטום ב-100 עד 200 מיליליטר PBS-H טרי והוסיפו קוביות קרח PBS-H כדי לשמור על הטמפרטורה בין אפס לשתי מעלות צלזיוס.

לאחר השגת חתכים של 200 מיקרומטר, השתמש במברשת צבע כדי להסיר את האגר המקיף כל קטע ולהעביר את הדגימות לתאי רקמות בודדים בתוך בארות בודדות של צלחת תרבית רקמות של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של PBS-H צונן. לאחר שכל הדגימות נרכשו, דגרו את חלקי הרקמה למשך הלילה במיליליטר אחד של טטרמרים MHC מצומדים טעונים בפפטיד בהתאמה, מדוללים ב-PBS-H בתוספת סרום עיזים רגיל של 2% בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה. למחרת בבוקר, העבירו כל תא רקמות לבארות בודדות של צלחת חדשה של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של PBS-H צונן טרי למשך 20 דקות.

לאחר הכביסה השנייה, יש לתקן את החלקים במיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד טרי למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שתי שטיפות של חמש דקות ב-PBS-H קר. מעבירים את החלקים לצלחת חדשה של 24 בארות המכילה 0.01 אוריאה מולרית ומחממים את החלקים במיקרוגל שלוש פעמים למשך כ -10 שניות בכל פעם עד שהאוריאה רותחת.

כדי לחלחל ולחסום את הדגימות, דגרו את החלקים בתמיסת חסימה המכילה PBS-H בתוספת חומר ניקוי 0.3% טריטון x100 ו-2% סרום עיזים רגיל על נדנדה למשך שעה, בארבע מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, העבירו את תאי הרקמה לבארות בודדות של צלחת חדשה של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של תמיסה המכילה נוגדן אנטי-פיטק ארנב, נוגדן CD אנטי-אנושי לעכבר ונוגדני CD3 אנטי-אנושי לעכברושים. דגרו את הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה.

ביום השלישי יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים ב-PBS-H טרי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות בכל שטיפה ולבצע דגירה סופית עם הנוגדנים המשניים המצומדים הקרינה המתאימים למשך עד שלושה ימים, מוגנים מפני אור. בתום הדגירה השלישונית, שטפו את הדגימות בשלוש שטיפות של 20 דקות ב-PBS-H טרי והשתמשו במברשת צבע כדי להעביר את הדגימות מכל תא רקמה לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. מצפים כל חלק במדיום הרכבה בתוספת חומר משמר פלואורופור ומכסים את הדגימות בתלוש כיסוי.

לאחר מכן, אחסן את השקופיות במיכל שקופיות מוגן באור, בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. ביום ההדמיה, הנח את השקופית הראשונה על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי ובחר את הלייזרים והמסננים המתאימים לכל פלואורופור המשמש לתיוג דגימת הרקמה. באמצעות המטרה פי 20, השג ברצף סדרת z במרווחים של שלושה מיקרון בכל אחד מערוצי הפלואורופור, בשדות מרובים של 800 x 800 פיקסלים.

לאחר מכן, בנה מונטאז' של השדות שנאספו ושמור כל תמונת מונטאז' עם שם המבוסס על דגימת הרקמה המתאימה. בתמונות מייצגות אלה, קטע מוכתם בטטרמרים מסוג MHC מסוג 1 טעון בפפטיד SIV מושווה לקטע מאותה רקמה, מוכתם בטטרמרים מסוג MHC מסוג 1 טעונים בפפטיד לא רלוונטי, מה שמדגים את הספציפיות של צביעת הטטרמר. בתמונות אלה, תאי ה-T הספציפיים לנגיף צבועים בטטרמר MHC מסוג 1 טעונים בפפטיד SIV, כתמים משותפים ל-CD8, סמן תת-קבוצה של תאי T אך לא CD20, חלבון פני התא המתבטא בתאי B.

מונטאז' זה נוצר עבור מספר שדות קונפוקליים מסדרת z, ששימשו לכימות של תאים מוכתמים בטטרמר עם פנוטיפים ספציפיים ותאים אנטומיים שונים בבלוטת הלימפה. תמונה מוגדלת זו מדגישה אזור בבלוטת הלימפה המונטאז' המכיל זקיק תאי B המתוחם על ידי צביעת IGM. ניתן לזהות תאים מוכתמים בטטרמר MHC Class One, שחלקם ביטאו במשותף את סמן ההפעלה וההתפשטות של תאי T, KI67 בתוך ומחוץ לזקיק תאי B.

שילוב צביעה זה מאפשר לקבוע את סטטוסי ההפעלה וההתפשטות של תאי T חיוביים ל-CD8 ספציפיים ל-SIV, כמו גם את מיקומם ברקמות לימפה משניות. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כחמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שרקמה טרייה היא קריטית לצביעה מוצלחת.

עבדו את הדגימות תוך 24 שעות או פחות לאחר הקטיף, ושמרו אותן מקוררות עד לקיבוע. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע צביעת טטרמר ואימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את המיקום, השפע והפנוטיפ של תאי T חיוביים CD8 ספציפיים לאנטיגן ברקמות מעניינות. אל תשכח שעבודה עם גורמים זיהומיים עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות למניעת חשיפה כגון לבישת ציוד ההגנה האישי המתאים והגבלת השימוש בחפצים חדים בעת ביצוע הליך זה.