בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לקבוע את המיקום, השכיחות והפנוטיפ של תאי T חיוביים ל-CD8 הספציפיים לאנטיגן בתוך רקמות העניין. שיטה זו מסייעת במתן תשובות מהירות לשאלות לגבי תאי T CD8 על ידי אספקת אמצעים לאיתור, כימות ואפיון פנוטיפי של כמעט כל תא T CD8 ספציפי לאנטיגן ובכל רקמה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לקבוע את ההפצה המרחבית של תאי T חיוביים ל-CD8 הספציפיים לאנטיגן ביחס לתאים ומבנים אחרים בתוך רקמות העניין.

Gwantwa Mwakalundwa יעגנ להדגמת הפרוצדורה עם Shengbin Li. ביום הראשון של הפרוצדורה, השתמש בסקלפל כדי לחתוך את הרקמה הטריה לחתיכות של כ-0.5 x 0.5 סנטימטר. כאן מוצגת רקמת טחול של קוף רזוס (rhesus macaque).

הדביקו בנפרד כל פרגמנט רקמה למרכז החלק העליון של בוכנה (plunger) והטמיעו את הדגימות ב-3 עד 5 מיליליטר של 4% low melting agarose חמים ב-PBS. סמנו את הבוכנות עם פרטי הרקמה הרלוונטיים. לאחר מכן, הניחו את הדגימות במחזיק מקורר בתוך דלי קרח.

כאשר האגר התגבש, הפעילו את המיקרוטום והגדירו את עובי הפרוסה ל-200 micrometers. לאחר התקנת להב תער חדש, הכניסו את הבוחנים (plungers) לאמבט המיקרוטום. מלאו את אמבט המיקרוטום ב-100 עד 200 milliliters של PBS-H שהוכן טרי, והוסיפו קוביות קרח של PBS-H כדי לשמור על טמפרטורה שבין אפס לשתי מעלות celsius.

לאחר השגת חתכים בעובי 200 micrometer, השתמש במברשת צבע כדי להסיר את האגר מסביב לכל חתך והעבר את הדגימות לתאי רקמה בודדים בתוך בארות בודדות של פלטת תרבית רקמה בעלת 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של PBS-H מקורר. כאשר כל הדגימות נאספו, הדגר את חתכי הרקמה למשך הלילה במיליליטר אחד של MHC class one tetramers טעונים בפפטיד מצומד מתאים, המדולל ב-PBS-H מועשר ב-2% normal goat serum בטמפרטורה של ארבעה degree celsius תוך כדי נדנוד. למחרת בבוקר, העבר כל תא רקמה לבארות בודדות בפלטת 24 בארות חדשה המכילה מיליליטר אחד של PBS-H טרי ומקורר למשך 20 דקות.

לאחר השטיפה השנייה, קבעו את החתכים במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde טרי למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו שתי שטיפות של חמש דקות ב-PBS-H קר. העבירו את החתכים לפלטת 24 בארות חדשה המכילה urea בריכוז 0.01 molar וחממו את החתכים במיקרוגל שלוש פעמים, כ-10 שניות בכל פעם, עד לרתיחת ה-urea.

כדי להחדיר חומרי חדירה ולחסום את הדגימות, דגרו את החתכים בתמיסת חסימה המכילה PBS-H מועשר ב-0.3% triton x100 וב-2% normal goat serum על מכשיר נדנדה למשך שעה אחת, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. בסיום הדגירה, העבירו את תאי הרקמה לבארות נפרדות של פלטת 24 בארות חדשה המכילה מיליליטר אחד של תמיסה הכוללת נוגדן rabbit anti-fitc, נוגדן mouse antihuman CD ונוגדן rat antihuman CD3. דגרו את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם נדנוד.

ביום השלישי, שטפו את החתכים שלוש פעמים ב-PBS-H טרי בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות לפחות לכל שטיפה, ובצעו אינקובציה סופית עם נוגדנים שניוניים בעלי צימוד פלואורסצנטי מתאימים למשך עד שלושה ימים, תוך הגנה מאור. בסיום האינקובציה עם הנוגדנים השלישוניים, שטפו את הדגימות בשלושה סבבי שטיפה של 20 דקות ב-PBS-H טרי, והשתמשו במברשת צבע כדי להעביר את הדגימות מכל תא רקמה אל על עליית מיקרוסקופ מזכוכית. מרחו על כל חתך תסכימי ריכוך (mounting medium) המועשר בחומר משמר לפלואורופור, וכסו את הדגימות בכיסוי זכוכית (cover slip).

לאחר מכן, אחסנו את השקופיות במיכל שקופיות מוגן מאור, בטמפרטורה של 20 degrees celsius. ביום הדמיה, הניחו את השקופית הראשונה על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי ובחרו בלייזרים ובמסננים המתאימים לכל פלואורופור ששימש לסמימן דגימת הרקמה. באמצעות עדשה אובייקטיבית 20x, השגיחו ברצף סדרת z במרווחים של three micron בכל אחד מערוצי הפלואורופור, במספר שדות של 800 x 800 pixel.

לאחר מכן, בצעו הרכבה (montage) של השדות שנאספו ושמרו כל תמונת הרכבה בשם המבוסס על דגימת הרקמה המתאימה. בתמונות נציגות אלו, נסניט שנצבע עם טטרמרים של MHC class one הטעונים בפפטיד SIV מושווה לנסניט מאותה רקמה, שנצבע עם טטרמרים של MHC class one הטעונים בפפטיד לא רלוונטי, ובכך מודגמת הספציפיות של צביעת הטטרמר. בתמונות אלו, תאי T ספציפיים לנגיף שנצבעו עם טטרמר של MHC class one הטעון בפפטיד SIV, מראים צביעה משולבת ל-CD8, סמן של תת-אוכלוסיית תאי T, אך לא ל-CD20, חלבון פני שטח המובע בתאי B.

מונטאז' זה נוצר עבור מספר שדות של סדרות z במיקרוסקופ קונפוקלי, אשר שימשו לכימות של תאים שצבעו בטטראמר בעלי פנוטיפים ספציפיים ובמדורים אנטומיים שונים בבלוטת הלימפה. תמונה מוגדלת זו מדגישה אזור במונטאז' של בלוטת הלימפה המכיל זקיק של תאי B המוגדר על ידי צביעת IGM. תאים שצבעו בטטראמר של MHC class one, שחלקם ביטאו במקביל את KI67, סמן להפעלה ולשכפול של תאי T, ניתנים לזיהוי בתוך ומחוץ לזקיק תאי ה-B.

שילוב צביעות זה מאפשר קביעה של מצבי ההפעלה והשכפול של תאי T חיוביים ל-CD8 הספציפיים ל-SIV, כמו גם את מיקומם בתוך רקמות לימפואידיות משניות. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה בערך בחמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי רקמה טרייה היא קריטית להצלחת הצביעה.

יש לעבד את הדגימות בתוך 24 שעות או פחות לאחר הקציר, תוך שמירה עליהן בקירור עד לקיבוע. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע צביעת טטראמר ואימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את המיקום, השפע והפנוטיפ של תאי T חיוביים ל-CD8 הספציפיים לאנטיגן ברקמות הרלוונטיות. זכרו כי עבודה עם גורמים זיהומיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות למניעת חשיפה בעת ביצוע הליך זה, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים והגבלת השימוש במכשירים חדים.