לייזר מונחה אטלס סטיאוטטי ללכוד את Microdissection של אזורים במוח מושפע פציעה טראומטית

המטרה הכוללת של פרוטוקול מיקרודיסקציה זה של לכידת לייזר היא לאסוף תאים מאזורים ספציפיים במוח המושפעים מפגיעה מוחית טראומטית לצורך ניתוח מולקולרי. אני דוקטור הלן הלמיץ'. עוזר התואר השני שלי, האריס וייס, שהוא סטודנט בתוכנית לפתופיזיולוגיה אנושית ורפואה תרגומית כאן בשלוחה הרפואית של אוניברסיטת טקסס, הולך להדגים כיצד אנו משתמשים בשיטות מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר במחקרי פגיעות המוח שלנו.

שיטה זו יכולה לסייע להבהיר את המנגנונים וההשלכות של שינויים שנגרמים על ידי TBI באזורי מוח נפרדים, כמו למשל קליפת המוח הקדמית, ששולטת בתפקודים ניהוליים. וההיפוקמפוס שחשוב לתהליכים תלויי זיכרון. היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שאנו יכולים לחקור את ההשפעה של תהליך מחלה על כמה אזורים נפרדים במוח או על סוגי תאים בודדים מאותו המוח.

לפני כל הליך LCM לפני שכולל ניתוח שעתוק, נקה את כל המשטחים עם חומר ניקוי מבטל RNace כדי להפחית את הסיכון לזיהום ופירוק RNA. אחזר את רקמת המוח מהאחסון. ומניחים בסירוסטט מקורר למינוס 20 מעלות צלזיוס.

אפשר למוח להתאזן לטמפרטורת תא הקריוסטט למשך כעשר דקות. הנח את המוח, צד הגחון כלפי מעלה, על יריעת גזה על גבי שלב הקריוסטט. בעזרת סכין גילוח RNA נקי חתכו את החלק האחורי רק למוח הקטן ואת החלק הקדמי לכיאזמה האופטית.

הנח כמות קטנה של מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית בשתי תבניות קריו נפרדות. הנח את המוח המכיל את קליפת המוח האסוציאטיבית הקדמית וליבת גרעין האקומבנס לתבנית קריו אחת שהצד הפנימי שלה כלפי מטה. הוסף מספיק מדיום OCT כדי לכסות את הרקמה.

חזור על שלב זה עם פיסת רקמת המוח המכילה את ההיפוקמפוס והגרעין הסופרכיאזמטי. אפשר למדיום OCT לקפוא לחלוטין למשך כ-20 דקות בקריוסטט. לאחר שהרקמה ומדיום ה-OCT קפואים לחלוטין, סחטו כמות קטנה של OTC על ראש הרכבה.

לחץ על קריומולד קפוא על ראש ההרכבה ואפשר ל-OCT לקפוא לחלוטין כך שהתבנית המכילה את הרקמה מחוברת היטב לראש. אבטח את חיבור הראש לתושבת החיתוך והדק את הבורג. כוונן את זווית החיתוך ביחס ללהב הקריוסטט עם ידיות הכוונון כדי להבטיח שהחלקים ייחתכו באופן שווה.

הגדר את עובי הקטע ל -30 מיקרון. כאשר חותכים את גוש הרקמה המכיל את ההיפוקמפוס וה-SEN, חתכו עד שהכיאזמה האופטית שטוחה בברגמה של 0.48 מילימטר כאשר החדר השלישי מתגלה. לאחר מכן אסוף קטעים עבור ה- SEM מנקודה זו על ידי הנחת שקופיות ממברנת פוליאתילן נפתלט בטמפרטורת החדר על גבי הרקמה החתוכה.

הקפידו חזותית על היצמדות לשקופית על ידי אישור שהרקמה וה-OTC נמסו לחלוטין על המגלשה. אחסן את כל השקופיות עם חלקי רקמה בקריוסטט עד לצביעה. עצור את קטעי האיסוף בברגמה 0.72 מילימטרים כאשר מתחילה הדקורסיה העל-אופטית.

לאיסוף היפוקמפוס, חתך עד שהקרניים של פיתול משוננים של שכבת תאי הגרגיר נראות בברגמה 3.00 מילימטרים. אסוף קטעים עד ששדות המשנה של CA בהיפוקמפוס מתמזגים בחלקי העטרה בברגמה 4.78 מילימטרים. זה מאפשר איסוף מלא של ההיפוקמפוס מתחת לגולגולת ואתר הפציעה.

לפני הצביעה, שטפו את כל כלי הכלים ואת אזור הצביעה בקולט אדים כימי עם חומר ניקוי מבטל RNase. קח את מתלה הצדדים מהקריוסטט והניח במכסה האדים. הניחו לשקופיות להתחמם למשך 30 שניות.

מכתימים את החלקים בסגול קרסיל וצלולים במי מלח. הניחו למתלה השקופיות המוכתמות להתייבש באוויר לא יותר מעשר דקות בטמפרטורת החדר במכסה האדים. לאחר הייבוש, המשך מיד ל-LCM.

לפני תחילת כל הליך LCM לניתוח RNA, נגב את אזור האיסוף ואת האזור סביב המכשיר עם חומר ניקוי מבטל RNAse ואתנול 100%. הפוך את מתג ההפעלה ביחידת ייצור הלייזר infared לפני הפעלת בסיס המיקרוסקופ ואפשר למערכת לאתחל לפני הפעלת התוכנה משולחן העבודה. לאחר אתחול התוכנה והפעלתה, למרות שלבי האתחול שלה, פתח את לוח הגדרת התוכנה ולחץ על כפתור ה-stage הנוכחי.

השלב המודולרי יעבור למצב שבו מכסי מאקרו ושקופיות LCM נטענים ופורקים. הנח עד שלוש שקופיות קרום עט לתוך המחזיקים כשהקצה החלבי פונה ימינה. בחר את אזור הטיפול במכסה ובהחלקה לצד השקופית המתאימה ולחץ על תיבת הסימון MEM כדי להודיע לתוכנה ששקופיות זכוכית ממברנה נטענו.

לאחר מכן לחץ על השקופית הרצויה שתצולם תחילה. כדי ללכוד תמונה באריחים עבור מיקום רקמה וכיוון עבור מיקומי כובע, בחר תמונה בסרגל הכלים ובחר Acquire Overview. מקם את הסמן מעל האזור בתמונת הפריחים, לחץ לחיצה ימנית ובחר Place Cap at the Region Center.

התוכנה תציב אוטומטית מכסה מעל המיקום שנבחר. לאחר איתור לייזרי האינפרא אדום וה-UV, בחר באפשרות הציור ביד חופשית בחלונית הכלים הנבחרים. באמצעות חרט מסך מגע, צייר סביב היקף אזור העניין תוך הקפדה לא לאבד מגע בין מסך המגע לראש החרט.

הקפד לחבר את נקודות ההתחלה והסיום יחד. לאיסוף היפוקמפוס, לכידת לייזר של תת-שדות ההיפוקמפוס CA1, CA2 ו-CA3 החל מברגמה 3.00 מילימטרים ותוך שימוש בשכבה הגרגירית שנוצרה לחלוטין של הבליטה המשוננת כציון דרך פיזי של זיהוי מורפולוגי. לאחר האיסוף, העבר את מכסי המאקרו של LCM למצב QC ובדוק אם יש היצמדות מלאה של הרקמה על ידי הבטחה חזותית שהרקמה החתוכה UV מחוברת לממברנה.

הכרחי שלייזר ה-UV יחתוך סביב כל הרקמה. כישלון לעשות זאת יגרום להיצמדות רקמה לא שלמה למכסה ה-LCM. לאחר מכן הנח במהירות כל מכסה לתוך צינור תגובה דק ללא RNAse של 0.5 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר של מאגר ליסוס תאים.

מערבל את הדגימות לזמן קצר כדי להבטיח ליסוס מלא ומאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לבצע ניתוח גנומי במורד הזרם. להלן תמונות מייצגות של קטעי רקמה שנאספו מהצד האפסילטרלי של אתר הפציעה עם פונקציות לייזר אינפרא אדום ו-UV במערכת LCM. זהו אזור בקליפת המוח האסוציאטיבית הקדמית.

תמונה זו מציגה את אותו אזור לאחר האיסוף. וזו הרקמה על הכובע לאחר האיסוף. תמונה זו מציגה את מרכיבי השכבות הפרה-מיטליות CA1, CA2 ו-CA3 של ההיפוקמפוס הממוקמים ליד הקרניים שנוצרו במלואן של השכבה הגרגירית של הפיתול המשונן.

אזורי CA2 ו-CA3 נאספו ואוכלוסיות התאים הללו נראות על הכובע. כאן, אזור של גרעין האקומבנס הליבה הפרוקסימלי אדרוסטרלי לקומיסורה הקדמית שכוון אליו השתחזר בנאמנות על הכובע. לבסוף, הגרעין הסופרכיאזמטי הרוסטרלי לכיאזמה העל-אופטית נלכד על ידי LCM לאחר TBI.

לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לעבד מוח אחד תוך כשמונה שעות. זה כולל עיבוד רקמות, צביעה ו-LCM. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו ניתוח אפיגנטי כדי לענות על שאלות הנוגעות לדפוסי מתילציה או ביטוי מיקרוני.

אחרי הצפייה בסרטון הזה אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע LCM על כמה אזורים במוח באותו המוח.