לייזר מונחה אטלס סטיאוטטי ללכוד את Microdissection של אזורים במוח מושפע פציעה טראומטית
11 בספטמבר 2017
אנו מתארים את השימוש בלייזר microdissection לכידת להשיג דגימות של אוכלוסיות תאים נפרדים של אזורים שונים במוח עבור ג'ין וניתוח microRNA. טכניקה זו מאפשרת חקר ההשפעות דיפרנציאלית של פגיעה מוחית טראומטית באזורים ספציפיים של המוח חולדה.
המטרה הכללית של פרוטוקול מיקרו-דיסקציה בשבירה בלייזר (Laser Capture Microdissection) זה היא לאסוף תאים מאזורי מוח ספציפיים שהושפעו מפגיעה מוחית טראומטית לצורך אנליזה מולקולרית. אני ד"ר הלן הלמיש. עוזר המחקר שלי, האריס וייס, סטודנט בתוכנית לפתופיזיולוגיה אנושית ורפואה תרגומית כאן בבית החולים של אוניברסיטת טקסס (University of Texas medical branch), ידגים כיצד אנו משתמשים בשיטות של מיקרו-דיסקציה בשבירה בלייזר במחקרי פגיעות מוחיות שלנו.
שיטה זו עשויה לסייע בהבהרת המנגנונים וההשלכות של שינויים הנגרמים על ידי TBI באזורי מוח נפרדים, כגון הקורטקס הפרונטלי, השולט בפונקציות ביצועיות, וההיפוקמפוס, החשוב לתהליכים תלויי זיכרון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לבחון את השפעת תהליך מחלה על מספר אזורי מוח נפרדים או על סוגי תאים בודדים מאותו מוח.
לפני כל הליך LCM הכולל אנליזה של שעתוק (transcriptional analysis), נקה את כל המשטחים באמצעות חומר ניקוי המסיר RNase כדי להפחית את הסיכון לזיהום ולפירוק RNA. הוצא את רקמת המוח מהאחסון והנח אותה בתוך קריוסטט שקולל ל-minus 20 °C.
אפשרו למוח להגיע לשיווי משקל עם הטמפרטורה של תא הקריוסטט למשך כעשר דקות. הניחו את המוח, כאשר הצד הוונטרלי פונה למעלה, על גבי גיליון גזה שעל במה הקריוסטט. בעזרת להב תער נקי ל-RNA, חתכו את החלק האחורי מיד רוסטרלי למוח הקטן (cerebellum) ואת החלק הקדמי מיד לפני הצטלבות העצבים האופטיים (optic chiasm).
הניחו כמות קטנה של מדיום לחיתוך בטמפרטורה אופטימלית (optimal cutting temperature medium) לשני תבניות קריו נפרדות. הניחו את המוח המכיל את קליפת המוח הקדמית (frontal association cortex) ואת גרעין nucleus accumbens core לתוך תבנית קריו אחת, כאשר הצד הפנימי פונה כלפי מטה. הוסיפו מספיק מדיום OCT כדי לכסות את הרקמה.
חזור על שלב זה עם נתח רקמת המוח המכיל את ההיפוקמפוס ואת הגרעין העל-כיאזמטי (suprachiasmatic nucleus). המתן עד שתווך ה-OCT יקפא לחלוטין למשך כ-20 דקות בקריוסטט. לאחר שרקמה ותווך ה-OCT קפאו לחלוטין, לחץ כמות קטנה של OTC על ראש הרכבה.
הצמד תבנית הקפאה (cryomold) קפואה אל ראש ההרכבה והמתן עד שה-OCT יקפא לחלוטין, כך שהתבנית המכילה את הרקמה תהיה מחוברת בבטחה לראש. חבּר את ראש ההרכבה למעמד החיתוך והדק את הבורג. כוונן את זווית החיתוך ביחס ללהב הקריוסטט באמצעות ידיות הכוונון כדי להבטיח שהחתכים ייחתכו באופן אחיד.
הגדירו את עובי הנתח ל-30 מיקרון. בעת חיתוך בלוק הרקמה המכיל את ההיפוקמפוס ואת ה-SEN, המשיכו בחיתוך עד שהצולב האופטי (optic chiasm) ייflatten ב-bregma 0.48 מילימטר, כאשרו הiventricle השלישי הופך גלוי. לאחר מכן, אספו נתחים עבור ה-SEM מנקודה זו על ידי הנחה עדינה של סליידי ממבrane פוליאתילן נפתלנאט בטמפרטורת החדר מעל הרקמה שנחתכה.
ודאו ויזואלית את ההיצמדות לסלייד על ידי אישור שהרקמה וה-OTC נמסו לחלוטין על גביו. אחסנו את כל הסליידים עם חתכי הרקמה בקריוסטט עד לצביעה. הפסיקו את איסוף החתכים ב-bregma 0.72 millimeters כאשר ה-supraoptic decussation מתחיל.
לאסוף את ההיפוקמפוס, יש לבצע חיתוכים עד להופעת הקרניים של שכבת תאי הגרנולות של הג'יירוס המשונן (dentate gyrus) בברגמה 3.00 מילימטרים. יש לאסוף חיתוכים עד להיתוך תתי-השדות של CA בהיפוקמפוס בחיתוכים קורונליים בברגמה 4.78 מילימטרים. פעולה זו מאפשרת איסוף מלא של ההיפוקמפוס תחת אתר הקרניאוטומי והפגיעה.
לפני הצביעה, יש לשטוף את כל כלי המעבדה ואת אזור הצביעה בתוך מapay חולקים כימיים בעזרת דטרגנט המסיר RNase. הוצא את מדף השקפים מהקריוסטט והנח אותו במapay החולקים. המתן 30 שניות עד שהשקפים יתחממו.
צבע את החתכים ב-cresyl violet והבהר באמצעות תמיסת סלין. הנח למסגרת השקופיות הצבועות להתייבש באוויר למשך לא יותר מעשר דקות בטמפרטורת החדר בתוך מ extracts המנדף. לאחר הייבוש, המשך מיד ל-LCM.
לפני תחילת כל הליך LCM לצורך ניתוח RNA, נגבו את אזור האיסוף ואת האזור שסביב המכשיר באמצעות דטרגנט להסרת RNAse ו-100% ethanol. הפעילו את מתג החשמל ביחידה המייצרת לייזר אינפרה-אדום לפני הדלקת בסיס המיקרוסקופ, והמתינו לאתחול המערכת לפני הפעלת התוכנה משולחן העבודה. לאחר שהתוכנה עלתה ועברה את שלבי האתחול, פתחו את פאנל ההגדרות של התוכנה ולחצו על כפתור present stage.
הבמה המודולרית תזוז למיקום שבו ניתן להטעין ולפרוק מכסי מאקרו ושקופיות LCM. מקמו עד שלוש שקופיות ממברנה במחזיקים, כאשר הקצה המט האפור פונה ימינה. בחרו את אזור הטיפול במכסים ובשקופיות לצד השקופית הרלוונטית וסמנו את תיבת הבחירה MEM כדי להודיע לתוכנה שטוענו שקופיות זכוכית ממברנה.
לאחר מכן, לחצו על השקף הרצוי לצילום ראשון. כדי לצלם תמונה מורכבת ממרצעות (tiled image) לצורך קביעת מיקום הרקמה והכיוון עבור הצבת מכסות (caps), בחרו ב-image בסרגל הכלים ובחרו ב-acquire overview. הניחו את הסמן מעל האזור בתמונה המורכבת, לחצו לחיצה ימנית ובחרו ב-place cap at region center.
התוכנה תניח באופן אוטומטי כיסוי מעל המיקום שנבחר. לאחר איתור לייזרי האינפרא-אדום וה-UV, בחרו באפשרות השרטוט החופשי (freehand drawing) בחלונית בחירת הכלים. באמצעות עט למסך מגע, שרטטו מסביב להיקף של אזור העניין (region of interest), תוך הקפדה על שמירה על מגע רציף בין מסך המגע לראש העט.
ודאו שנקודות ההתחלה והסיום מחוברות זו לזו. לאיסוף מההיפוקמפוס, בצעו לכידה בלייזר (laser capture) של תתי-השדות CA1, CA2 ו-CA3 של ההיפוקמפוס, החל מ-bregma 3.00 millimeters, תוך שימוש בשכבה הגרנולרית השלמה של ה-dentate gyrus כסימן פיזי לזיהוי מורפולוגי. לאחר האיסוף, העבירו את מכסות המקרו של ה-LCM לעמדת ה-QC ובדקו את ההצמדות המלאה של הרקמה על ידי וידוא ויזואלי שהרקמה שנחתכה ב-UV מחוברת לממברנה.
חובה להבטיח שלייזר ה-UV יבצע חיתוך מסביב לכל שטח הרקמה. אי-ביצוע פעולה זו יוביל להיצמדות חלקית בלבד של הרקמה למכסה ה-LCM. לאחר מכן, העבירו במהירות כל מכסה לתוך מבחנת תגובה בעלת דפנות דקות בנפח 0.5 milliliter, נקייה מ-RNAse, המכילה 100 microliters של בופר לליסיס של תאים.
יש לערבל את הדגימות ב-Vortex לזמן קצר כדי להבטיח ליסיס מלא, ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לביצוע ניתוח גנומי המשכי. להלן תמונות מייצגות של חתיכות רקמה שנאספו מהצד האפיסילטרלי (epcilateral) של אתר הפגיעה באמצעות פונקציות לייזר באינפרה-אדום ו-UV במערכת ה-LCM. זהו אזור בקליפת המוח הפרונטלית האסוציאטיבית.
תמונה זו מציגה את אותו האזור לאחר האיסוף. וזוהי הרקמה על המכסה לאחר האיסוף. תמונה זו מציגה את הרכיבים של השכבות הפרמטליות CA1, CA2 ו-CA3 של ההיפוקמפוס הממוקמות לצד הקרניים שנוצרו במלואן של השכבה הגרנולרית של ה-dentate gyrus.
אזורי CA2 ו-CA3 נאספו ואוכלוסיות תאים אלו נראות על הפאה. כאן, נקבע יעד לאזור בגרעין ה-nucleus accumbens core הפרוקסימלי-אדרוסטרלי לקומיסורה הקדמית (anterior commissure), אשר שוחזר נאמנה על הפאה. לבסוף, הגרעין הסופראכיאסמטי (suprachiasmatic nucleus) הרוסטרלי לצומת הסופראופטי (supraoptic chiasm) נלכד באמצעות LCM לאחר TBI.
לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה לעיבוד מוח אחד תוך כשמונה שעות. פרק זמן זה כולל את עיבוד הרקמה, הצביעה ו-LCM. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אנליזה אפיגנטית, כדי להשיב על שאלות הנוגעות לתבניות מתילציה או ביטוי מיקרוני.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה בנוגע לאופן ביצוע LCM במספר אזורי מוח באותו מוח.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את השימוש במיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (LCM) להשגת אוכלוסיות תאים ספציפיות מאזורי מוח שונים של חולדה, לצורך ניתוח ביטוי של גנים ו-microRNA. טכניקה זו משפרת את ההבנה של ההשפעות הדיפרנציאליות של חבלת ראש טראומטית (TBI) באזורי מוח נפרדים, כגון הקורטקס הפרונטלי וההיפוקמפוס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אנליזה מולקולרית
רקע
- TBI עלול לגרום להשפעות מגוונות באזורי מוח שונים.
- הבנת השפעות אלו ברמה התאית מחייבת טכניקות דגימה מדויקות.
- LCM מאפשר ניתוח ממוקד של סוגי תאים ספציפיים ללא זיהום.
- מחקר זה כולל השלכות מעשיות ומתודולוגיות עבור מחקר במדעי המוח.
מטרת המחקר
- שימוש ב-LCM לבידוד תאי מוח שנפגעו מ-TBI.
- ניתוח ביטוי של גנים ו-microRNA הרלוונטיים ל-TBI.
- הבהרת ההשלכות המולקולריות של TBI באזורי מוח סלקטיביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה העיקרית שנעשה בה שימוש היא מיקרודיסקציה בשבירת לייזר (LCM).
- המודל הביולוגי מורכב מרקמות מוח של חולדה, תוך התמקדות באזורים שנפגעו כתוצאה מ-TBI.
- המחקר קובע לוחות זמנים קריטיים להכנת הרקמה, לחיתוך ולצביעה.
- במהלך הפרוטוקול מושם דגש על שלבים קפדניים למניעת זיהומים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של אוכלוסיות תאי מטרה מאזורים כגון הקורטקס הפרונטלי וההיפוקמפוס.
- תובנות לגבי שינויים המושרים על ידי TBI ברמה המולקולרית, התומכות במחקרים מכניסטיים עתידיים.
- זיהוי של שלבים קריטיים בחיתוך ובצביעה עבור איסוף RNA מהימן.
מסקנות
- המחקר מדגים כיצד LCM יכול להקל על ביצוע ניתוחים מולקולריים ממוקדים של השפעות TBI.
- ההשלכות כוללות הבנה טובה יותר של המנגנונים העצביים המושפעים מפגיעה.
- שיטה זו משפרת את הדיוק במחקרים במדעי העצבים ומציעה נתיבים לחקירה טיפולית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (LCM) מאפשרת פרופילינג מולקולרי מדויק של אזורי מוח נפרדים שנפגעו כתוצאה מפגיעה מוחית טראומטית (TBI), ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות באמצעות ניתוח ביטוי גנים ו-microRNA בעל רזולוציה מרחבית. גישה זו מפחיתה אותות מטריות מרקמות הטרוגניות, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בהסרת סיכונים מכניסטיים של מסלולי TBI. על ידי בידוד תגובות ספציפיות לאזורים מאותו בעל חיים, ה-LCM משפרת את הרציפות התרגומית ואת סדר העדיפויות של תיקי הפיתוח בגילויים במדעי העצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד אזורים המושפעים מ-TBI, כגון קליפת המוח הפרונטלית וההיפוקמפוס, לצורך הבהרת מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף של מטרות עם סיכון ביולוגי מופחת באמצעות אנליזה מולקולרית בעלת רזולוציה מרחבית, ללא ארטיפקטים הנובעים מדיסוציאציה של רקמות.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קישור שינויים בביטוי גנים ספציפיים לאזור לתוצאות תפקודיות בתהליכי זיכרון ובפונקציות ביצועיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור בדיקות גנומיות המשך, על ידי שימור השלמות המרחבית והמיקום הטבעי של אזורי המוח.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה באמצעות חיתוך מונחה בנקודות ציון אנטומיות תוך שימוש באטלס של מוח חולדה.
- ערך של מדדי התרחבות: מאפשר הערכה אמינה של תרכובות על ידי אספקת תוצאות מולקולריות כמותיות וספציפיות לאזור מאזורי מוח נפרדים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: שומר על רלוונטיות למחלה על ידי אפשור ניתוח של שינויים בביטוי גנים ו-microRNA המושרים על ידי TBI באזורי מוח מוגדרים אנטומית.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אפשור פרופיל מולקולרי לאורך זמן משלבי הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקד בערך ניבוי על ידי בידוד שינויים מולקולריים סיבתיים באזורים נפרדים, במקום בממוצעים של רקמה שלמה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
LCM משתלב ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה דרך אופטימיזציה של מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מאפשר ניתוח מונחה-השערות של מנגנוני TBI באזורי מוח מרכזיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות בידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות מאזורים שנפגעו מפציעה, כגון nucleus accumbens core ו-suprachiasmatic nucleus.
- סריקה: מבטיחה את מוכנות הבדיקה באמצעות חיתוך סטנדרטי בקואורדינטות bregma מוגדרות ועיבוד נטול RNase להשגת תבוע RNA אמינה.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים, כולל פרופילי ביטוי של גנים ו-microRNA מרקמה שנלכדה בלייזר.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לניתוח אפיגנטי וניתוח מתילציה בעקבות LCM, כפי שצוין בפרוטוקול.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כבסיס הניתן לשימוש חוזר במודלים שונים של מחלות, כאשר העקרונות ישימים למחקרי ביטוי גנומי בהקשרים אחרים של פציעות או מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי באמצעות תיקוף מטרות והפחתת עמימות מכניסטית בניתוח מסלולים של TBI.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה באמצעות חיתוך בקריוסטט, הנחיית אטלס וזרימות עבודה תחת בקרת RNase.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך הפיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי בידוד תגובות מולקולריות ספציפיות לאזור.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון, המבוססות על התאמה של סמנים ביולוגיים ברזולוציה מרחבית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בנוירו-אנטומיה, חיתוך באמצעות קריוסטט ומכשור למיקרו-דיסקציה בשבבי לייזר (laser capture microdissection).
- תלוי בסביבה נקייה מ-RNase, קריוסטט בטמפרטורה של -20°C, מדיום OCT (optimal cutting temperature) ומערכות לייזר UV/IR.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית לפרוטוקולי צביעה, איסוף חתכים והטענת מכסות בין צוותי מדעי המוח וביולוגיה מולקולרית.
- שיקולי התאמה כוללים כיוון של קואורדינטות חיתוך המבוססות על הבריגמה (bregma) עבור אזורי מוח ומודלים שונים של בעלי חיים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בבקרה קפדנית על זיהומים ומיומנות טכנית בעקוב לייזר UV להבטחת היצמדות מלאה של הרקמה.
