סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לתאר כיצד בקטריופאג'ים מסונתזים מהגנום שלהם באמצעות מערכת תרגום שעתוק נטולת תאי E.coli. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הסינתטית, כגון הבהרת מנגנוני ההרכבה העצמית המולקולריים במערכות חיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרבגוניות של הפלטפורמה.

מערכות ביולוגיות רבות ניתנות לסיכום מלא ולכוונון עדין לניתוח ניסיוני. התחל הליך זה בהכנת לוחות פאג'ים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש בקצה של פיפטה פסטר סטרילית כדי לליבה והסר רובד בודד.

פוצצו את הפלאק לתאים המדוללים. לאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. כדי לבדוק זיהום מלא, קח דגימה של 500 מיקרוליטר לתוך צינור של 1.5 מיליליטר והוסף 10 מיקרוליטר כלורופורם.

מערבל מיד את התערובת במהירות גבוהה ושים לב אם התמיסה מתבהרת, מה שמעיד על זיהום בפאג'ים. לאחר שהתאים נגועים במלואם, יש לדגור למשך שעתיים נוספות. לאחר מכן, הוסף DNase לפני צנטריפוגה של התאים ב 8, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

השליכו את הסופרנטנט, ואז השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של 1X Tris מגנזיום כלוריד. הוסף 500 מיקרוליטר של כלורופורם ומערבולת במהירות גבוהה כדי ליז את התאים. הבהירו על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן פרקו את הסופרנטנט לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס. הכן ארבעה שיפועי סוכרוז של חמישה עד 45% על ידי פיפטינג של 2.5 מיליליטר של 45% סוכרוז לארבעה צינורות אולטרה-צנטריפוגה. מעל השכבה כ -2.6 מיליליטר סוכרוז 5%, ונעצר כאשר הנוזל מגיע לשני מילימטרים משפת הצינור.

מערבבים את השיפועים על ידי סיבוב צינור הטיה באמצעות מכשיר ליצירת שיפוע למשך 43 שניות ב-86 מעלות ו-23 סל"ד. בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, הוסף 500 מיקרוליטר של מתלה הפאג 'המאוגד על ידי הבאת הקצה למגע עם משטח הנוזל וחלוקת הנפח לאט מאוד על החלק העליון של שיפוע הסוכרוז, תוך הקפדה לא לערבב באמצעות פיפטינג מהיר. צנטריפוגה ב 70, 000 פעמים גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

טבלו צינורית קהה בתמיסה עד שהקצה מרוכז בקצה העליון של רצועת הפאג'ים. הסר את הרצועה על ידי ציור על בוכנת המזרק עד להסרת רוב רצועת הפאג'ים. לאחר מכן הוסף את נפח הסוכרוז עם הפאג התלוי לשלושה או ארבעה צינורות אולטרה-צנטריפוגה.

מלאו את הצינורות בין שלושה לארבעה מילימטרים מהחלק העליון של הצינור ב-1XTM קר. מכסים את הצינורות בניילון פרפין והופכים לתערובת. החזירו את הצינורות לאולטרה-צנטריפוגה והוציאו ב-145,000 פעמים גרם למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.

שפכו במהירות את הסופרנטנט וסננו הפוך על מגבונים חד פעמיים. חלקו 200 עד 400 מיקרוליטר של 1XTM קר על פני כל הכדורים והשעו מחדש למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. אין צורך בטלטול.

יום לפני הכנת טיטרים, הכינו תרבית של תאי מארח E.coli ב-10 מיליליטר של מצע גידול LB והשאירו את התרבית באינקובטור רועד המוגדר ל-250 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר על ידי פיפטינג של 5.25 מיליליטר של אגר עליון, 220 מיקרוליטר של דגימות פאג'ים מדוללות ו-50 מיקרוליטר של תאי חיידקים מארחים לצינור תרבית של 14 מיליליטר. מכסה את צינור התרבות והמערבולת במהירות גבוהה.

אחזר שתי צלחות תרבית מהחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מוסיפים 2.5 מיליליטר תערובת מאסטר לאט למרכז הצלחת הראשונה. סובב בעדינות את הצלחת ביד כדי לפזר את תערובת המאסטר באופן שווה כך שהיא תשתרע על כל צלחת התרבות.

המתן 20 דקות כדי להבטיח התמצקות של האגר העליון. דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד שבע שעות. ספרו את הפלאק וקבעו את ריכוז הפאג'ים עבור כל דגימת תגובה.

מדללים חלק ממלאי הפאג'ים ל-400 מיקרוליטר עם מאגר 1XTM בשפופרת טרייה של 1.5 מיליליטר. הוסף נפח שווה של טריס פנול כלורופורם לדילול. נערו את התערובת בעדינות על נדנדה במעבדה או ביד במשך חמש דקות.

לאחר מכן צנטריפוגה את האמולסיה המתקבלת ב-17,000 פעמים גרם בצנטריפוגה ספסל למשך חמש עד 10 דקות. הסר את השלב המימי העליון לצינור חדש, הקפד לא להפריע לגבול הבין-פאזי. חזור על שלבים אלה פעמיים נוספות בסך הכל שלוש מיצוי פנולים.

העבירו את השלב המימי לצינור טרי והוסיפו נפח שווה של כלורופורם. לנער ולצנטריפוגה לפני העברת דגימת ה-DNA המימית לצינור נקי. לאחר מכן, הוסף 0.4 נפחים של שלושה נתרן אצטט טוחנת ושלושה נפחים של 95% אתנול.

מניחים את הצינור במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס למשקעים למשך הלילה. צנטריפוגה ב 17, 000 פעמים גרם בצנטריפוגה ספסל למשך 10 עד 15 דקות. הסר והשליך את הסופרנטנט, על ידי סילוק או פיפטינג.

לאחר מכן מוסיפים 500 מיקרוליטר של אתנול 70% ומנערים בעדינות את הצינור עד שהגלולה צפה חופשי מתחתית הצינור. לאחר צנטריפוגה, הסר והשליך את האתנול, הקפד לא להפריע לגלולה. לאחר הוספת אתנול וצנטריפוגה כמו קודם, הסר והשליך את האתנול בפעם השנייה, שוב הקפד לא להפריע לגלולה.

יבש את הגלולה באוויר על הספסל למשך 30 עד 60 דקות. לאחר הייבוש, הוסיפו לגלולה 50 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס כדי להשעות מחדש. קבע את ריכוז ה-DNA באמצעות מדידות ספיגה ב-280 ננומטר.

כדי לבצע את התגובה נטולת התאים, ציין את הנפח המצוין של תמצית גולמית, 33% מנפח התגובה הסופי, לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. הכן את מיקס המאסטר כמפורט בפרוטוקול הטקסט. הוסף את הנפח המתאים של כל רכיב לתמצית הגולמית.

לאחר הוספת המרכיב האחרון, הומוגניזציה של התגובה על ידי מערבולת. לאחר מכן פצל את תערובת המאסטר ל-n צינורות מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף את הנפחים המצוינים של הרכיבים המשתנים למערך התמהיל הראשי.

הוסף מים לכל תגובה כדי להגיע לנפח התגובה הסופי הרצוי לפני המערבולת. לאחר מכן דגרו את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורה של 29 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות לפחות או למשך הלילה. לאחר הכנת התאים לטיטר פאג'ים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, טיטר את תמיסת התגובה הסופית נטולת התאים LB כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה.

מוצגות כאן תוצאות מייצגות של תגובה נטולת תאים המסנתזת פאג' phi X 174. רובד פאג'ים זה מראה תגובת פאג' מוצלחת שצוינה בדילול מתאים, כפי שניתן לראות על ידי מספר הפלאקים הניתן למנייה. עם זאת, תגובה מוצלחת יכולה להופיע בצורה גרועה אם גורם הדילול נמוך מדי עבור תפוקת הפאג'ים של התגובה.

לוח זה מציג מספר בלתי ניתן לספור של לוחות. מוצגת כאן צלחת עם פיזור לא הומוגני של פלאק פאג'ים עקב שיווי משקל מוקדם לא מספיק של טמפרטורת לוח התרבית. במהלך טיטר הפאג'ים, לוחית התרבות מיצקה את התגובה בחלק הימני התחתון של הצלחת.

לתנאי צפיפות מולקולרית יש השפעה חזקה על סינתזת הפאג'ים עבור phi X 174 ובמיוחד T7.In, תפוקת הפאג'ים עבור T7 יורדת בשלושה סדרי גודל כאשר ריכוזי ה-PEG יורדים מארבעה ל-2% משקל בנפח. לאחר השליטה, ניתן לבצע טיהור פאג'ים ומיצוי DNA תוך יומיים אם זה מבוצע כראוי. התגובה נטולת התאים אורכת שעות ספורות כאשר אין בעיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגדל פאג'ים, לחלץ ולטהר את ה-DNA שלהם, ולהשתמש בתוצאה כדי ליצור מחדש פאג'ים זיהומיים לחלוטין באמצעות מערכת התגובה נטולת התאים. עבודה עם פנול עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש ללבוש אמצעי זהירות כגון חלוק מעבדה, מגן עיניים וכפפות בעת ביצוע הליך זה. כל העבודה עם מיכלים פתוחים של פנול צריכה להתבצע במכסה אדים.