אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להפיק תאי גזע פלוריפוטנטיים הומוגניים המושרים על ידי בני אדם. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להפיק תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם למטרות רבות, כולל מודלים של מחלות, סינון תרופות, או כדי להפיק תאים לניסויים פרה-קליניים בטיפול תאי. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא חזק ומייצר תאים הומוגניים הנשמרים במערכת תרבית ידידותית למשתמש, נטולת קסנו ומוגדרת כימית לחלוטין.

מכיוון שתאי iPS אנושיים מסכמים את הרקע הגנטי של רקמת התורם וניתן להתמיין לכל סוג תא רלוונטי למחלה, הם מספקים כלים מצוינים למידול תזה. נתיחת הביופסיה ובחירת המושבה הם הליכים מורכבים. לראות אותם מבוצעים בידיים מנוסות מסייע בהבנת ההליכים ומקל על החזרה.

מי שידגים את ההליך היום יהיו הארייט רון-הולם וקלי דיי, שני טכנאי מעבדה מנוסים מאוד ממתקן הליבה של iPS במכון קרולינסקה. ניתן לאחסן דגימות ביופסיה של העור ב-PBS בתוספת 1% פניצילין סטרפטומיצין עד 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס, אך יש לעבד אותן מהר ככל האפשר לאחר השגתן. מעבירים את הביופסיה לצלחת של 35 מילימטר.

טבלו את ביופסיית העור בכלי של 35 מילימטר עם שני מיליליטר של אתנול 70% למשך 30 שניות. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת המלח המאוזנת הסטרילית של האנק בתוספת 1% סטרפטומיצין פניצילין לכלי חדש של 35 מילימטר והעביר את הביופסיה למנה החדשה. העבירו את הביופסיה לצלחת של 4 35 מילימטר מלאה במיליליטר אחד של תמיסת 0.1% דיספאז טרייה.

בעזרת אזמל ומלקחיים כירורגיים סטריליים, חותכים את ביופסיית העור לחתיכות של מילימטר מעוקב עד שניים. העבירו את חלקי הביופסיה עם תמיסת הדיספאזה לתוך שפופרת של 15 מיליליטר והוסיפו עוד שני מיליליטר של דיספאז. שוטפים את המנה בגודל 35 מילימטר עם מיליליטר אחד של תמיסת דיספאז ומעבירים את התמיסה השטופה לצינור 15 מיליליטר.

דגרו את הביופסיה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, הוסיפו ארבעה מיליליטר של 0.1% קולגנאז I לצינור עם חתיכות הביופסיה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. שלושים דקות לפני זריעת התאים, יש לצפות באר אחת בצלחת תרבית רקמה בת שש בארות במיליליטר אחד של 0.1% ג'לטין ב-DPBS.

דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר ארבע שעות דגירה עם קולגנאז, צנטריפוגה את התאים המעוכלים ב -300 פעמים גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את העיכול בשני מיליליטר של מדיום פיברובלסטים.

הסר את תמיסת הג'לטין מצלחת תרבית הרקמות בת שש הבארות שהוכנה בעבר. העבר את תרחיף התאים כולל כל חלקי הרקמה שנותרו לצלחת שש הבארות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בלחות גבוהה.

פיברובלסטים מוכנים למעבר לבקבוק תרבית רקמה T25 כאשר 80% מתלכדים. פיברובלסטים במעבר שניים עד ארבעה הם אופטימליים לתכנות מחדש מכיוון שיעילות התכנות מחדש בדרך כלל גבוהה יותר עבור פיברובלסטים במעבר נמוך יותר. שאפו את מדיום תרבית התאים מהבקבוק ושטפו את התאים במיליליטר אחד של DPBS.

שאפו את ה-DPBS והוסיפו מיליליטר אחד של 0.5% טריפסין EDTA. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות או עד לניתוק התאים. הוסף שני מיליליטר של מדיום פיברובלסטים, השהה מחדש את התאים והעביר את תרחיף התאים לצינור של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה בחום של 300 פעמים גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום פיברובלסטים. לאחר ספירת הפיברובלסטים באמצעות המציטומטר, זרע חמש פעמים 10 עד התאים הרביעיים בבאר אחת של צלחת תרבית רקמה של 24 בארות.

דגירה על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, מכיוון שנגיף סנדאי יטופל, המשך את ההליך במעבדה ייעודית BSL-2 תוך שימוש בציוד המגן האישי המתאים. שאפו את מדיום תרבית התאים והוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת נגיף סנדאי.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יום לפני קטיף המושבות, הכינו צלחות תרבית רקמות מצופות LN-521 בעלות 24 בארות. פיפטה 250 מיקרוליטר של תמיסת LN-521 לבאר אחת של צלחת 24 בארות.

אוטמים את הצלחת באמצעות פרפילם ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, שאפו את תמיסת LN-521 מהבאר האחת של צלחת 24 הבארות והוסיפו 500 מיקרוליטר E8 לבאר. מומלץ להשתמש ברשת שיער ובמסכת נוהל בעת בחירת מושבות תחת מיקרוסקופ הסטריאו.

מושבות מוכנות לקטיפה כאשר הן מגיעות לגודל של יותר ממילימטר בקוטר, מציגות קצוות חדים וגדלות בחד-שכבות הומוגניות. אל תבחר מושבות עם גבולות מטושטשים ומסות תאים הטרוגניות גדולות ולא קומפקטיות. חותכים כל מושבה בעזרת אזמל לחתיכות קטנות יותר בתבנית דמוית רשת.

השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לגרד מכנית את יריעות התאים מהצלחת ולאחר מכן להעביר את הסדין לבאר של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות שצופה בעבר ב-LN-521. בחירת מושבה היא קריטית להצלחת פרוטוקול זה. בחירת כמה מושבות נוספות תבטיח התקשרות במספרים מספיקים.

אפשר לתאים להתחבר מבלי לשנות את מדיום E8 למשך 48 שעות. מעבירים את התאים באופן אנזימטי כאשר המושבות הגיעו לגודל של יותר מחמישה מילימטרים. שאפו את מדיום תרבית התאים מהתאים ושטפו עם 250 מיקרוליטר DPBS.

שאפו את ה-DPBS והוסיפו 250 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. שימו לב שהתאים התחילו להתעגל כלפי מעלה.

נתק תאים מהצלחת על ידי שטיפת התאים עם מגיב דיסוציאציה. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום E8 לצינור של 15 מיליליטר והעביר את התאים ואת מגיב הדיסוציאציה לצינור. צנטריפוגה בחום של 300 פעמים גרם למשך שלוש דקות.

שאפו את הסופרנטנט מצינור ה-15 מיליליטר והשעו מחדש את כדור התא ב-500 מיקרוליטר של מדיום E8. ספרו את התאים באמצעות המציטומטר וזרע 2.5 עד חמש פעמים 10 לתאים הרביעיים בבאר מצופה מראש LN-521 אחרת שהוכנה בעבר המכילה 500 מיקרוליטר של מדיום E8 בטמפרטורת החדר. הוסף מעכב ROCK לריכוז סופי של 10 מיקרומולר.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. באמצעות פרוטוקול זה, מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם יוצאות מפיברובלסטים מתמרים בערך ביום ה-12 לאחר הטרנסדוקציה. המושבות היו מוכנות לאיסוף כשלושה עד ארבעה שבועות לאחר ההעברה.

התכונות המועדפות כוללות מסות תאים קומפקטיות שטוחות, צמיחה כחד-שכבות הומוגניות וקצוות חדים. תמונות שדה בהיר אלה מראות מעבר מוקדם הומוגני של קו תאי iPS אנושי מתוכנת מחדש לחלוטין בהשוואה לקו תאים הטרוגני מאוד. אובדן וקטור נגיף סנדאי אושר על ידי היעדר סמנים ספציפיים לווקטור נגיף סנדאי בתאי iPS אנושיים במעבר 12 בניגוד לתאי iPS אנושיים במעבר 3.

צביעה אימונוציטוכימית של תאים נגזרים עבור סמני פלוריפוטנטיות OCT4, SSEA-4 ו-NANOG הניבה תוצאה חיובית הומוגנית. ביטוי mRNA של גנים פלוריפוטנטיים אנדוגניים הוצג על ידי PCR טרנסקריפטאז הפוך. תרביות תאים שהכילו תאים שתוכנתו מחדש חלקית שלא ביטאו גורמי פלוריפוטנטיות הושלכו.

פוטנציאל ההתמיינות של תאי iPS אנושיים הוערך על ידי היווצרות גופים עובריים. PCR בזמן אמת לאחר 21 יום של התמיינות גוף עוברי זיהה ביטוי mRNA של סמנים ספציפיים לאנדודרם, מזודרם ואקטודרם שאישרו שתאי ה-iPS האנושיים הנגזרים מסוגלים להתמיין לשלוש שכבות הנבט. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו עם כ-22 שעות של זמן מעשי במהלך פרק זמן של כ-16 שבועות.

ניתן להתמיין את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לכל סוג תא בגוף האדם הבוגר כדי לענות על כל שאלה הרלוונטית לתחום המחקר שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שתהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע את הצעדים הדרושים כדי להפיק תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מביופסיות עור.