Name: הקלטה אלקטרופיזיולוגית מ תסיסנית Trichoid Sensilla בתגובה ריחות של תנודתיות נמוכה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למדו שיטה לאלקטרופיזיולוגיה של נוירונים אולפקטוריים ב-Drosophila תוך שימוש בהקלטות sensillum בודד. טכניקה זו מאפשרת חקר תקשורת פרומונים בחרקים בצורה מדויקת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים יה זאנג לעזרה עם עקבות מדגם ופח קי Tsang לעזרה עם התמונות. עבודה זו נתמכה על ידי קרן תומכת קרן ריי אדוארדס מוקדם קריירה מענק NIH (R01DC015519) כדי C-YS ומענקים NIH (R01DC009597 ו R01DK092640) כדי JWW

1. הכנת החומרה עבור הקלטה 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי פיפטה מושך להכין אלקטרודות עם נימי זכוכית aluminosilicate (OD 1.0 מ&quot;מ, 0.64 מ&quot;מ מזהה). Blunt קצה האלקטרודה התייחסות מעט עם זוג מלקחיים בסדר כדי להקל על הכניסה לתוך clypeus של זבוב ( כלומר צלחת מעוגלת בחלק הקדמי של הראש לטוס, מעל הפה). הערה: במחקר השתתפו 7 גברים בני 7 ימים (WT). השתמש תמיסת מלח AHL 14 כמו אלקטרוליט עבור שתי האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L של AHL על ידי ערבוב 900 מ&quot;ל של מים מזוקקים עם 6.312 גרם של NaCl, 0.373 גרם של KCl, 0.337 גרם של NaHCO 3 , 0.1120 גרם NaH 2 PO 4 , 1.892 גרם של Trehalose 2 2 H 2 O, 3.423 גרם של סוכרוז, 1.192 גרם של HEPES, ו 8.2 מ&quot;ל של 1M MgCl 2 . באמצעות מים מזוקקים, להביא את עוצמת הקול הכולל עד 1 L. תביא את ה- pH 7.4 באמצעות 1 N NaOH ו לעקר את הפתרון עםמסנן ואקום מערכת מסנן. עבור אחסון לטווח ארוך, לשמור על aliquots AHL ב 4 ° C. הערה: אספקה ​​עקבית של חומצה palmitoleic מותנים אחידות בין מחסניות. זה קריטי כי כל מחסנית הוא התאספו באופן לשחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, להסיר 0.9 ס&quot;מ מקצה פיפטה 200 μL μ כדי ליצור את החלק הראשון מחסנית, מדידה 4.1 ס&quot;מ; עיין בממדים המפורטים בתרשים 1 א . השתמש אחר 200 פיפטה μL להסיר ולהסיר 1.7 ס&quot;מ ו 1.5 ס&quot;מ מהקצה ואת הבסיס, בהתאמה, כדי ליצור את המחסנית השנייה בסעיף, מדידה 1.8 ס&quot;מ ( איור 1 א ). השתמש בסרגל כדי להבטיח שחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ⅛ &quot;אגרוף חור לחתוך דיסקים מסנן נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי להציב דיסק נייר סינון בקצה החלק השני של המחסנית. יש לאשר באופן חזותי כי יש פתח בקצה המחסנית שדרכו האוויר יכול לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את חלקי המחסנית הראשונה והשנייה יחד, כפי שמוצג באיור 1 א . זווית החלק מחסנית השנייה כלפי מטה כדי להקל על כיכר מכוון הכנה ( איור 1 ב ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המחסנית עם צינור ריח משלוח, אשר מותקן על micromanipulator. הערה: תכנון זה מאפשר למחסנית להיות מסובב החוצה כדי להקל על חילופי ( איור 1 ג ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זרימת האוויר humidified קבוע ל 2 L / min בבקר אחד המוניים ואת זרימת אודורנט ל 500 מ&quot;ל / דקה בבקר המוני אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות התוכנה (ראה טבלה של חומרים ), תוכנית ההליך לנהל 500 מ&quot;ל ריח הריח. </li></ol> 2. הכנת פתרונות חומצה Palmitoleic חומצה עבור משלוח הערה: ORNs מגיבים הן לחומצה cis והן לחומצה טרנס- פאלמטולית. כמו חומצה palmitoleic אינו יציב ב RT, מניות מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס, ומשמשים בתוך חודש לאחר הפתיחה. אתנול הוא ממס של בחירה עבור חומצה palmitoleic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיקסר מערבולת לערבב ביסודיות 10 μL של cis- או טרנס מניות חומצה palmitoleic או דילולים עם 90 μL של 100% אתנול עבור דילולים סדרתי של פי עשרה 1.7 microtubes מ&quot;ל. הכן דילולים חומצה palmitoleic טריים מדי יום לפני ניסויים ושימוש בתוך יום. הערה: עבור odorants שאינם מסיסים באתנול, בקבוקון זכוכית מומלץ להכנת דילולים ריח עם סוגים אחרים של ממיסים אורגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות micropipette P10, להחיל 5 μL של פתרונות חומצה CIS -palmitoleic של דילולים הרצוי על נייר הסינון בכל מחסנית המתאימה. הערה: המינון הגבוה ביותר (10 -1 ) מכיל 450 מיקרוגרם של המתחם. עבור פתרונות חומצה טרנס- חומצתית, יש ליישם 4.5 μL במקום כך המינון הגבוה ביותר (10 -1 ) מכיל גם 450 מיקרוגרם של tהוא מורכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגמרי להתאדות הממס, במקום מחסניות חומצה palmitoleic ב desiccator ואקום עבור 1 שעה ב RT ו 7.59 mmHg של לחץ. הערה: ניתן להשתמש במחסניות עד 4 שעות ב - RT. </li></ol> 3. הכנת תסיסנית עבור גישה מוכנה AT4 Sensilla עבור הקלטות אלקטרו vivo הערה: זבובים WT (ברלין) הם גידלו בינוני תירס רגיל ב 25 מעלות צלזיוס במחזור כהה 12:12. עם זאת, הזבובים מופרדים במין לקבוצות של עשרה, לפיו הם שוכנים עד גיל 7. Or47s ב זבובים זכר ונקבות להגיב חומצה palmitoleic. לפשטות, רק זבובים גברים נבדקים במחקר הנוכחי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שקופית זבוב הכנה: על שקופית זכוכית, במקום coverslip זכוכית (18 x 18 מ&quot;מ 2 ) על כמות קטנה של חימר דוגמנות, להרכיב זווית 3 ° ~ עם שקופיות הזכוכית. מקם קלטת דו צדדית על הקצה הפנימיDge של coverslip ועל השטח של השקופית מיד מתחת. החלף עם סרט חדש עבור כל יום של הקלטה ( איור 2 א ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aspirator לטוס 15 כדי לאסוף את זבוב עניין צינורות ולאחר מכן להתאים קצה פיפטה 200 μL מעל סוף הצינור. בו זמנית מזנק את הצינור קדימה תוך נושבת אוויר לתוך הצינור לדחוף את הזבוב עד קצה קצה פיפטה. השתמש בסכין גילוח לחתוך ממש מתחת לגוף של זבוב 2 אורכים ראשי מעל לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפ את החלק התחתון של קצה פיפטה עם חימר דוגמנות, דוחפים את הזבוב כלפי מעלה עד שתי האנטנות ואת clypeus נחשפים ( איור 2 ב ). כדי למנוע להרוג את הזבוב, להוסיף רק מספיק חומר כדי לחשוף את האנטנות ואת aristae, כמו זה מונע את הבטן של הזבוב מלהיות מרוסק. יתר על כן, להוסיף טיט לאט בעדינות כדי למנוע כל התכווצות פתאומית. ודא כי הוא זבוב חי על ידי בדיקת antennalאו תנועת חוטם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים לתמרן את קצה פיפטה כי הבתים זבוב. אוריינט את הראש כך clypeus פונה ימינה של הצופה. התאם את הכנה לאורך coverslip באמצעות מלקחיים בסדר עד הצד הצדדי של האנטנה מונח על משטח coverslip מוקלט ( איור 2 ב ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מוט אחיזה על arista כדי לאבטח את האנטנה לקלטת דו צדדית כדי למנוע תנועה ( איור 2 ב ). הערה: מוט ההחזקה הוא משך זכוכית borosilicate נימי עם משיכה פיפטה והחזיק במיקום עם חימר דוגמנות ( איור 2 א ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכנה על הבמה של המתקן ( איור 2 ג ). באמצעות המיקרוסקופ, ודא כי הטריכוידים נראים לאורך קצה דיסטלי לרוחב של החלק השלישי של האנטנה. הערה: באופן אידיאלי, את sensilla צריך להיות ברור צללית על רקע, אשר מפשט שלהם<html> זיהוי ומקלה הקלטה ( איור 3 ). בהכנה זו, רוב הטריכואיד הטריכואיד הנגיש הם מסוג AT4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על הכנה תחת זרימת אוויר humidified קבוע (2 L / min) נמסר דרך צינור אספקת אוויר נפרד ממרחק של כ 2 ס&quot;מ מן הכנה ( איור 4 ), כמתואר בעבר 2 , 15 . </li></ol> 4. הקלטה של ​​פעילות סנסילום ב 4 ORNs ORNs ב 4 Trichoids בתגובה חומצה Palmitoleic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האלקטרודה התייחסות לתוך clypeus ( איור 3 א ). כדי למנוע נזק לרקמות, ודא כי האלקטרודה מוכנס ממש מתחת לפני השטח, שם הוא יכול ליצור קשר עם hemolymph תחת לציפורן, עם תנועה מהירה וחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנמיך את האלקטרודה ההקלטה לאט לאט זה נכנס למישור זהה של נוף כמו sensillum היעד (= &quot;Xfig&quot;&gt; איור 3 ב). שיא תחת עדשה אובייקטיבית 50X. הערה: לציפורן trichoidal קשה מחייב הכנסת אלקטרודה ההקלטה לבסיס sensillar, אשר אזור רחב יותר מספק יעד גדול יותר אשר מקטין את הסבירות כי האלקטרודה הוא הסיר משם ( איור 3 ב , inset). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני החלת גירויים ריח על סנסילום, לבחון את הקריטריונים הבאים הבחירה; כל טריכאיד לא עומד בסטנדרטים אלה צריך להידחות סנסילום אחר נבחר במקום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב יחס אות לרעש גבוה (ראה איור 3 ג לדוגמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון קוצים מזוהים מ ב 4A ו נוירונים ב 4C ( איור 3 ג ). הערה: הערה, משרעת ספייק ב 4B נראה דומה מאוד ב 4A 10 ולא ניתן לזהות בקלות ללא גירוי ריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב כי קצב הירי הבסיסי של נוירונים ב 4A הואסביב או מתחת 20 הרץ. הערה: קריטריון זה הוא ספציפי עבור at4A כי קצב הירי הבסיסי עבור הנוירון הוא גבוה יותר מזה של ORNs בסיסי 2 . ירי ביזי גבוה הרבה יותר מציין כי הנוירונים ייתכן שנפגעו במהלך הכניסה אלקטרודה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המחסנית לצינור אספקת האדים. התחל עם שליטה ממס ואז את odorants, מ נמוך עד ריכוז גבוה. השתמש micromanipulator לתמרן את המחסנית לקראת הכנה תוך מכוון את המחסנית ישירות בראש הכנה. ודא כי המחסנית מכוונת ישירות לאנטנה ( איור 4 ) ממרחק של מילימטרים ספורים. הערה: המטרה היא לכוון את פתיחת המחסנית ישירות לאנטנה ולמקם אותה בקרבת רקמת היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי מחסנית odorant מופרד האלקטרודה ההקלטה בצד ימין שלה על ידי 1 - 2 מ&quot;מ ו מן לטוס מראשP שקופית מתחת כ 1 מ&quot;מ. הערה: בהתקנה המתוארת כאן, מחסנית אודורנט הוא גובל מקרוב על ידי האלקטרודה הקלטה, האלקטרודה התייחסות, ואת זבוב הכנה זבוב ( איור 4 ). הערה: שימו לב למרחק שבין המחסנית לבין האלקטרודות של ההקלטה / הפניה. במרחק של כ 4 מ&quot;מ מומלץ 1. מגע לא מכוון עלול לסיים את האות ולשבור את קצה האלקטרודה הקלטה, פגיעה נוירון הנוכחי מסובך הקלטות נוספות. הערה: שקול את המרחק המפריד בין המחסנית לבין השקופית הזזה. נגיעה coverslip עשוי גם לבטל את האלקטרודה הקלטה כדי לשבש את ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;שיא&quot; בתוכנה רכישת נתונים כדי להתחיל את ההקלטה. הערה: עבור כל הקלטה של ​​10 שניות, דופק יחיד של 500 מילישניות מועבר ישירות לאנטנה, כמתואר בשלב 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יישום אודורנט,הסר בזהירות את המחסנית לפני החלפתה במחסנית של הריכוז הבא הגבוה ביותר. המשך עד לקבלת טווח המינון כולו. הערה: מומלץ כי רק ORN אחד OR47b נרשם מכל זבוב, כדי למנוע כל ההשפעות האפשריות של הסתגלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשטוף את האלקטרודה הקלטה עם מים מזוקקים לאחר סיום הקלטה עבור היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח וניתוח הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח זמין באופן לא מקוון זמין מסחרית. </li></ol>

<ol><li>Lin, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li>
<li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li>
<li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li>
<li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li>
<li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li>
<li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li>
<li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546(2013).</li>
<li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+USA%22%5BJournal%5D)">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li>
<li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+A%22%5BJournal%5D)">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li>
<li>Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+back+or+front%3A+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, תיארנו הליך שבו תשובות של ORNs ORNs לחומצה palmitoleic יכול להיות המושרה בחוזקה נרשמה. שינינו שיטת קונבנציונאלי ארוכת טווח משלוח ריח 2 , 7 , 10 כדי לפתור את הבעיה של משלוח pheromone מספיק odorant. התייחסנו לסוגיית התנודתיות הזעירה על ידי אספקת המתחם באמצעות מחסניות ריחניות, שפתחן ממוקם במילימטרים של הכנה. כאשר השיקול ניתן לבנייה עקבית של מיקום של כל מחסנית אודורנט, פרוטוקול זה מתבטא ...

<html> תסיסנית ORNs מגיבים למספר עצום של odorants, עם מגוון רחב של שרשרת פחמן אורכים מגוון רחב של קבוצות פונקציונליות, כולל אסטרים, אלכוהול, קטונים, lactones, aldehydes, terpenes, חומצות אורגניות, אמינים, תרכובות גופרית, heterocyclics, ארומטיים 2 , 3 . ריחנים שונים התכונות הפיסיקוכימיות שלהם יכול להיות שונים volatilities שונים, המצוין על ידי לחץ אדי של המתחם. יש לציין כי ריחות ביולוגיים רלוונטיים עבור תסיסנית melanogaster שונים מאוד בתנודתיות שלהם. לדוגמה, Ir92a ORNs מגיבים לאמוניה 4 , שהיא תנודתית מאוד, עם לחץ אדי של 6,432 מ&quot;מ כספית ב 20 ° C. לעומת זאת, OR67d ORNs מגיבים על פרומון זכר, cis- acenate אצטט ( c VA) 5 , 6 , לחץ אדים של אשר 43 מ&quot;מ כספית ב 20 ° C. &quot;Ove_content&quot;&gt; בדיקת תגובת הריח ל odorants של תנודתיות נמוכה היא מאתגרת במיוחד עם שיטות קונבנציונאלי משלוח ריח, שבו odorants מועברים באמצעות זרם האוויר המוביל על מרחק ארוך יחסית ( כלומר כמה סנטימטרים ).ככזה, דיווחים חוש הריח דיווח אל odorant נמוך התנודתיות נתונה יכול להשתנות במידה רבה, בהתאם לעיצוב של המערכת-המסירה ריח לדוגמא, התגובה המדווחת של Or67d ORNs למינון גבוה של ג VA נע בין ~ 40 7 -.&gt; 200 קוצים / s 6 . יתר על כן, המשלוח היעיל של VA ג עם שיטות משלוח קונבנציונליות מיוחס צפוי תוצאות false-negative, מוביל לפרשנות כי ג VA כשלעצמו אינו מספיק כדי להפעיל Or67d ORNs 8. פרשנות זו נתערערה מאוחר יותר על ידי מחקר אחר באמצעות לטווח קצר שיטת הריח משלוח 9. זה אימפרה ולכןTive לפתח מערכת ריח ריאה חזקה להצגת יעיל של odorants של תנודתיות נמוכה. לאחרונה, זיהינו כמה שרשרת ארוכה של חומצות שומן קורטיקולרי כמו ligands עבור OR47s ORNs. הם שוכנו סוג 4 Antennal Trichoid Sensillum (ב 4). בין שרשרת ארוכה של חומצות ריח odorants, מצאנו כי חומצה palmitoleic פונקציות כמו fheromone אפרודיזיאק כי מקדם החיזור הגברי על ידי הפעלת OR47b ORNs 1 . עם זאת, במחקר אחר המשתמש בשיטה של ​​מתן ריחות קונבנציונאלי, מתיל לוראטי הוצג כדי לעורר תגובות של ORNs OR47, בעוד חומצה palmitoleic עורר שום תגובה כאשר הוצגו מאותו המרחק 10 . בהשוואה ג VA, חומצות שומן ארוכות-שרשרת הן אפילו פחות תנודתי, עם לחצים אדי פחות מ 0.001 מ&quot;מ כספית על 25 מעלות צלזיוס 11. התנודתיות הנמוכה מטבען של ריחות חומצות שומן ארוכות שרשרת, המונעת הצגה יעילה לאנטנה דרךקונבנציונאלי משלוח מערכות ריח, סביר להניח את התוצאות שליליות שווא 10 . חוסר עקביות זה מדגיש את חוסר הקליטה של ​​מערכות ריחות קונבנציונאליים בהצגת ריחות נדיפים. הוכח בעבר כי המסירה האפקטיבית של ריחות זבוביים טסים דורשת קרבה בין מקור הריח לבין רקמת היעד 6 . לכן, כדי לאפיין באופן מלא את ההשפעות של pheromones פעיל ביולוגית תוך מחקה את המרחק שבו הם עשויים להיתקל על ידי זבובי פירות בטבע 12 , 13 , הסכמנו כי המרחק המינימלי חייב להיות נתון בעדיפות גבוהה בהליך שלנו. השיטה שלנו מחזיקה יתרונות נוספים, כולל תאימות עם סטנדרטי electrophysiology טכניקות. קיימים מראש setups סטנדרטי דורשים שינוי מינימלי כדי להתאים את הפרוטוקול הזה, ואת רוב הצעדים SSR דורשים רק התאמות קלות. זֶההופך את הטכניקה שלנו נגיש לחוקרים מנוסים SSR. יתר על כן, הטכניקה שלנו מאפשרת הצגה של odorants בתזוזות נמוכה עם התחלה חדה וקיזוז, מתאם מתן תמריצים עם התגובה העצבית. לבסוף, פריסת החומרה מאפשרת חילופי מהיר בין מחסניות odorant, המאיץ איסוף נתונים על פני טווח המינון הרצוי. אנו מתחילים על ידי סקירת הכנת הפניה אלקטרודות הקלטה, תמיסת Hemolymph-Adult למבוגרים (AHL) פתרון, מחסניות משלוח אודורנט, ואת olfactometer המקביל. לאחר מכן אנו דנים בהכנה של פתרונות חומצה palmitoleic odorant, ואחריו הכנת זבוב להקליט. אנו ממשיכים לשקול את הקריטריונים לבחירת סנסילום טריכואיד כדי להקליט ולבחון מקרוב את המיקום של מחסנית אודורנט לפני הצגת נתונים נציג רכשה באמצעות שיטה זו. לבסוף, אנו מסיקים על ידי בחינת יישומים שימושיים של techniq זהאו, כמה נתקלו בבעיות, ואת הפתרונות שלהם.

<table><tbody><tr><td>Prep Setup & חומרים שונים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר מושך פיפטות&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA ארה"ב</td><td>P97</td><td>חולץ פיפטות</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td> World <td>Precision Instruments סרסוטה פלורידה ארה"ב</td><td>1B100F-4</td><td>לייצור מוטות אחיזה</td></tr><tr><td>נימי זכוכית אלומינוסיליקט&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA ארה"ב</td><td>AF100-64-10</td><td>לייצור אלקטרודות</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט פישר</td><td>Scientific פיטסבורג פנסילבניה ארה"ב</td><td>12-550-143</td><td>לתחנת הכנה לזבובים</td></tr><tr><td>סרט דו צדדי קבוע</td><td>סקוטש סנט פול מינסוטה ארה"ב</td><td></td><td>NA לתחנת הכנה לזבובים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף</td><td>אולימפוס שינג'וקו טוקיו יפן</td><td>BX51</td><td>להקלטת אסדה</td></tr><tr><td>פלסטלינה דוגמנות חימר</td><td>ואן אקן צפון צ'רלסטון SC ארה"ב</td><td>B0019QZMQQ</td><td>לתחנת הכנה ולייצב את מוט האחיזה</td></tr><tr><td>יחידת מסנן חד פעמית סטרילית זרימה מהירה עם קרום SFCA, 0.45 מ"מ</td><td>Nalgene רוצ'סטר ניו יורק ארה"ב</td> <td># 156-4045</td><td>לעיקור תמיסת AHL</td></tr> <tr><td>שם< / חזק ></td><td>חברה&nbsp; &nbsp; &nbsp; </חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>חומרי מחסנית</חזק></td><td><חזק>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </חזק></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; קצה פיפטה L&nbsp;</td><td>VWR Radnor PA ארה"ב</td><td>53508-810</td><td>להכנת מחסניות ריח והכנה לזבוב</td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Whatman Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>לייצור מחסניות ריח&nbsp;</td></tr><tr><td>מייבש ואקום&nbsp;</td><td>Cole-Parmer Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>לאידוי ממס אתנול</td></tr> <tr><td>שם</td><td>Company&nbsp; &nbsp; &nbsp; </חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>חומרי ריח</חזק></td><td><חזק>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>חומצה טרנס-פלמיטולאית</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI</td> <td>USA#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b ריח</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>ספקטרום כימי MFG.&nbsp; ניו ברונסוויק ניו ג'רזי ארה"ב</td><td>E1028-500MLGL</td><td>לדילול חומצה פלמיטולאית&nbsp;</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Rig Setup Materials</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </חזק></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחסנית ריח מיקרומניפולטור</td><td>Siskiyou Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>כדי למקם את האולפקטומטר</td></tr><tr><td>תוכנת Flow Vision&nbsp;</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>תוכנה לשליטה בקצב הזרימה</td></tr><tr><td>בקר מסה</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>לשליטה בקצב הזרימה עבור בקר מסת אוויר לח</td></tr><tr><td></td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>לשליטה בקצב הזרימה לגירוי ריח</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices Sunnyvale CA ארה"ב</td><td>גרסה 10.4</td><td>תוכנה לרכישת נתונים</td></tr><tr><td>צינור אספקת אוויר</td><td>Ace Glass Vineland NJ ארה"ב</td><td>8802-936&nbsp;</td><td>כדי לספק אוויר לח</td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבית פי 50&nbsp;</td><td>אולימפוס שינג'וקו טוקיו יפן</td><td>LMPLFL50X</td><td>מתקן הקלטה</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices Sunnyvale CA ארה"ב</td><td>גרסה 10.4</td><td>תוכנה לניתוח ספייק&nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics Lake Oswego OR ארה"ב</td><td>גרסה 6.37</td><td>תוכנה לניתוח נתונים&nbsp;</td></tr><tr><td>צג אודיו</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale ניו יורק</td> ארה"ב <td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>מדווח באופן שמיעתי על קוצים בודדים</td></tr><tr><td>מגבר חוץ-תאי</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>כדי להגדיל את משרעת האותות החשמליים</td></tr><tr><td>בקר שסתומים</td><td>Warner Instruments&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>VC-8</td><td>לשליטה בפתיחת השסתום לגירוי ריח</td></tr><tr><td>הקלטת אלקטרודה מיקרומניפולטור</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>למיקום אלקטרודת הקלטה</td></tr><tr><td>מגבר HEADSTAGE</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>כדי להגדיל את משרעת האותות החשמליים</td></tr><tr><td>אוסילוסקופ</td><td>Tektronix Beaverton או ארה"ב</td><td>TDS2000C</td><td>דו"ח ויזואלי של עליות בודדות</td></tr></tbody></table>

הקלטה אלקטרופיזיולוגית מ<em&gt; תסיסנית</em&gt; trichoid sensilla בתגובה ריחות של תנודתיות נמוכה

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

חרקים מסתמכים על חוש הריח שלהם כדי להנחות מגוון רחב של התנהגויות קריטי להישרדות שלהם, כגון חיפוש מזון, הימנעות טורף, oviposition, והזדווגות. כימיקלים רבים של תנודות משתנות זוהו כמו ריחות טבעיים המפעילים חרק חוש הריח נוירונים קולטן (ORNs). עם זאת, לימוד תגובות חוש הריח כדי odorants התנודתיות נמוכה כבר הקשו על ידי חוסר היכולת להציג ביעילות גירויים כאלה באמצעות שיטות קונבנציונאלי משלוח ריח. כאן, אנו מתארים הליך המאפשר את ההצגה האפקטיבית של odorants נמוך התנודות עבור vivo יחיד Sensillum הקלטה (SSR). על ידי מזעור המרחק בין מקור הריח לבין רקמת המטרה, שיטה זו מאפשרת יישום של ריחות ביולוגיים בולטים אך לא נגישים עד כה, כולל חומצה palmitoleic, פרומון גירוי עם אפקט הפגינו על ORNs המעורבים חיזור התנהגות ההזדווגות 1 .ההליך שלנו ובכך מציע שדרה חדשה assay שורה של ריח odorants נמוכה לחקר olfaction חרקים תקשורת pheromone.

הטכניקה שלנו יושמה בהצלחה כדי לקבוע את היעילות היחסית של טרנס ( איור 5 א ) לעומת CIS ( איור 5 ב ) איזומרים של חומצה palmitoleic. הנתונים הייצוגיים שלנו מדגימים כי חומצה טרנס- פאלמיטולית היא ליגנד יעיל יותר עבור ORNs OR47 כאשר בהשוואה isoform cis ( איור 5 ג ). נוירון אחד נרשם מכל זבוב, עם שנים עשר זבובים נרשמה לכל עקומת המינו...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להציג odorants של התנודתיות נמוכה להקלטת single-sensillum מ נוירונים קולטן תסיסנית חוש הריח המגיבים שרשרת פרומונים ארוכים שרשרת.

הקלטה אלקטרופיזיולוגית מ<em&gt; תסיסנית</em&gt; Trichoid Sensilla בתגובה ריחות של תנודתיות נמוכה

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא להציג ריחות בעלי תנודתיות נמוכה ביעילות לנוירונים של קולטני הריח ודרוזופילה לרישום אלקטרופיזיולוגי. נוירונים אלה שוכנים בסנסילה הטריכואידית ומגיבים לפרומונים קוטיקולריים ארוכי שרשרת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תקשורת פרומון חרקים על ידי מתן טכניקת העברת ריח משופרת.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת להציג ביעילות ריחות שבעבר לא היו נגישים בשל התנודתיות הנמוכה שלהם במהלך הקלטת in vivo. באופן ספציפי, פרומונים מוצגים ממרחקים קרובים המדמים את הטווח בין זכרים מחזרים לנקבות מטרה. הכנת רכיב מחסנית אספקת הריח להקלטות AT4 מתחילה בהסרת 0.9 סנטימטרים מהקצה הצר של קצה פיפטה בנפח 200 מיקרוליטר.לאחר מכן, מקצה פיפטה שני, הסר 1.7 סנטימטרים מהקצה הצר, ו -1.5 סנטימטרים מהקצה הרחב כדי ליצור אורך של 1.8 סנטימטר. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להניח דיסק נייר סינון בקוטר 1/8 אינץ' בקצה הקטע של 1.8 סנטימטר. השאירו פתח קטן שדרכו יכול לעבור אוויר.לאחר מכן אבטח את חלקי הפיפטה יחד עם החלק הקטן יותר בזווית כלפי מטה כדי לכוון את ההכנה. כעת השתמש ב-P10 כדי למרוח את הריח בדילול הרצוי על נייר המסנן. לאחר מכן, כדי לאדות את הממס, הניחו למחסניות הטעונות לשבת במייבש ואקום למשך שעה.ראשית, הרכיבו שקופית להכנת זבובים. על מגלשת זכוכית, חבר פתק כיסוי זכוכית עם חימר דו

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

התגובות של אלקטרו עצב סנסורי חוש הריח כדי odorants ניתן למדוד חרקים באמצעות הקלטות sensillum יחיד. במאמר זה הווידאו נדגים כיצד לבצע הקלטות sensillum אחת האנטנות של זבוב החומץ...

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

מערכות חוש הריח חרקים לספק הזדמנויות ייחודיות עבור odorant-Induced התגובות הקלטה בצורות של electroantennograms (EAG) והקלטות sensillum יחיד (SSR), אשר סיכם תגובות מכל קולטן נוירונים odorant (ORNs) הממוקם על האנטנה ועל מאלה שוכנו הפרט sensilla, בהתאמה.

מדידות אלקטרו ממערכת עש חוש הריח

אנו מתארים טכניקה הוקמה כדי למדוד ולנתח ריח עוררו תגובות סידן באונה מחושים...

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

בסרטון זה, זבוב דרוזופילה חי מותקן בצינור למחקרים אלקטרופיזיולוגיים. אלקטרודות ממוקמות בבסיס הסנסילום כדי לרשום תגובות עצביות ספציפיות לפרומונים עם נוירוני קולטן הריח של הזבוב.

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של Drosophila Sensilla בתגובה לריחות נדיפים

פרוטוקול זה מתאר הקלטה תאית מתגובות פוטנציאל הפעולה שנורו על ידי נוירונים טעם labellar בדרוזופילה.

הקלטת אלקטרו מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Labellar טעם Sensilla

הרגליים הקדמיות והפרובוסקיס של דרוזופילה מכילים רפרטואר עשיר של נוירונים חושיים טעמיים. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בהדמיית סידן כדי למדוד תגובות פיזיולוגיות מנוירונים חושיים ברגל הקדמית וחוטם של זבובים חיים ביישום אקסוגני של פרומון טעם.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Flywalk מערכת מעקב האוטומטי משמש לכימות ברזולוציה גבוהה של מודרך ריח התנהגות בmelanogaster תסיסנית.

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ויעיל עבור הקלטות יחיד sensillum basiconica sensilla קאלאמרי של חרקים mouthparts.

Sensillum אחת ההקלטות של ארבה משוש Sensilla Basiconica

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

שיטה נדירה של הקלטה אלקטרופיזיולוגית, הקלטת בסיס, מאפשרת ניתוח של תכונות של קידוד טעם שלא ניתן לבחון בשיטות הקלטה קונבנציונליות. הקלטה בסיסית מאפשרת גם ניתוח תגובות טעם לגירויים הידרופוביים שלא ניתן לחקור בשיטות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות.

הקלטת בסיס: טכניקה לניתוח תגובות של נוירוני טעם בדרוזופילה

למדו שיטה לאלקטרופיזיולוגיה של נוירונים אולפקטוריים ב-Drosophila תוך שימוש בהקלטות sensillum בודד. טכניקה זו מאפשרת חקר תקשורת פרומונים בחרקים בצורה מדויקת.

הקלטה אלקטרופיזיולוגית מ

גלה סרטונים נוספים