מבוסס-פורייה עקיפה ניתוח של חיים Caenorhabditis elegans
13 בספטמבר 2017
כתב יד זה מתאר כיצד להבחין בין נמטודות שונים באמצעות שדה רחוק עקיפה חתימות. אנו משווים את ומכניקה של 139 108 "רולר" C. elegans וסוג הפרוע מאת ממוצע של תדרים המשוייך לחתימה עקיפה פראונהופר טמפורלית במקום אחד באמצעות לייזר מתמשך wave.
המטרה הכוללת של ניתוח עקיפה מבוסס פורייה זה היא לאפיין את התנועה של C elegans בזמן אמת כאשר המין נע בחופשיות במרחב תלת מימדי. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה על ידי תיאור תגובות מינים לצפיפות שונה של מוטציות תמיסה או תנועה. שיטה זו משמשת כקו בסיס לניתוח פורייה של מינים מיקרוסקופיים.
יש לו יתרון שלכל מין מיקרוסקופי יהיה ספקטרום פורייה ייחודי משלו. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התנועה של C elegans, ניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים אחרים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שמציאת הנמטודה בקובט, מתחת לקרן הלייזר יכולה להיות מאתגרת.
הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה בניסיון ללמוד על התנהגות שחייה מאות העקיפה הרקתית, כשלעצמו, אות רועש. כדי להתחיל, אבטח לייזר ניאון הליום ליד הפינה השמאלית האחורית של שולחן העבודה האופטי וחבר אותו למקור חשמל. הנח מסנן צפיפות ניטרלית בין הלייזר למיקום הדגימה, כך שקרן הלייזר תעבור דרך המסנן לפני שתגיע לדגימה.
באמצעות שתי מראות היגוי אלומיניום קדמיות, בנה פריסקופ על ידי אבטחת המראה הראשונה לאחר מסנן הצפיפות הנייטרלית. לאחר מכן, אבטח את המראה השנייה כ-10 סנטימטרים מתחת למראה הראשונה כדי לתת מקום לנווט את קרן הלייזר. הכנס קובטה בין המראות ויישר את קרן הלייזר והקובטה כך שקרן הלייזר תעבור אנכית דרך הקובטה.
לאחר מכן, אבטח את דיודת הצילום ישירות מול המראה השנייה כך שהחיישן שלה פונה למראה. לאחר מכן, הניחו קובטה מלאה במים על מעמד. כוונן את גובה המעמד ואת זוויות המראות אחת ושתיים כך שקרן הלייזר תעבור דרך הקובט ותכוון קרוב אך לא ישירות לדיודת הצילום.
השתמש במנוף כדי להבטיח שהמעמד יוצר משטח ישר לקובטה. אם המעמד אינו מפולס, בצע את ההתאמות המתאימות עד ליישור. לבסוף, חבר את דיודת הצילום לאוסילוסקופ הדיגיטלי באמצעות כבל ה- USB המצורף וחבר אותה למחשב.
טען את תוכנת האוסילוסקופ והגדר את קצב הדגימה לשמונה הרץ לפחות כדי לפתור את מחזור האשפה של התולעת בצורה מספקת. השתמש בחוט פלטינה דק ושטוח כדי להעביר ארבע נמטודות בוגרות לצלחת פטרי טרייה במילוי אגר NGM. לאחר מכן, הוציאו קובטה חד פעמית מפלסטיק מהאריזה שלה, והקפידו לגעת רק בקובט בצדדים המרוכסים שלה.
לאחר מכן, השתמש במיקרופיפטה כדי לפפט מים מזוקקים לקובטה עד שהקובטה מתמלאת בכ-80% במים מזוקקים. מניחים את צלחת הפטרי המכילה את ה- C elegans תחת טווח ניתוח. לאחר מכן, השתמש בפיק הפלטינה כדי להסיר C elegans בוגר אחד מצלחת הפטרי ולהטביע את הפיק בקובטה.
הזז את הבחירה במעגלים כדי לעקור את הנמטודה במידת הצורך. טפל בנמטודות בעדינות ואל תנער את הקובטה. ניעור הקובט עלול לגרום לתולעים להפסיק להגיב.
כדי למנוע היווצרות בועות בקובטה, מלאו את הקובט במים מזוקקים עד שהוא זז מעט מעל החלק העליון של הקובטה. לאחר מכן, מלאו את הפקק במים והניחו במהירות את הכובע על הקובטה. בעזרת נייר עדשה, הסר טיפות מים שעלולות להישפך על הקובטה.
בנוסף, השתמש בנייר עדשה כדי להסיר טיפות קטנות שנותרו. הפעל את לייזר ניאון ההליום והתאם את הגדרת התדר כך שהוא יפיק קרן אדומה. לאחר מכן, הפעל את החיישן.
החזיקו את הקובט על דפנותיה המרוכסות והטו אותה בעדינות עד שהנמטודה נמצאת בערך במרכז הקובטה. לאחר מכן, הנח את הקובט על המעמד במערכת האופטית, ומרכז את התולעת בתוך קרן הלייזר הנעה ממראה אחת למראה שתיים. לאחר מכן, מקם את דיודת הצילום בתבנית העקיפה כך שמיקום דיודת הצילום והמקסימום המרכזי של דפוס העקיפה לא יהיו חופפים.
לאחר מכן, סובב את מסנני הצפיפות הנייטרלית כך שתהיה פלט מתח בולט מדיודת הצילום. הקפד להגביל את האור באמצעות מסנן הצפיפות הנייטרלית, כדי למנוע רוויה של דיודת הצילום. קו שטוח מעיד על רוויה יתר או חוסר עוצמה.
לאחר שדפוס העקיפה הנע גלוי, אסוף נתונים עם דיודת הצילום על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה בתוכנה, שליטה באוסילוסקופ תוך ניטור תנועת התולעת. המשך לבצע מדידות עד שהתולעת יוצאת מקרן הלייזר ודפוס העקיפה נעלם. אם הקובט נשרט, השלך אותו ואת התולעת והתחל מחדש.
לאחר כ-20 שניות, הפסק את תהליך איסוף הנתונים על ידי לחיצה על כפתור העצירה בתוכנה של האוסילוסקופ. שמור את הנתונים של כל גירסת ניסיון בתבנית ערכים מופרדים באמצעות פסיקים או טקסט. אסוף לפחות 50 מערכי נתונים עבור כל פנוטיפ והשתמש בשמונה עד 10 בעלי חיים בכל ניסוי.
דוגמאות לתנועת תולעת רציפה ממודלים ודפוסי עקיפה תואמים מוצגות כאן. דפוסי העקיפה המודלים דומים מבחינה איכותית לדפוסי ניסוי ומצביעים על כך שהסימולציה מידלה בהצלחה את הנמטודה. בנוסף, ניתן להראות כמותית את חתימת העקיפה הזמנית של הרולר ו-c elegans מסוג פראי.
כפי שניתן לראות כאן, כל נמטודה מכה בקצבים ובמשרעות שונות. טרנספורמציות פורייה דיגיטליות ממוצעות מאפשרות לזהות את הנמטודה על ידי משרעת ספקטרום תדרי העקיפה שלהן. ספקטרום התולעת מסוג הבר נשלט על ידי תדרים נמוכים יותר מספקטרום תנועת הגליל.
הנה דוגמה לתנודת w שניתן לחשוב עליה כשתי תנועות ים מנוגדות. לעומת זאת, הרולר ייצור לרוב c בצד אחד ונראה כך. בבחינת התדרים, תנועת w מורכבת יותר, וחושפת יותר תדרים נמוכים משניים מאשר תנועת c.
לאחר השליטה, ניתן לאסוף מערך נתונים אחד תוך כשתי דקות אם הטכניקה מבוצעת כראוי. לוקח בערך 20 עד 30 דקות להגדיר את האופטיקה עבור סדרה של מערכי נתונים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל ב-C elegans בזהירות, כדי לשמור על שלמות התנועה שלהם.
בעקבות הליך זה, אנו יכולים ליישם שיטות אחרות כגון שחזור טרקטור וניתוח לא ליניארי כדי ללמוד עוד על תנועת C elegans. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בנוירוביולוגיה לחקור לעומק מוטציות תנועתיות ב-C elegans. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין די טוב כיצד ליצור דפוסי עקיפה עבור נמטודות חיות וכיצד לנתח אותן.
אל תשכח שעבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון אי תנועת הלייזרים בגובה העיניים בעת ביצוע ההליך.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לניתוח עקיפה מבוססת פורייה לצורך אפיון התנועה של C. elegans בזמן אמת. באמצעות ניתוח חתימות עקיפת פראונהופר (Fraunhofer) זמניות, חוקרים יכולים להבחין בין פנוטיפ מסוג wild type לבין פנוטיפ "Roller" על בסיס דפוסי התנועה שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- נוירוביולוגיה
- ביופיזיקה
- מיקרוסקופיה
רקע
- C. elegans משמש כאורגניזם מודל לחקר התנועה והנוירוביולוגיה.
- לכל מין מיקרוסקופי יש ספקטרום פורייה ייחודי שיכול לספק תובנות לגבי התנהגותו.
- ניתוח תנועה יכול לסייע בהבנת התגובות של מינים לשינויים סביבתיים.
- קיימים אתגרים באיתור נמטודות בתוך המערך הניסויי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לניתוח בזמן אמת של תנועת *C. elegans*.
- הבחנה בין פנוטיפים שונים על בסיס דפוסי התנועה שלהם.
- מתן בסיס לניתוח פורייה (Fourier analysis) שניתן ליישום עבור מינים מיקרוסקופיים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמה של לייזר הליום-ניאון ומערכת אופטית לניתוח עקיפה.
- שימוש בדיודה פוטואלקטרית ובאוסצילוסקופ דיגיטלי לאיסוף נתונים על תנועת נמטודות.
- הכנת דגימות של *C. elegans* בסביבה מבוקרת.
- איסוף נתונים וניתוח של תבניות עקיפה לזיהוי מאפייני התניידות.
תוצאות עיקריות
- נצפו תבניות עקיפה מובחנות עבור סוג בר (wild type) וזן Roller של C. elegans.
- ממוצעי התמרות פורייה דיגיטליות חשפו הבדלים בתדרי התנועה.
- השיטה מידלה בהצלחה את תנועת הנמטודות וסיפקה תובנות כמותיות.
- איסוף הנתונים היה יעיל, ואפשר ביצוע מספר ניסיונות בפרק זמן קצר.
מסקנות
- ניתוח עקיפה מבוסס פורייה יעיל לחקר התנועה של C. elegans.
- ניתן להתאים שיטה זו לאורגניזמים מיקרוסקופיים אחרים.
- הבנת דפוסי תנועה יכולה לתרום למחקר נוירוביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת אפיון בזמן אמת, ללא סימון (label-free), של תנועת מיקרואורגניזמים באמצעות אנליזת פוריה של חתימות עקיפה, ובכך מספקת קריאה פנוטיפית כמותית ליישומים בתחומי הנוירוביולוגיה והביופיזיקה. היא תומכת בתיקוף מטרות על ידי קישור מוטציות גנטיות לתוצרי התנהגות מדידים, ובכך מקלה על הפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר לסריקת פנוטיפים של תנועה במינים מיקרוסקופיים, ובכך מחזקת את הביטחון החזוי במערכות מודל.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מתאם בין הפרעות גנטיות לבין ספקטרומים מובחנים של תדרי תנועה.
- ערך תפעולי: מספק סריקה פנוטיפית בזמן אמת ללא סימון, ללא צורך בתגים פלואורסצנטיים או בדווחים גנטיים.
- ערך חיזוי: מבחין בין פנוטיפים של סוג בר (wild-type) לבין פנוטיפים מוטנטיים באמצעות תבניות עקיפה שעברו התמרת פורייה, ובכך תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים של מטרות תנועתיות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור במישור התדר, המתאימים לסריקת פנוטיפים בעלת תוכן גבוה.
- יכולת הרחבה: מאפשרת איסוף של למעלה מ-50 מערכי נתונים לכל פנוטיפ תוך שימוש ב-8–10 בעלי חיים לניסוי, דבר המאפשר חוסן סטטיסטי.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: משמשת כבסיס לניתוח פורייה (Fourier analysis) שניתן להחילו על כל מין מיקרוסקופי בעל חתימות ספקטרליות ייחודיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין פנוטיפים נוירו-התנהגותיים ב-C. elegans לבין ליקויים לוקומטוריים פוטנציאליים הרלוונטיים למחלות במודלים גבוהים יותר.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: משתמש במצועי ספקטרום פורייה כדי לתקף מודלים חישוביים של דינמיקת צורת התולעת, ובכך מגביר את הביטחון במיפויים שבין פנוטיפ לגנוטיפ.
- תמיכה בקבלת החלטות: מאפשר קבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת הניסוי (go/no-go) על בסיס סטייה ספקטרלית בין זנים, ובכך מפחית את העמימות בתיקוף התפקודי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, וממקמת את האפיון הפנוטיפי לאחר המניפולציה הגנטית ולפני זיהוי המולקולות המובילות, וזאת באמצעות אספקת נקודות קצה כמותיות של תנועה לצורך תיקוף מסלולים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי המרת התנהגויות שחייה מורכבות לדפוסי תדר הניתנים לניתוח באמצעות התמרת פורייה.
- סריקה: מספק תוצאות סטנדרטיות מבוססות עקיפה המאפשרות השוואה של פעילות לוקומטורית בין רקעים גנטיים או טיפולים בתרכובות שונות.
- אנליטיקה: מייצר ספקטרומים של תדר-אמפליטודה המאפשרים הבחנה בין זנים פנוטיפיים על בסיס מצבי תנודה דומיננטיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מדדי לוקומוציה מיקרוסקופיים לתפקוד נוירוביולוגי, ובכך תומך בהסברה למודלים פרה-קליניים של הפרעות תנועה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה אופטית ניתנת להעברה לסריקה פנוטיפית מבוססת פורייה במגוון מודלים של מיקרואורגניזמים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הוודאות בתיקוף המטרה באמצעות פנוטיפיקה אובייקטיבית של התנועה במרחב התדרים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות הגדרה אופטית סטנדרטית ונורמליזציה של האות (חילוק בעוצמה המקסימלית).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לפנוטיפיקה מהירה (2 דקות לכל סט נתונים) לאחר הגדרה ראשונית של 20–30 דקות.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכון על ידי כימות הסטייה הפנוטיפית בין זני בר לזנים מוטנטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכיול אופטי ובבטיחות לייזר כדי למנוע רוויה ולהבטיח היווצרות תקינה של תבנית עקיפה.
- תלוי בלייזר הליום-ניאון יציב, פוטודיודה ואוסצילוסקופ דיגיטלי עם קצב דגימה של ≥8 Hz כדי להבחין בתדרי תנועה.
- מחייב טיפול זהיר בדגימות כדי למנוע היווצרות בועות או סטרס לנמטודות שעלול לעוות את החתימות הזמניות.
- כולל העברה ידנית של נמטודות באמצעות מחט מחוט פלטינה, דבר המהווה צוואר בקבוק להתאמה לסריקה בתופעת רב-דגימה (high-throughput).
- מוגבל לאורגניזמים קטנים מספיק כדי להישאר תלויים במסלול הלייזר ללא שקיעה או השפעות של דפנות הכלי במהלך המדידה.
