Name: נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: למד פרוטוקול יעיל לנגזרת שורות תאי גזע עובריים מבלסטוציסטים של עכבר. השיטה משתמשת בתאי מזנם אנושיים כתאי מזון ומספקת יעילות גבוהה ליישומים ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים יונתן לוקאס לסיוע טכני שלו עם תרבית תאים מזין, Servei Estabulari de la UAB עבור טיפול בבעלי חיים, מרטין Domènec עבור הקלטת הוידאו. עבודה זו היא נתמכה על ידי y Ministerio דה Economia Competitividad AGL2014-52408-R ו- Generalitat דה קטלוניה 2014 SGR-524. MVC הוא המוטב של מלגת PIF-UAB.

השימוש של בעלי החיים המתוארים בסעיפים שלהלן אושרה על ידי ועדת האתיקה על חיות והמחקר האנושי של ברצלונה דה Autònoma Universitat ועל ידי Departament d &#39; פסקה חקלאיות וציוד, Ramaderia, אני Alimentació של Generalitat דה קטלוניה (פרוטוקול #8741).
 1. מזין תאים איון ואחסון הערה: העורלה האנושי fibroblasts (HFF-1) היו בעבר קפוא 1 מ"ל של הקפאה פתרון בהיקף של 90% סרום שור עוברית (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד ( דימתיל סולפוקסיד) והם מאוחסנים חנקן נוזלי עד שימוש.
<ol><li>להפשיר בקבוקון קריוגני HFF-1 (1 מ"ל) במועט המבחנה באמבט מים 37 ° C.</li>
	<li>להוסיף את תכולת המבחנה קריוגני המופשרים ומחוממת מראש Dulbecco &#39; s נשר שונה &#39; s בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS לעשות 1:10 דילול.</li>
	<li>זרע התאים מדולל (10 מ"ל) בבקבוקון T75 ואת תרבות אותן ב- CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	<li>למחרת, לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.</li>
	<li>תרבות HFFs את ולשנות את המדיום כל 48 שעות עד התרבות מגיע השלב confluent. פעולה זו עשויה להימשך כ- 7 עד 10 ימים.</li>
	<li>להכין את הפתרון איון, לדלל מיטומיצין C ב- DMEM בתוספת 10% FBS-ריכוז סופי של 10 µg/mL. דגירה התאים עם הפתרון איון עבור h 3-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2.</li>
	<li>להסיר הפתרון איון ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) כדי לסלק שאריות מיטומיצין C.</li>
	<li>כדי לנתק את התאים מוחלש, להוסיף 1 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA ומחוממת מראש ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	<li>לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח שהן מנותק (10 x המטרה עם מפתח נומרי או נה 0.3). אם הם לא, דגירה אותם במשך עוד כמה דקות-CO 37 ° C ו-5% 2. בדוק את התאים שוב תחת המיקרוסקופ הפוך.</li>
	<li>Pipette את הפתרון עם פיפטה פסטר על מנת לבטל כגיהנום תא.</li>
	<li>לנטרל את הפתרון אנזימטי על-ידי הוספת 4 מ ל בתוספת 10% FBS ו resuspend DMEM.</li>
	<li>לקחת את aliquot של התליה תא ולעשות לדילול בטחונות ב- HBSS. כדי לקבוע את מספר התאים, טען µL 10 של הדילול נויבאואר &#39; s קאמרית. לספור את התאים הממוקם באחד הריבועים הגדול של התא תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 x המטרה עם נה 0.45).
	<ol><li>לחזור על הספירה סך של ארבעה ריבועים גדולים. לחשב את המספר הכולל של תאים (N) כמו N = מספר ממוצע של תאים ספרתי x הנפח הכולל x דילול x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifuge לשאר המדגם למשך 5 דקות ב 200 x ג' להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם מקפיא פתרון ריכוז 10 6 תאים לכל mL-</li>
	<li>Aliquot התליה של מבחנות הקפאה עם 10 6 תאים (1 מ"ל) כל. מקם את הבקבוקונים קריוגני במיכל ההקפאה ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס</li>
	<li>למחרת, לאחסן את הבקבוקונים הקפאה בחנקן נוזלי.</li>
</ol> 2. תרבית תאים מזין <ol><li>1-4 ימים לפני התחלת תהליך נגזרת, הפשרה בקבוקון קריוגני המכיל 1 x 10 6 להשבית HFF-1 תאים בתוך אמבט מים ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לגרום לדילול 1:6 המופשרים HFF 1-מראש חימם DMEM בתוספת 10% FBS ולשמור הטמפרטורה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מלא בכל טוב של צלחת 4-ובכן עם 500 µL של ג'לטין מראש ומחוממת 0.2% מן העור חזירי ולשמור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות</li>
	<li>להסיר את µL 500 של ג'לטין מן הבארות ולהוסיף 500 µL של דילול HFFs. רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח התפלגות אחידה של HFFs על החלק התחתון של הבארות. להימנע בתנועות סיבוביות, אחרת התאים יתרכז במרכז הבאר.</li>
	<li>דגירה את הצלחת לפחות 24 h-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי להשיג של טפט של HFFs לא מופעל כל היטב.</li>
	<li>למחרת, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה (10 X המטרה עם נה 0.3) ולבדוק כי הם מחוברים, homogeneously מבוזרת. לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 500 µL של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.</li>
</ol> 3. אוסף העובר ותרבות <ol><li>4 ימים לפני אוסף העובר, לנהל 5 IU של סוסה הרה &#39; s גונדוטרופין סרום בזריקה בקרום הבטן לעכברים נקבה שבוע 6-12. 
	הערה: השתמשנו נקבות 129S2 או זנים B6CFAF1, למרות נקבות מפני זנים אחרים העכבר יכול לשמש. ובכל זאת, כאשר עובדים עם הנקבות ממתירני זנים (למשל כקבוצת), בינוני יש להשלימה עם 2i כאמור בשלב 4.2.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, לנהל 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי על-ידי הזרקת בקרום הבטן, חבר הנקבות עם גברים, זקנים, ביחס של 1:1 לפחות 8 שבועות. להפריד בין הנקבות מן הזכרים למחרת.</li>
	<li>יום לפני איסוף העובר, להכין תרבות 35 מ מ תא צלחת פטרי עם מספר 40 טיפות µL בינוני KSOMaag בתוספת 4 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA), למלא את הצלחת עם שמן מינרלי כדי כיסוי מלא הטיפות. דגירה המנה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי equilibrate של המדיום.</li>
	<li>להכין את העובר מניפולציה פיפטות, מחממים את חלק רזה זכוכית ארוך שקצהו פיפטה פסטר באמצעות מבער בונזן. ברגע רכים, מסירים אותה מן הלהבה ו להפריד את שני הקצוות. לשבור את זה עד לאורך הרצוי. הקוטר הפנימי בקצה צריך להיות 100-150 מיקרומטר.</li>
	<li>המתת חסד העכברים נקבה על ידי נקע בצוואר הרחם 45-48 h פוסט-coitum (p.c.).</li>
	<li>לנתח העכברים לחשוף את חלל הבטן על ידי חיתוך העור עם מספריים חדות מעוקלים חלקה ו של הצפק עם מספריים חדות ישר. תפוס את הרחם אחת עם מלקחיים, לחתוך את oviduct באמצעות מספריים חדות ישר, ולמקם אותו בינוני (HCZB) CZB Hepes באגירה 13-37 ° C. חזור על התהליך כדי להסיר את oviduct אחרים.</li>
	<li>סומק oviducts עם מזרק 1 מ"ל עמוסה HCZB שנערך במקום על ידי שען מלקחיים כדי לאסוף את העוברים 2-תא. 
	הערה: כדי להכין לקחת מחט שטיפה מחט תת-עורית 30 גרם, לחתוך את הקצה על הקרקע עד קצה קהה על אבן שוחקים.</li>
	<li>באמצעות המנגנון פיפטה בפה, לאסוף את העוברים, לכבס אותם במים HCZB, תרבות אותם בצלחת תרבות העובר מוכן קודם לכן ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 עד לשלב הבלסטוציסט. עד 50 עוברי יכול להיות בתרבית בתוך כל טיפה 40 µL. לעקוב אחר התפתחות העובר בכל 24 שעות תחת stereomicroscope. 
	הערה: לחלופין, העוברים ניתן לאסוף בשלב הבלסטוציסט כדי לקצר במבחנה העובר תרבות. במקרה זה, המתת חסד הנקבות ביום 3.5-4.5 p.c., לנתח את הרחם. מדובר עם HCZB.</li>
</ol> 4. תא גזע נגזרת <ol><li>הכנה של הלוחות נגזרת <ol><li>ביום של העובר זריעה, להכין המדיום נגזרת על ידי שכשהם DMEM בינוני עם 100 מיקרומטר 2-β mercaptoethanol, 1 x חומצות אמינו שאינם חיוניים , 20% של החלפת סרום ו- 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>במידת הצורך, גם להוסיף 1 מיקרומטר של המדכא MEK PD0325901 ו-3 מיקרומטר של המדכא GSK3 CHIR99021 כדי לקבל מדיום 2i.</li>
		<li>לוקח את הצלחת 4-ובכן עם טפט של HFFs מוחלש (שלב 2.6) מ חממה. להסיר את המדיום ולהוסיף µL 800 נגזרת מראש ומחוממת בינוני כל טוב. להחזיר את הצלחת החממה.</li>
	</ol></li> <li>העובר זריעה וניקוי Zona pellucida <ol><li>הכנת תרבית תאים של 35 מ מ צלחת פטרי עם µL 30 שלוש טיפות של Tyrode חומצי &#39; s פתרון 14 ו- µL 30 שלוש טיפות של גזירת בינוני. לכסות את הטיפות עם שמן מינרלי ולשמור את המנה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>קח את הצלחת תרבות העובר מן החממה. אחד אחרי השני, להעביר blastocysts את הטיפות התרבות Tyrode חומצי &#39; s פתרון טיפה באמצעות פיפטה מניפולציה של העובר. אם אפשר, בחר רק את blastocysts מורחבת כדי להתחיל את תהליך הערכת.</li>
		<li>לפקח על העיכול zona pellucida תחת stereomicroscope. ברגע pellucida zona נעלמת, להעביר את הבלסטוציסט ירידה בינונית נגזרת על מנת לשטוף את Tyrode חומצי &#39; פתרון s.</li>
		<li>לוקח את הצלחת 4-ובכן נגזרת מן החממה ואת זרע אחד נטול zona הבלסטוציסט במזין תאים היטב לכל.</li>
		<li>להחזיר את הצלחת נגזרת 4-ובכן חממה והתרבות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	</ol></li> <li>בינוני וצמיחה של תאי גזע ניטור לשנות <ol><li>לפקח על התרבויות כל 24 שעות תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 X המטרה עם נה 0.45). חשוב לשים לב אם קיימים סימנים של התמיינות תאי גזע, כגון נפוחות השבירה תאים המקיפים את תוצר או אפילו שדחקו את המזין תאים הצידה.</li>
		<li>בכל יום אחר, לשנות את המדיום של התרבות. לוקח את הצלחת 4-ובכן מן החממה, להסיר את המדיום מכל קידוח ולהוסיף µL 800 בינוני נגזרת מראש ומחוממת עם LIF ו- 2i, אם נעשה שימוש. לשמור על התרבות עד outgrowths שנצפו (6-8 ימים).</li>
	</ol></li></ol> 5. תא גזע תרבות ותחזוקה <ol><li>הכנת Kolle כמו ידיות, פיפטות מניפולציה תאי גזע. בצע צעד 3.4 להכין את תאי הגזע פיפטות מניפולציה בקוטר הפנימי בקצה של 250-300 מיקרומטר. השתמש החלק השני של פיפטה פסטר משך כדי להכין את הידית, כמו Kolle. מחממים ולעצב אותו עד קבלת וו.</li>
	<li>לוקח את הצלחת. ובכן 4 תרבות מתוך החממה ואתר את תוצר תחת stereomicroscope. להשתמש בידית כדי להרחיק את התאים הבדיל ומזינים את המקיפים את תוצר. 
	הערה: כדי להימנע בסופו של דבר הבידול של תוצר, חשוב להסיר את כל התאים הבדיל מהקצה של תוצר.</li>
	<li>וארוקן את תוצר עם פיפטה מניפולציה תאי גזע ולמקם אותו תבשיל חדש בטיפה טריפסין-EDTA 50 µL-</li>
	<li>השימוש באזמל לחתוך את תוצר בכמה חלקים על מנת disaggregate זה מכנית והן enzymatically.</li>
	<li>מיד, להעביר את שברי תוצר לתוך טיפה טריים של גזירת בינוני לנטרל טריפסין פעולה.</li>
	<li>להעביר השברים תוצר צלחת 4-ובכן חדשה עם טפט של מזינים. להעביר עד 10 קטעים מפוצלים טוב ואת תרבות אותם עם נביעה בינוני-CO של 37 ° C ו- 5%-2-</li>
	<li>לשמור על התרבויות תאי גזע דמוי לפחות שישה שבועות לפני בהתחשב הקו mESC הוקמה. לשנות המדיום. כל יום, תת-תרבות אחרים אותם פעם בשבוע.</li>
</ol>

<ol><li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li>
<li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2760894">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li>
<li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).</li>
<li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/pluripotent-stem-cells/conditions-and-techniques-for-mouse-embryonic-stem-cell-derivation-and-culture">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li>
<li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+%28ES%29+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li>
<li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

למרות mESC קו נגזרת היא הליך ידועים בשימוש שגרתי במעבדות רבות, היעילות שלה אינה גבוהה כמצופה לאור הגורמים מרובים יכולים להפריע pluripotency תחזוקה תמיד. במאמר הנוכחי אנו מציגים, צעד אחר צעד, כיצד להקים קווי mESC עם יעילות גבוהה באמצעות פרוטוקול פשוטה ואמינה. היעילות אלה דומים לאלה שדווחו בספרות.
כדי להבטיח יעילות מרבית, חשוב לשלוט התאים כל יום או כל יום אחר, מאז הפעם נקודות המצוין הם רק להמחשה. זה חיוני כדי למנוע את צמיחת יתר של מושבות, מאז זה מעודד את מות תאים ובידול. חשוב גם להפחית ככל האפשר...

תאי גזע עובריים (ESC) הם תאים pluripotent נגזר של עוברי, אשר לשמור על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים1. בהתבסס על מאפיינים אלה, ESC הפכו להיות כלי שימושי עבור רפואה רגנרטיבית מידול המחלה, לימודי הנדסת רקמות2.
ESC נשאבו בפעם הראשונה מעוברים עכבר של, שמקורם קווים העכבר ESC (mESC) עם3,הצלחה נמוך4. במשך שנים, היעילות נגזרת נשאר נמוך בשל הקושי של שמירה על pluripotency חוץ גופית בתוך. חוץ מזה הנוכחות של מזין תאים5, אשר לשפר את יעילות נגזרת, לקדם את המושבה המצורף, לשפר את יציבות karyotypic6, מספר שינויים ההפניה פרוטוקול על שיפור בתחזוקת pluripotency. החשוב ביותר היה התוספת של לוקמיה מעכבים מקדם (LIF) mESC תרבות בינוני7,8, השימוש של העוברים רקע מתירניות 129S29 ומוגדר התרבות של mESC בינונית בתוספת סרום, ללא פוטנציאל התמיינות גורמים10. לאחרונה, ראיות משכנעות הראו כי תוספת של קוקטייל של שני מאפננים מולקולה קטנה של איתות המסלולים למדיום תרבות mESC (המכונה 2i) הוא הטוב ביותר לשמור על pluripotency. 2i קוקטייל כוללת שילוב של החומר המדכא MEK PD0325901, אשר מפחית את האותות בידול על ידי עיכוב מסלול מופעל mitogen חלבון קינאז (MAPK), החומר המדכא GSK3β CHIR99021, אשר משפר הישרדות cell-צפיפות נמוכה על ידי הפעלת מסלול ונ ט11.
במאמר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ביעילות לנבוע mESC קווים העכבר blastocysts. אנו עוקבים אחר הליכים סטנדרטיים, culturing העוברים מן מתירניות זני מזין בתאים נגזרת בינוני עם LIF, החלפת סרום12. בעקבות זה לפרוטוקול, שורות mESC יכולות לנבוע עם היעילות מקבילה לאלו שהושגו 2i בינוני. למרות זאת, ניתן להוסיף 2i כדי למנוע בעיות אפשריות עם pluripotency תחזוקה או בעת עבודה עם זנים שאינם מתירניות.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל שרינג</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>2-&beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 4 בארות</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טירוד חומצית&nbsp;</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>ראה מתכון ב- Nagy et al, 2003. לאחסון לטווח קצר (עד חודש) שמור אותו על 4&ordm;C. לחלופין, לאחסון לטווח ארוך שמור אותו על -20&ordm;C. אם יעילות התמיסה פוחתת, יש להחמיץ אותה על ידי הוספת טיפה קטנה של HCl 1M.&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>עוף נגד עכבר IgG, Alexa Fluor 488</td><td>בדיקות מולקולריות - דילול Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500. נוגדן משני לנוגדנים לעכברים Oct4, Tuj1, &alpha;SMA ו-AFP.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>הרכיבו מחדש עם 2.15 מ"ל DMSO עבור כל מ"ג אבקה, לקבלת תמיסת מלאי של 1 מ"מ. יש לאחסן בנפח הרצוי ולאחסן בטמפרטורה של -20&ordm;C. הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה.&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>השבת אותו לפני השימוש על ידי חימום למשך 30 דקות ב-56&ordm;C. Aliquot ואחסן ב-20&ordm; C</td></tr><tr><td>מחט שטיפה</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td><td>חותכים את קצה המחט וטוחנים לקצה קהה על אבן שוחקת</td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר</td><td>פלוקה</td><td>48724</td><td>מדללים ב-0,2% במים מזוקקים ומבצעים חיטוי. ניתן להשתמש בכל דילול למשך חודש.</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 594</td><td>בדיקות מולקולריות - דילול Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500. נוגדן משני לנוגדנים לארנב Sox2.&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>CZB&nbsp חוצץ Hepes;</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>ראה הרכב ב-Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>דילול ב-NaCl 0.9% ב-50 IU/ml. יש לצרוך אותו ב-1 מ"ל ולאחסן ב-20&ordm; C עד חודשיים. לאחר ההפשרה אין להקפיא שוב.&nbsp;</td></tr><tr><td>פיברובלסטים של עורלה אנושית</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>לאחסון לטווח ארוך מומלץ לאחסן אותם בחנקן נוזלי.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; 10828-028</td><td>רגיש לאור. מומלץ לצטט אותו בכמויות קטנות כמו 10 מ"ל ולאחסן אותו ב-20&ordm; C (בדוק את תאריך התפוגה). הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>תוסף KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>עם 4 מ"ג/מ"ל BSA. שיווי משקל ב-37&ordm; C ו-5% CO2 יום לפני השימוש.</td></tr><tr><td>גורם מעכב לוקמיה</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>עכברים&nbsp;</td><td>צ'ארלס ריבר/הרלן</td><td></td><td>מומלץ להשתמש בעכברים מזן מתירני מבחינת נגזרת mESC (כגון 129S2 או C57BL). עם זאת, זני גזע פחות יעילים בייצור עוברים. לכן, מומלץ להשתמש בזן היברידי, כגון 129S2 x C57BL או B6CBAF1 כדי לנצל את המרץ ההיברידי.</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>נבדק עובר. רגיש לאור.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>להרכיב מחדש את האבקה עם מי MilliQ ב-0.5 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן ב-4&ordm; C מוגן מפני אור. שימו לב, זה מזיק וחשוד כגורם לסרטן.&nbsp;</td></tr><tr><td>עכבר אנטי טובולין ובטא; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>עכבר חד-שבטי אנטי-&אלפא;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>עכבר חד-שבטי אנטי-AFP</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>1:50 דילול</td></tr><tr><td>עכבר חד שבטי אנטי Oct3/4&nbsp;</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-5279</td><td>1:50 דילול</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>Reconstruct עם 2.08 מ"ל DMSO עבור כל מ"ג אבקה, לקבלת תמיסת מלאי של 1 מ"מ. יש לאחסן בנפח הרצוי ולאחסן בטמפרטורה של -20&C. הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה.</td></tr><tr><td>צלחת פטרי (35 מ"מ)</td>צלחת פטרי <td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>(60 מ"מ)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>גונדוטרופין סרום סוסה בהריון</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>מדולל ב-NaCl 0.9% ב-50 IU/ml. יש לצרוך אותו ב-1 מ"ל ולאחסן ב-20&ordm; C עד חודשיים. לאחר ההפשרה אין להקפיא שוב.&nbsp;</td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>T75 בז</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>מדלל 1:10 ב-HBSS לקבלת תמיסה 1x</td></tr></tbody></table>

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

העכבר בתאי גזע עובריים (mESC) נגזרת הוא התהליך על ידי pluripotent אשר נקבעו שורות תאים מעוברים. קווים אלה שומרים על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים. בשל תכונות אלו, mESC הם כלי שימושי ב רפואה רגנרטיבית, מידול המחלה ולימודי הנדסת רקמות. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט להשיג mESC קווים עם יעילות גבוהה נגזרת (60-80%) מאת culturing blastocysts מן העכבר מתירניות זני מזין בתאים במדיום מוגדר עם לוקמיה מעכבות פקטור. הפרוטוקול ניתן גם ליישם ביעילות שואבים mESC קווים העכבר מתירני זנים, תוספת פשוטה של קוקטייל של שני מעכבי מולקולה קטנה למדיום נגזרת (2i בינוני). הליכים מפורטים על ההכנה ועל התרבות של תאים מזין, איסוף של תרבות של העכבר עוברי, נגזרת של התרבות mESC קווים הינם מסופקים. פרוטוקול זה אינו מצריך ציוד מיוחד, יכול להתבצע במעבדה כלשהי עם מומחיות תרבות בסיסיים בתרבית של תאים.

בעקבות פרוטוקול זה, מעל 95% תוצר היווצרות צריך להיות מושגת לאחר השבוע הראשון של תרבות (איור 1 א'). הקמת קווי mESC לאחר 6 מעברים הוא משתנה בין משכפל ניסיוני, עם הצלחה ממוצע של 60-80%. התוספת של 2i לא באופן משמעותי לשפר את התוצאות בעת עבודה עם עכבר מתירניות זנים, כגון אלה עם רקע 129S2, אבל זה הכרחי בעת עבודה עם זנים שאינם מתירניות.
ESC העכבר מושבות צריך להציג מורפולוגיה רגיל צורה שטוחה, מוגדר קצוות כא...

מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

תאי גזע הם תאים פלוריפוטנטיים ומתמחים המאופיינים ביכולתם להתחדש לאורך זמן וביכולתם להוביל להיווצרות של תאים מובחנים משלוש שכבות הנבט בתנאים מסוימים. בשל תכונות אלו, לתאי גזע יש פוטנציאל רב ברפואה רגנרטיבית, במידול מחלות ובהנדסה של בעלי חיים. במשך שנים, קווי תאי גזע עובריים המיועדים למטרות מחקר הופקו בעיקר מעוברים של עכברים, אך באופן כללי, יעילויות ההפקה שהושגות היו נמוכות.בסרטון זה, אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת קווי תאי גזע עובריים של עכבר בתנאים סטנדרטיים, המספק יעילות הפקה גבוהה באופן סביר, הדומה ליעילות המושגת בעת שימוש במודולטורים של מסלולי איתות, כגון 2i. בפרוטוקול זה, נשתמש בפיברובלסטים של עור דפני אדם כתאי מאכילה (feeder cells) להפקת תאי גזע עובריים ולתרביתם. לפני תחילת תהליך הפקת תאי הגזע העובריים, יש לבצע אינאקטיבציה של תאי המאכילה.ראשית, קחו מבחנה קריוגנית של פיברובלסטים מעורתה של בריתה של אדם המאוחסנים בחנקן נוזלי, והפשירה אותה על ידי טבילת המבחנה באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר ההפשרה, דללו את התוכן ב-DMEM המועשר בסרום בקר עוברי. זרעו את התמיסה המדוללת בבקבוק Falcon, וגדלו אותה עד להגעה לשלב ההצפיפות (confluence). לאחר מכן, כדי לנטרל את הפיברובלסטים, דללו mitomycin C ב-DMEM המועשר בסרום בקר עוברי והדגרו את התאים במשך שלוש שעות בתמיסת הניטרול זו.לאחר מכן, הסירו את תמיסת ההשבתה ושטפו את התאים שלוש פעמים עם Hanks'Balanced Salt Solution כדי להסיר שאריות של mitomycin C. כדי לנתק את תאי המזין (feeder cells) המושבתים, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת trypsin-EDTA והדגרירו את התאים למשך חמש דקות. לאחר מכן, בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהם ניתקו מהבקבוק של התרבית.לאחר מכן, העבירו את התאים באמצעות פיפט פסטור (Pasteur pipette) כדי לפרק את גושי התאים, ונטרלו את התמיסה האנזימטית על ידי הוספה של ארבעה מיליליטר של DMEM המועשר ב-fetal bovine serum. קחו אליקווט קטן, דללו אותו בתמיסת סליין, וקבעו את מספר התאים באמצעות תא ניבאוור (Neubauer chamber). במקביל, סבבו בצנטריפוגה את שאר הדגימה.שפכו את הנוזל העליון, ודללו את המשקע בתמיסת הקפאה בריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר. חלקו את התמיה למבחנות קריוגניות. ולבסוף, הניחו את המבחנות הקריוגניות במכל הקפאה והכניסו אותן לטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. למחרת, אחסנו אותן בחנקן נוזלי.יום אחד עד ארבעה ימים לפני תחילת תהליך הגזירה, קחו קריו-מבחנה (cryotube) של תאי מאכל (feeder cells) מנוטרלים השמורים בחנקן נוזלי והפשירו אותה במסבך מים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, דללו את התאים ב-DMEM שחומם מראש ותוממי עוברי בקר (fetal bovine serum), והעבירו בפיפט בעדינות כדי להבטיח תערובת הומוגנית. הוסיפו 500 µL של תמיסת ג'לטין שחוממה מראש לכל באער בלוח בעל ארבעה באערים, והשאירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. מיד לאחר מכן, הסירו את הג'לטין מכל באער.הוסיפו 500 µL מדילול תאי המזינים (feeder cells) לכל באר, ונערו בעדינות את הפלטה כדי להבטיח פיזור אחיד של תאי המזינים בתחתית הבארים. הימנעו מתנועות סיבוביות, שכן אלו ירכזו את התאים במרכז הבאר. לאחר מכן, הכניסו את הפלטה למדגרה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 24 שעות לפחות.ביום למחרת,בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ הפיוכה ובדקו שהם נצמדו ומפוזרים באופן מלא. לבסוף, החליפו את המצע של תאי המזינים ב-DMEM שחומם מראש ותומח ב-fetal bovine serum כדי להסיר שאריות של DMSO. לפני איסוף העוברים, גרמו לסופראולציה בנקבות העכברים על ידי הזרקה תוך-peritoneal של חמישה יחידות בינלאומיות של pregnant mare serum gonadotropin ו-human chorionic gonadotropin במרווח של 48 שעות אחת מהשנייה.המאישו את הנקבות עם זכרים, והפרידו ביניהם לאחר 24 שעות. כדי לאסוף עוברים בשלב שני התאים, בצעו הריגה של הנקבות 48 שעות לאחר ההשבחה, בצעו ניתוח של עכברי הנקבות כדי להוציא את חלבובי הביצוף וחלק קצר של קרני הרחם, והניחו אותם בצלחת עם מצע CZB מנוינץ HEPES. לאחר מכן, שטפו אחד אחד את חלבובי הביצוף עם מצע CZB מנוינץ HEPES תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לאסוף את העוברים.העבירו את העובריים בשלב שני התאים לכלי תרבית שהוכן ביום הקודם עם מספר טיפות של מצע גידול לעובריים המכוסות בשמן מינרלי. שמרו את העובריים באינקובטור עד לשלב הבלסטוציסט. עקבו אחר התפתחות העובריים מדי 24 שעות.העוברים צפויים להגיע לשלב הבלסטוציסט 48 שעות לאחר תחילת התרבית חוץ הגוף (in vitro). במידת האפשר, יש לבחור רק בלסטוציסטים מורחבים (expanded blastocysts) כדי להתחיל בתהליך הגזירה. ביום זריעת העוברים, הכין את המצע לגזירת תאי גזע.הוסיפו גורם מעכב לוקמיה, או LIF, ל-DMEM שסופק ב-2-beta-mercaptoethanol, חומצות אמינו שאינן חיוניות ותחליף סרום KnockOut. במידה ורצוי, הוסיפו מעכב MAPK ומעכב GSK-3 כדי לקבל מצע 2i. הוציאו מהאינקובטור את הפלטה בעלת ארבעת הבארים עם השכבה החד-שכבתי של תאי המזינים.הסיר את המצע, והוסף 800 microliters של מצע גזירה שהוכן זה עתה. לפני זריעת הבלסטוציסטות על תאי המזינים (feeder cells), יש להסיר את ה-zona pellucida. לשם כך, העבר עובר אחד מלוח התרבית לטיפה של תמיסת Tyrode חומצית והשאר אותו שם עד לפירוק ה-zona pellucida.יש לוודא כי ה-zona pellucida הוסרה לחלוטין על ידי כיוון המיקוד והניגודיות של מיקרוסקופ הסטריאו. לאחר מכן, יש לשטוף את העובר נטול ה-zona במספר טיפות של מצע גזירה (derivation medium) ולהנחתו על שכבה אחת של תאי מאכילה (feeder cells). חזרו על התהליך עם שאר העוברים.דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. עקבו אחר התרביות בכל 24 שעות תחת מיקרוסקופ הפוך כדי להעריך את גדילתן ולזהות סימנים מוקדמים פוטנציאליים של דיפרנציאציה, כגון תאים שבירים ונפוחים המקיפים את הצמיחה או אף דוחפים את תאי המזין (feeder cells) הצידה. החליפו את מצע הגידול של התרבית מדי יומיים.כדי לעשות זאת, הוציאו את הפלטה בעלת ארבעת הבארות מהאינקובטור, הסירו את המצע מכל בארה, והוסיפו 800 µL של מצע גזירה מחומם מראש, מועשר ב-LIF וב-2i במידה ובשימוש. החזירו את הפלטות לאינקובטור והמשיכו בתרבית עד להופעת צמיחות (outgrowths). שישה עד שמונה ימים לאחר זריעת הבלסטוציסטה, צמיחה צריכה להופיע, ויש לבצע לה תת-תרבית (subculture).לביצוע פרוצדורה זו, נדרשים ידיות דמויות-cull ופיפטות לטיפול בתאי גזע. כדי להכין אותן, קחו פיפטת פסטור בעלת טיפ ארוך וחממו את חלקה הדק באמצעות מבער בונסן. ברגע שהפיפטה תתרכך, הוציאו אותה מהלהבה ומשכו את שני הקצוות זה מהזה עד להפרדתם.השתמש בחלק העבה יותר כפיפט למניפולציה של תאי גזע. חמם את הקצה של החלק הדק יותר, ועצב אותו עד לקבלת קרס להכנת ידית דמוית-cull. כדי לבצע תת-תרבית (subculture) של הצמיחה, אתר אותה תחת מיקרוסקופ סטריאו.בעזרת הידית, דחפו הצידה את התאים המובדלים המקיפים את הצמיחה (outgrowth). כדי למנוע התבדלות עתידית, חשוב להקפיד על הסרה יסודית של התאים המובדלים מקצה הצמיחה. באמצעות פיפט למניפולציה של תאי גזע, שאבו את הצמיחה והניחו אותה בטיפה של תמיסת trypsin-EDTA שחוממה מראש.בעזרת סקאלפל, חתכו את הגידול (outgrowth) למספר חלקים כדי לפרק אותו באופן מכני ואנזימטי. אספו את שברי הגידול והניחו אותם בטיפה של מצע גזירה (derivation medium) שחומם מראש, כדי לנטרל את פעולת ה-trypsin. לבסוף, זרעו את שברי הגידול לתוך פלטה בעלת ארבעה בארות עם שכבה אחת (monolayer) של תאי מאכלה (feeder cells) ותרבתו אותם במצע גזירה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide.יש לתחזק תרביות דמויות תאי גזע למשך ששה שבועות לפחות לפני שניתן יהיה להגדיר קו ESC כמבוסס. במהלך תקופה זו, יש להחליף את המצע מדי יומיים ולבצע תת-תרבית פעם בשבוע. ככל שמספרי המעברים עולים, המורפולוגיה של המושבות משתנה בהדרגה מצורה של כיפה למורפולוגיה מוארכת ושטוחה יותר.לאחר שישה מעברים, שורות תאי ESC של עכבר מבטאות באופן קבוע סממני פלוריפוטנטיות, כגון Oct 4 ו-Sox 2. יתרה מכך, לאחר השראת התמיינות in vitro של תאי ESC על ידי גידולם ב-DMEM המועשיר ב-10% fetal bovine serum וללא תאי מאכילה (feeder cells), ניתן לזהות סממני התמיינות המייצגים את שלוש שכבות העובר באמצעות אימונופלואורסצנציה. כאן, אנו מראים את זיהוי חלבון anti-tubulin beta-3 כסמן לאקטודֶרמה, alpha-smooth muscle actin למזודֶרמה, ו-alpha-fetoprotein לאנדודֶרמה.בעקבות הליך פשוט זה, ניתן להפיק תאי גזע עובריים מבלסטוציסטות של עכבר ביעילות הנעה בין 60% ל-78%. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבקר את התאים מדי יום או מדי יומיים, שכן זמני ההמתנה המצוינים כאן הם למטרות הדגמה בלבד. אם מושבות של תאי גזע עובריים גדלות יתר על המידה, הן הופכות לכהות יותר בשל הצטברות תאים ונוטות להבדיל (differentiate) בקלות רבה יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של הפקת תאי גזע עובריים של עכבר והתרבייתם בתנאים סטנדרטיים.

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

היכולת של בתאי גזע עובריים אנושיים עצמית לחדש להתמיין לכל סוגי התאים בגוף עולה כי הם מחזיקים הבטחה גדולה עבור שניהם יישומים רפואיים ככלי מחקר להתמודדות עם שאלות יסוד בהתפתחות מחלות. כאן, אנו מספקים תמציתי, צעד אחר צעד פרוטוקול הגזירה של בתאי גזע עובריים אנושיים מעוברים על ידי בידוד immunosurgical של מסת התאים הפנימית.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

שיטה פשוטה לגזור ולשמור גזע spermatogonial ושורות תאי אב מעכברים בוגרים מוצגת כאן. השיטה מנצלת תאים מזינים שמקורם מתא תא סומטי מאשכי העכברים הבוגרים. טכניקה זו היא ישימה זנים נפוצים, כוללים עכבר מהונדס מוחץ, ולדפוק בעכברים.

העשרה סידורית של גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) בתרבות לגזירת קווי SSC מאוסים למבוגרים לזמן ארוך

בשנים האחרונות להיווצרות של תאי הנבט המשתמשים בשיטות תרבות במבחנה הודגמה תוך שימוש בסוגים שונים של תאי גזע סומטיים. מאמר זה יציג חזותי התמיינות של תאי גזע שמקורם יילוד עכבר לתאים דמויי ביצית מוקדמות.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

ניתן להתמיין בתאי גזע עובריים של עכבר לתאי T במבחנה באמצעות מערכת התרבות המשותפת OP9-DL1. הצלחה בהליך זה דורשת תשומת לב קפדנית לתחזוקת ריאגנט/תאים, ושלבים רגישים לטכניקה מרכזית. כאן אנו דנים בפרמטרים קריטיים אלה ומספקים פרוטוקול מפורט לעידוד אימוץ טכנולוגיה זו.

גזירה של תאי T במבחנה מתאי עכבר גזע העובריים

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

מאמר זה נועד להדגים את השימוש בתאי גזע עובריים הפלואידיים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע לבניית עוברים משובטים למחצה.

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

למד פרוטוקול יעיל לנגזרת שורות תאי גזע עובריים מבלסטוציסטים של עכבר. השיטה משתמשת בתאי מזנם אנושיים כתאי מזון ומספקת יעילות גבוהה ליישומים ברפואה רגנרטיבית.

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

גלה סרטונים נוספים