Name: ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: למדו פרוטוקול ניתוח מוח בוגר בדרוזופילה melanogaster עם צביעת אימונופלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות נוירונים וקישוריות במוח הבוגר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות Changhui פאק Alysia Vrailas מורטימר להוראת בתחילה SMK טכניקת ניתוח מוח. אנו מודים גם חברי קבוצת המעבדה של קן Moberg, במיוחד כריס סיבובים, עבור אנושות לקרוא את כתב היד. נוגדנים זיהוי Fas2 (1D 4), chaoptin (24B10) התקבלו מהבנק ליפידים של מחקרים התפתחותיים. נוגדנים 24B10 ועליהן כדי DSHB סימור Benzer ו Nansi Colley24,60,61, נוגדן 1D 4 נמצא כדי DSHB על קורי גודמן 22,23,56. מניות לטוס התקבלו ממרכז מניות בבלומינגטון. . גם אני רוצה להודות את המחקר החקלאי אוהיו ומרכז פיתוח מרכז (OARDC) MCIC הדמיה לשימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי לשיקוף המוחות בכל איור 4A וב' SMK נתמך על ידי מענק של NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

דיסקציה והדמיה השיטה המתוארת לעיל ניתן להשתמש במגוון רחב של immunostaining, גרה יישומי הדמיה. אנו המחולקות פרוטוקול immunostaining כללי, הדגישו דרך אחת שבה MARCM יכול לשמש כדי להמחיש עצב מורפולוגיה של נוירונים בודדים הגוף פטריות. בנוסף, נהלים כלליים אלה יכול לשמש גם עבור הדמיה אחרים אזורים במוח בקבועה או מבוגר טרי ביתור המוח48,65. הדמיה חיה עשוי לספק גישה יעילה יותר בעת ניתוח דפוסי ביטוי של מלכודות משפר, כתב גנים או לחקות קווים66, לדוגמה. כדי למנוע לכידת ממצאים מוות של תאים במהלך הדמיה חיה של GFP ברקמת מבולבל, המוח צריך להיות גזור 1 x מדיה פוספט Buffered מלוחים (PBS) או HL348רכוב על גשר שקופיות 1 x PBS (או HL3), עם תמונה של פחות מ 15-20 דקות טיפול צריך גם להתייחס כדי להסיר את קנה הנשימה רב ככל האפשר של המוח גזור לפני הדמיה, מאז זה יכול להפריע ויזואליזציה של זריחה GFP.
ואילו תנאים מכתימים להערכת המורפולוגיה של נוירונים הגוף, קולט אור פטריות61,יחסית ומבוססת24,67, הלוקליזציה של חלבון ספציפי עניין באלה תא סוגי עשויים לדרוש פתרון מקיף ואופטימיזציה. בפרט, צריך להיות מוטבת מספר שלבים קריטיים, כולל דילול נוגדן, מאגר רכיב ריכוז חסימה של יציבות, כדי להפיק את התוצאות ביותר לשחזור ואמין. ראשית, צריך להיקבע ריכוז אופטימלי של נוגדן ראשוני. למרות נוגדנים זמינים מסחרית יש לעתים קרובות לדילול המוצע (אנחנו לעיתים קרובות בתחילה להפעיל באמצעות הריכוז הזה), ערכים אלה רחוקות נקבעים מדעית על רקמות דרוזופילה . לכן, בדיקה של סדרת דילולים נוגדן ראשוני כי טווח מעל ומתחת החל הצעה היצרן לעתים קרובות התוצאות מכתים יותר ספציפי. בעוד נוגדן ראשוני דילול יכולה להיות השפעה משמעותית על צביעת דיוק בדיוק ייקבע, שכל הזמן מודגרת ב נוגדן ראשוני המכיל פתרונות יכול להשתנות במידה ניכרת עם השפעה קטנה על התוצאה הכוללת. לדוגמה, הבחנו תוצאות דומות כאשר המקננת גזור מוחות עם הנוגדן העיקרי של נוגדן Fas2. בשביל שניים, שלושה, או אפילו ארבעה ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. אמנם אנו ממליצים לפחות שני לילות, יש גם מודגרות המוח בפתרון נוגדן ראשוני לילה יחיד ואנו שהושג מכתים לשחזור. חשוב, להגביל את כמות הזמן המוח מודגרת ב הנוגדן משני ל-3 שעות בטמפרטורת החדר (או לילה אחד ב 4 ° C) מסייעת מגבלת איגוד שאינם ספציפיים של נוגדנים משניים רקמת המוח.
שנית, ייתכן צורך להשתמש נוספים ריאגנטים "חסימה" לחסל את האות הרקע הבלתי רצויים. האפשרויות כוללות הגדלת ריכוז המיתרים ~ 10%, הוספת 1-10% שור אלבומין (BSA) חסימה, ראשי/משני פתרונות נוגדן או טרום ספיחה של נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C עם עוברי דרוזופילה (ראה התייחסות68, סעיף 2.9, שלב 3).
בזמן שכתבנו בפרוטוקול לעיל באמצעות ניידת כמו המאגר המוצע עבור כל קיבעון, לשטוף, נוגדן הדגירה צעדים, קיבוע הרקמה במאגרי אחרים (כגון פיפ ו- PEM, נמצאת טבלת חומרים) עלול לגרום עמוקה הבדלים עוצמת אות. לדוגמה, מחקרים קודמים הדגימו כי Cyclin E הוא לא ניתן לזיהוי בשנת דיסקים דמותי זחל כאשר רקמות המתוקנים ב- paraformaldehyde 4% מסורתיים מדולל ב- PBS, אבל הוא נראה בבירור כאשר רקמות קבועים במאגר פיפ (Moberg קן, אישי תקשורת, ו הפניה69). בנוסף שינויים במאגר רכיבים, משנים את זמן וטמפרטורה עבור קיבוע הרקמה יכול גם להשפיע באופן משמעותי על immunofluorescent מכתים, יכול להיקבע מדעית במידת הצורך. בדרך כלל, קיבוע זמן צריך להיות ארוך מספיק כדי לאפשר crosslinking מספיקות של רכיבי הסלולר, תחזוקה לטווח הארוך של מורפולוגיה הסלולר בסך הכל בעת היותו מוגבל מספיק כדי למנוע נגמר-crosslinking "לקבור" של חלבון epitopes. לכן, כאשר בתחילה מיטוב מכתימים תנאים נוגדן ראשי החדשים שנרכשו, אנו בדרך כלל להגביל את זמן קיבעון כ 20 דקות, לעתים קרובות יהיה לתקן את הרקמות בטמפרטורה קרירה.
מספר פקדים צריכים להיכלל בכל ניסוי immunofluorescence לחקור יחודיות של נוגדנים ראשיים ומשניים, כמו גם את השפעת הרקע הגנטי/transgenes על פנוטיפ שנצפה. לבירור אם הנוגדן העיקרי בשימוש במיוחד מזהה את החלבון עניין, רקמות מהזבובים חסר זה חלבון ו/או רקמות overexpressing החלבון צריך להיות כלול כפקדים. התוספת של אנטיגן מטוהרים עודף חלבון יכולים להיכלל גם כדי לקבוע אם הנוגדן ראשי מזהה אחרים epitopes במוח לעוף. לבסוף, כל אות ניאון נוכח כאשר נוגדנים העיקרי מושמטים מייצג הרמה של איגוד לא ספציפית על ידי הנוגדנים משני שנבחרו.
יש גם לכלול מספר פקדים חשוב להעריך את התרומה של הרקע הגנטי או הנוכחות של transgenes עוצמת מכתימים או מורפולוגיה עצביים. לדוגמה, הזבובים בשימוש הניסוי MARCM באיור 5 להכיל מספר transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, האמבטיה &#62; GAL80, OK107-GAL4), שכל אחד מהם צריך להיות מנותח בנפרד על ההשפעות על הגוף פטריות מורפולוגיה. ב מורפולוגיה מאוד מינימלי, פטריות גוף של הזבובים המכיל OK107-GAL4 והן UAS-CD8-GFP צריך להיות מנותח. זה יכול להיות גם צורך להעריך את ההשפעה של הלם חום ומפליגה Flp הפקה recombinase על פיתוח גוף פטריות על-ידי ניתוח המכילים הן hsFLP והן FRT82B. למרות MARCM יכול לספק תובנה משמעותית אם חלבון נתון שולט באופן עצמאי הדרכה עצב, מספר פקדים נדרש לבצע במדויק מסקנה זו יכול להיות מגבלה מינור של טכניקה זו. בניסויים פחות מסובך, פקדים דומים חלים גם. לדוגמה, קח ניסוי שבו מערכת GAL4/UAS משמש בשילוב עם transgene RNAi לביטוי תמונות ציפורים של חלבון של עניין כל הנוירונים. בניסוי זה, לפחות שני transgenes להיות נוכחים: נהג GAL4 פאן עצבית, כגון elav-GAL4, את transgene UAS-RNAi . המורפולוגיה של הגוף פטריות נוירונים בזבובים המכילים כל אחד מהם את transgenes האלה לבד צריך להיחקר בנוסף התנאי ניסיוני איפה זבובים הנמל בשני transgenes בתוך הזבוב אותו.
לבסוף, כדי לקבוע אם החלבון עניין מתבטאת נוירונים הגוף פטריות יש בדרך כלל צורך המוח הכתם שיתוף עם נוגדנים Fas2. לחלופין, פלורסנט חלבונים כמו GFP, RFP, או הקרום מאוגדים CD8-GFP יכול להתבטא גם באמצעות מערכת GAL4/UAS , בשילוב עם נוגדנים זיהוי החלבון עניין. Fas2 מזהה רק fasciculated האקסונים המהווים האונות α וβ הגוף פטריות, השימוש של CD8-GFP, מונחי-GAL4 ממברנה מכורך מאז שימושי במיוחד עבור סימון הגוף פטריות נוירונים.
פגמים הדרכה עצב לעתים קרובות לא 100% penetrant, אפילו המוח גנוטיפ באותה עשויים להראות כמה השתנות. לכן, כאשר ניתוח החדש שנוצר אללים mutant פגמים הגוף פטריות או קולט אור pathfinding, שילוב של אללים שונים וגישות צריך להיות מנוצל. רוב המחקרים בספרות להשתמש מספר גישות שונות כדי לחקור אם חלבון ממלאת תפקיד התא-אוטונומי שליטה הדרכה עצב: אני) ניתוח של pathfinding פגמים homozygous זבובים null (רצוי באמצעות nu שוניםll אללים), ii) ניתוח של pathfinding פגמים זבובים חסר החלבון עניין רק בנוירונים (בדרך כלל באמצעות RNAi), השלישי) ניתוח MARCM של פגמים pathfinding, ו- iv) להציל את הניסויים איפה הגן מחדש מתבטאות הנוירונים של homozygous null זבובים. באופן אידיאלי, כמה עשרות המוח לכל גנוטיפ צריך להיות מנותח על פגמים מורפולוגיה עצביים.
למרות הפרוטוקול המתוארים כאן מתמקדת בעיקר על לוקליזציה immunofluorescent של חלבונים בתוך רקמת קבועה, מספר יישומים עתידיים של טכניקה זו מפותחים לרקמות מוח חי תמונה. ברגע שכל הם גזור (בדרך כלל בתקשורת התרבות התא), ואז ניתן בתרבית במשך מספר ימים ב 25 º C. השיטות שמחוץ culturing שפותחו במטרה לחקור מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כגון פעילות החלבון לקידום התחדשות האקסון בעקבות פציעה70,71, תאיים דינמיקה איתות72, ההתפתחות העצבית73.

מערכת העצבים דרוזופילה אמנם קטן יותר מזה של בני אדם, מכרסמים, המורכבות שלה מספק מודל חזק, נגיש כדי להבין טוב יותר את עמיתיהם חוליות. במקרים רבים, הגנום של חולייתנים וזבובים לקודד חלבונים דומים מאוד המכתיבים את מנגנוני התפתחות מערכת העצבים. למעשה, רבים של הגנים הדרושים להתפתחות העצבית גולגולת יש orthologs בזבובים, כולל אלה מעורבים איתות המסלולים את השליטה המתבנת, נוירוג'נסיס ו הדרכה עצב1,2,3 4, ,5. לדוגמה, netrin היא ליגנד הנדרש להדרכה עצב יונקים ו melanogaster ד6,7,8. בעוד netrin הופרדה במקור רקמת המוח צ'יק עובריים6, מחקרים מאוחרים יותר גילו ש-netrin הזה משחק תפקיד שנשמרת במהלך הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית עובריים (CNS) דרוזופילה8. מחקרים אחרים השתמשו מסכי גנטית עובריים דרוזופילה CNS כדי לזהות קולטנים הדרושים עבור pathfinding גם דרוזופילה וגם בעלי חוליות9של ליגנדים שנשמרת.
בעוד הזבוב עובריים CNS שימש בהרחבה בעבר כדי לזהות ליגנדים קולטנים, חלבוני איתות תאיים הדרושים עבור הדרכה עצב8,9, עבודה האחרונות חקרה את הדרכים, אשר של חלבונים אלה גם לשלוט pathfinding החלטות במהלך בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות. באופן ספציפי, חקירה של הגוף פטריות (MB) ופיתוח נוירון קולט אור ברשתית (איור 1) סיפקה תובנה המנגנון הזה pathfinding שליטה, היווצרות סינפסה, גיזום האקסון, מספר היבטים אחרים של עצביים פיתוח10,11,12,13,14,15,16,17. קולט אור נוירונים להתחבר הרשתית לעוף לאזורים במוח למבוגרים שנקרא הנדן, לשד הם קריטיים עבור מסירת מידע חזותי למוח (נבדקה על ידי18,19), בעוד הגוף פטריות הנוירונים הם מרכזי ממוקם במוח לעוף, נדרשים עבור20,של למידה וזיכרון -21. נוירונים קולט אור והן את הנוירונים מהותי של הגופים פטריות, המכונים תאים קניון, לנצל מנגנוני שנשמרת אבולוציונית diffusible תלויי-הקשר עצב והדרכה כדי למצוא את המטרות הפוסט-סינפטית. בנוסף להיותו גלוי הזבוב הבוגר, קולט אור, נוירונים MB גם להיות ישירות visualized הזחלים, גלמי עם נוגדנים או כתב גנים22,23,24,25. היכולת בקלות לדמיין אלו שתי קבוצות של נוירונים בנקודות זמן שונות התפתחותית קידם את השימוש בהם כמו דגמים מעולים עבור היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.
בנוסף נעשה שימוש כמודל להבין את המנגנונים של התפתחות מערכת העצבים נורמלי, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי זבובים יכול לשמש גם מודלים מדויק של מגוון רחב של מחלות האדם, לרבות שביר X תסמונת (FXS)26 , נכות אינטלקטואלית (ID)27,28,29,30,31, ואחרים32. לדוגמה, כדי ללמוד את הפונקציה מולקולרית של ZC3H14, גן לאחרונה לקשר אנושי מוגבלות שכלית, יצרנו מודל לעוף של מזהה משתמש של אלל null של הזבוב ZC3H14 ortholog, שנקרא Nab230. זבובים חסר Nab2 יש ליקויי הזיכרון חמורה, מורחב poly(A) זנבות, recapitulating מה נצפית בחולים אנושיים או החולה נגזר תא קווים33,34. חשוב לציין, זבובים חסר Nab2 גם להציג מוחית חמורה מורפולוגיה פגמים שלהם גופות פטריות למבוגרים34, הדומה תצפית בזבובים חסר הגן תסמונת FXS, FMR135. לפיכך, זבובים יכול לשמש אורגניזם מודל חשוב ללמוד גם התפתחות המוח נורמלי וגם מחלות לשבש את זה.
לבסוף, הנגישות של תפוקה גבוהה שיטות לעקוב אחר התנהגות, בשילוב עם המערך העצום של כלים גנטיים זמין, להפוך דרוזופילה אורגניזם מודל של בחירה עבור זיהוי האזורים במוח השולטים התנהגויות מורכבות, כגון למידה, זיכרון, שינה, חיזור, הצמא ואחרים36,-37,-38,-39. כלי שימושי במיוחד נמצא במרכז של גנטיקאי לעוף "ארגז הכלים" היא מערכת GAL4/UAS (איור 2). זו מערכת40,41 משתמש ביטוי ספציפי רקמות activator תעתיק Gal4 כדי להגדיל את הביטוי של גנים או transgenes במורד הזרם של במעלה הפעלת רצף (UAS). שינויים של מערכת זו מאפשרת לחוקרים, לדוגמה, הבקרה בדיוק את דעתנית של נוירונים ספציפיים42,43, overexpress או דפיקה למטה גנים ספציפיים של עניין44, 45, לנתח את הדינמיקה ויווסידן בזמן אמת46ו אקספרס גנים כתב לסימון שושלות עצביים41. השילוב של מערכת GAL4/UAS עם רקומבינציה mitotic אפשרו גם את היצירה של הניתוח פסיפס עם12,מערכת סמן תא Repressible (MARCM)47. MARCM כבר בשימוש נרחב נוירון בודד העקיבה כדי לזהות את מרכיבי התא איתות הדרושים עבור הדרכה עצב12,47. למרות אלה וטכניקות אחרות סיפק מספר תובנות על המנגנונים הסלולר הנדרשות לתפקוד מערכת העצבים, דורשות המוח דרוזופילה קודם להיות שפרופסור; הסרת זהיר של המוח הוא נדרש לשמור תבניות מורפולוגיה וחיבור מוח הנכון בין אזורי המוח. להלן כללי התנהגות משתמש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות כמודוגמה אוכלוסיות עצביים כמו זה מנחה אותך דרך הקרע, המוח דרוזופילה immunofluorescent מכתים של מבוגר.

<table><tbody><tr><td>מיקרו-דיסקציה מלקחיים/פינצטה</td><td>טד פלה</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>צלחות סילגארד</td><td>מערכות חיות מכשור</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>זמין מ-amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2</td><td>מחקרי התפתחות נוגדנים בנק היברידומה</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>מחקרי התפתחות נוגדנים צ'אופטין</td><td>בנק היברידומה</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP נוגדנים</td><td>Aves מעבדה</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 נוגדן משני נגד עכבר עיזים</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 נוגדן משני נגד עוף עיזים</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 נוגדן משני נגד עכבר עז</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde</td><td>שירותי מיקרוסקופ אלקטרונים RT15713</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na מאגר פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na מאגר פוספט dibasic</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>לק לציפורניים</td><td>שירותי מיקרוסקופ אלקטרוני (EMS)</td> <td>72180</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica S6D עם KL300 מקור</td><td></td><td></td>אור LED</tr><tr><td>9 בארות צלחת (צלחת נקודה)</td> <td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutator / נדנדה</td><td>פישר</td><td>22-363-152 או 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>סילגארד</td><td>פישר</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>קימוויפ</td><td>פישר</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>מאגר קיבוע פוטנציאלי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN</td><td></td><td></td><td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, מהווים בדרך כלל 0.5 ליטר של 0.1M NaPhosphate buffer ו-50 מ"ל בכל פעם לפי הצורך</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> PLP <td>2% פרפורמלדהיד, 0.01M NaI04, 0.075M ליזין, 0.037M NaPO4, pH 7.2, ממיסים 0.36 גרם ליזין ב-10 מ"ל H2O + 7.5 מ"ל 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 מ"ל 0.1 M Na2HPO4 על קרח. מיד לפני השימוש, יש לערבב 15 מ"ל מתמיסת ליזין חומצה זו עם 50 מ"ג NaIO4 (נתרן פריודאט) + 2 מ"ל של 20% פרפורמלדהיד בדרגה גבוהה (EMS) + 3 מ"ל H2O</td></tr><tr><td>PEM מאגר</td><td></td><td></td><td>0.1M צינורות pH 7.0, 2 מ"מ MgS04, 1 מ"מ EGTA, ניתן להכין מאגר זה בנוחות כמלאי פי 2 ולדלל אותו ב-8% פרפורמלדהיד (PFA) כדי לתת ריכוז סופי של 4% PFA</td></tr><<tr><td>חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly Stocks זמין מבלומינגטון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>דרייבר GAL4 פאן-עצבי</td></tr><tr><td>w*;;; דרייבר OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4 עבור כל תאי העצב בגוף הפטריות (החדרת OK107-GAL4 נמצאת בכרומוזום הרביעי)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>דוחף GAL4 עבור אונות אלפא ובטא (בכרומוזום השני)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, מנהל התקן UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>GAL4 עבור אונות אלפא ובטא, מכיל גם UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>דוחף GAL4 בעיקר עבור אונות הגמא של גוף הפטרייה (על הכרומוזום השני)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, דרייבר UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>GAL4 עבור אונות גמא של גוף פטרייה, מכיל גם UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; מלאי FRTG13, Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM, מכיל אתר FRT ו-GAL80 על כרומוזום 2</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>מלאי MARCM, מכיל hsFLP, פאן-עצבי GAL4 ו-CD8-GFP על כרומוזום X</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;; FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1); OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>מלאי MARCM להיפוך כרומוזום שלישי</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT40A, Tub>GAL80; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>מלאי MARCM להיפוך כרומוזום 2</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; כטב"ם-CD8-GFP/CyO;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>מלאי MARCM להיפוך כרומוזום</td></tr><tr><td>X y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP מסמן את פני התא (CD8 הוא חלבון טרנסממברני)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, מלאי UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM, מכיל אתר FRT ו-CD8-GFP בכרומוזום השני</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; מלאי Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM, מכיל hsFLP ו-CD8-GFP על כרומוזום X</td></tr><tr><td>w*; מלאי FRTG13, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM, מכיל אתר FRT ו-GAL80 בכרומוזום</td></tr><tr><td>השני y(1), w*;; מלאי FRT82B, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM, מכיל אתר FRT ו-GAL80 על כרומוזום שלישי</td></tr></tbody></table>

ניתוח immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

פיתוח מערכת העצבים כרוכה בביצוע סידרת אירועים שפעילותם מתואמת על ידי מספר איתות המסלולים, רשתות בקרה רגולטריות רציפים. רבים מן החלבונים המעורבים המסלולים הללו אבולוציונית נשמרים בין יונקים אחרים פרוקריוטים, כגון זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster, רומז כי עקרונות ארגון דומה קיים במהלך הפיתוח של אלה אורגניזמים. חשוב לציין, דרוזופילה שימש בהרחבה כדי לזהות מנגנונים תאית ומולקולרית ויסות תהליכים הנדרשים אצל יונקים לרבות נוירוג'נסיס, בידול, הדרכה עצב synaptogenesis. זבובים שימשו גם בהצלחה לדגם מגוון רחב של מחלות התפתחותיות אנושי. כאן נתאר פרוטוקול עבור microdissection שלב אחר שלב, קיבוע, לוקליזציה immunofluorescent של חלבונים בתוך המוח דרוזופילה למבוגרים. פרוטוקול זה מתמקד שתי האוכלוסיות עצביים דוגמה, הגוף פטריות נוירונים, photoreceptors ברשתית, וכוללת שלבים אופציונליים כדי לעקוב אחר נוירונים בודדים הגוף פטריות באמצעות ניתוח פסיפס עם טכניקה סמן תא Repressible (MARCM). נתונים לדוגמה המוח פראי-סוג והן מוטציה מוצגים עם תיאור קצר של קריטריון הבקיע עבור הדרכה עצב פגמים. פרוטוקול זה מדגיש שני נוגדנים ומבוססת על חקירת המורפולוגיה של הגוף פטריות ואילו נוירונים קולט אור, אחרים אזורים במוח דרוזופילה , הלוקליזציה של חלבונים בתוך אזורים אחרים במוח יכול להיות גם חקר באמצעות פרוטוקול זה.

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה לדיסקציה של מוח זבוב הדרוזופילה (Drosophila) היא להשיג מוחות שלמים מזבובים בוגרים שניתן להשתמש בהם במגוון רחב של יישומים, כגון אימונופלואורסצנציה, מיקום של חלבונים המסומנים ב-GFP וניסויי תרבית ex-vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית ומדעי המוח, כגון תפקידם של חלבונים ומסלולי איתות ספציפיים וקביעת דפוסי קישוריות נוירונלית במהלך התפתחות המוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שברגע שהיא נלמדת היטב, היא מספקת שיטה מהירה ואפקטיבית לזיהוי אימונולוגי של פגמים מורפולוגיים באזורים ספציפיים של המוח הבוגר.ייתכן שיהיה קשה ללמוד את ההליך הזה, כיוון שהסרת השלד החיצוני מראש הזבוב דורשת זהירות רבה וניסיון. התנועות חייבות להיות איטיות ומדויקות, וזרועות הדיסקטור חייבות להיות נתמכות היטב כדי לשמור על יציבות. מומלץ להתאמן על זבובים בעלי עיניים אדומות ולאחר מכן על זבובים בעלי עיניים לבנות, לפני ביצוע נתיחה של גנוטיפים רלוונטיים עבור ניסויים בפועל.כדי להכין את התשתית לניתוח, הניחו את הזבובים המורדמים הרלוונטיים על משטח מתכת קר או בתוך צלחת פטרי המונחת על קרח. לחלופין, השתמשו במשטח זבובים הפולט פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, הניחו כמות קטנה של PTN במרכז צלחת הניתוח כדי ליצור בועה של PTN.לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, מלאו את שדה הראייה בבועת PTN תחת תאורה אחידה. כעת, הניעו את הזבובים כך שיהיו גבם כלפי מטה, והעבירו כל זבוב אחד-אחד אל תוך ה-PTN באמצעות תפיסת הבטן. טבלו את החיה לחלוטין ב-PTN, ובצעו את כל תהליך הנתיחה כאשר היא טבולה ב-PTN.בעזרת זוג פינצטות שני, תפסו את הproboscis ומשכו את הראש מהגוף. לעיתים, הproboscis יוסר אך הראש יישאר מחובר לגוף. אם זה קורה, תפסו את הקצה המדיאלי של רשתית אחת והפעילו כוח לטרסו כדי להסיר את הראש.השליכו את הבטן והבית. קריטי להשאיר את הראש ב-PTN במהלך שלב זה. קשרים מהמוח המרכזי ל-VNC אינם ניתנים לניתוח בשיטה זו.בשלב הבא, אחזו את השפה המדיאלית של הרשתית השמאלית בקצה החור המרכזי בקוטיקולה, ומשכו את הפינצטות לאט ובצורה ישירה אחת מהשנייה כדי למנוע את קריעת האובלס האופטי (optic lobe), שהוא המבנה העמום המכוסה בטרכיאה לבנה וסיבית. ככל שהרשתית תתנתק, תורגש ירידה קלה במתיחות. כדי למנוע את קריעת המוח, חשוב מאוד לאחוז בשפה המדיאלית של כל עין ולמשוך את הפינצטות לאט מאוד אחת מהשנייה.תנועה מהירה מדי עלולה להוביל לשינוי במורפולוגיית המוח או לנזק לרקמת המוח. כפי שמוצג כאן, תפסו את הקוטיקולה בכל זוג פינצטות ומשכו אותן באיטיות רבה לכיוונים מנוגדים. אם הפעולה בוצעה כהלכה, הקוטיקולה אמורה להיפרד מרקמת המוח, כך שהמוח יישאר שלם.שלב זה דורש פינצטה חדה מאוד. לאחר מכן, הסירו בזהירות את הקוטיקולה הסובבת חלק אחר חלק. בעת הסרת קוטיקולה הדבקה במיוחד, ניתן לסייע בקיבוע המוח על ידי אחיזה ב-VNC שנותר, כדי למנוע מעיכה של המוח.לבסוף, השתמשו בפיפט P200 כדי להעביר את המוחות המנוסחים לבאר בלוחית המלאה ב-PTN לצורך קיבוע וצביעה אימונוהיסטוכימית. תחת המיקרוסקופ, השתמשו בפיפט P200 כדי להעביר 10 עד 15 מוחות מנוסחים מאותו גנוטיפ למבחנה מיקרו-צנטריפוגית בנפח 0.5 milliliter המלאה ב-4%paraformaldehyde המדולל ב-PTN. לאחר מכן, דגרו את המוחות למשך 20 דקות עם נעירה איטית בטמפרטורת החדר.לאחר הקיבוע, יש להמתין עד שהמוחות ישקעו לתחתית המבחנה, ולאחר מכן להסיר את חומר המקבע. בשלב הבא, בצעו שתי שטיפות מהירות עם 500 µL של PTN לכל שטיפה. החליפו את ה-PTN מיד עם שקיעת המוחות במבחנה.בשלב הבא, בצעו שלושה שטיפות ארוכות ב-PTN תוך כדי ערבוב עדין בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפות אלו, ניתן לאחסן את המוחות למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C ב-PTN. לאחר הסרת שטיפת ה-PTN האחרונה, הדגירו את המוחות ב-0.5 milliliters של תמיסת חסימה למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב עדין.לאחר הסרת תמיסת החסימה, הוסיפו את הנוגדנים הראשוניים המדוללים בתמיסת חסימה, ודגרו את המוחות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך יומיים תוך써 ערבוב עדין. הסירו את הנוגדן הראשוני באמצעות פרוטוקול השטיפה בן חמש השטיפות של PTN. לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדנים המשנייים.הדגה את הנוגנים הללו עם הרקמות למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר, תחת הגנה מאור ובסיוע של תנועת נדנוד. לאחר הדגחת המוחות בתמיסת הנוגדים המשניים, בצע את פרוטוקול השטיפה של PTN. כס את הדגימות בנייר אלומיניום לאחר כל שטיפה, ובסיום הסר כמה שיותר מהבופר.לאחר מכן, הוסיפו 75 µL של תמיסת קיבוע פלואורסצנטית למניעת דהייה (anti-fade mounting medium), והעבירו את המוחות והתמיסה פנימה והחוצה מקצה הפ pipette פעם אחת בלבד. ניתן לעטוף את הפסנול בנייר אלומיניום ולאחסנו בטמפרטורה של 4 °C למשך מספר ימים, אך באופן אידיאלי, יש להמשיך ישירות לשלב הקיבוע. כדי לקבע את המוחות, הכינו שקף גשר (bridge slide).מקמו שני כיסויי זכוכית (cover slips) במרחק של כ-1 סנטימטר זה מזה על עלית זכוכית טעונה חיובית. ודאו שהצד הטעון חיובית פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הדביקו את כיסויי הזכוכית לעלית באמצעות לק לציפורניים, והמתינו לייבוש מלא של הלק לפני ההמשך.בשלב הבא, הנח את העששית תחת מיקרוסקופ סטריאו, והעבר באמצעות פיפטה את המוחות ואת המצע אל החלל שבין כיסויי הזכוכית. ודא כי התאורת כווננה כדי לשפר את הנראות של המוחות. לאחר מכן, שאב את עודפי מדיום ההרכבה מהעששית, תוך הקפדה להימנע ממגע עם המוחות.לאחר מכן, ספגו את עודפי מדיום הקיבוע שנותרו. פעולה זו תאפשר מיקום מדויק יותר של המוחות. כעת, בעזרת פינצטה, סדרו את המוחות בתבנית של רשת, כאשר האונות האנטנליות (antennal lobes) פונות כלפי מעלה.לאחר מכן, הניחו זכוכית כיסוי מעל המוחות, והשתמשו בלק לציפורניים כדי לאטום את שולי זכוכית הכיסוי העליונה המחוברת לזכוכית הכיסוי התחתונה. כעת, מלאו את החלל המרכזי בטיפות של מדיום הרכבה טרי, ואפשרו למדיום להיספג תחת זכוכית הכיסוי על ידי פעולת נימיות. כאשר החלל מלא, אטמו אותו לחלוטין באמצעות לק שקוף לציפורניים.ניתן להשתמש בשיטה המתוארת כדי להמחיש כמעט כל מבנה במוח של בוגר, כולל גופי הפטריות (mushroom bodies). אזור זה של המוח נחוץ ללמידה ולזיכרון. ניתן להמחיש בקלות את גופי הפטריות באמצעות נוגדנים המזהים את חלבון ה-fasciculin 2.חלבון זה מובע ברמה גבוהה באונות אלפא ובבטא, וכן בגוף האליפסואידי הממוקם במרכז. טכניקה זו אפשרה זיהוי של תהליכים תאיים מרובים הדרושים להכוונה תקינה של אקסונים של נוירונים בגוף הפטרייה. שיבוש של תהליכים אלו גורם למגוון רחב של פנוטיפים מוטנטיים, כגון השלחה לא תקינה של אקסונים על פני אזור קו האמצע של המוח ואונות אלפא חסרות.פנוטיפים מוטנטיים אלו הם לרוב בעלי חדירות חלקית, ולכן הם דורשים בדיקה של מספר מוחות. כדי לבחון את התפקיד האוטונומי של חלבון בהכוונת אקסונים, ניתן להשתמש גם בטכניקת Markham כדי להנחית ויזואלית החלטות של הכוונת אקסונים של נוירונים בודדים, מוטנטיים או מסוג wild-type, הפלווריסצנטיים ל-GFP, על רקע של wild-type שאינו פלווריסצנטי. השיטה המתוארת כאן מאפשרת ויזואליזציה מהימנה וניתנת לשחזור של כמעט כל אזור במוח של זבוב הדרוסופילה (Drosophila) בוגר.כאן התמקדנו בנוירונים של גוף הפטרייה (mushroom body). בגרסת הטקסט של פרוטוקול זה, הדגמנו גם ויזואליזציה של האונות האופטיות. מחקרים אחרים השתמשו בטכניקות דומות כדי לבצע ויזואליזציה של ה-pars intercerebralis, נוירוני השעון ונוירוני ההקרנה של אונה האנטנה, בין היתר.לאחר רכישת מיומנות, ניתן לנצח כל מוח בתוך 3 עד 5 דקות, במידה שהפעולה מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לייצב את הזרועות בקרבת המיקרוסקופ. כמו כן, חשוב לנוע לאט ולהסיר חתיכות קטנות של ה-cuticle אחת אחת.תנועה מהירה מדי עלולה לגרום לנזק בלתי רצוי לרקמת המוח שמתחתיה. בנוסף לשימוש במוחות מנותחים עבור ניסויי מיקרוסקופיה מבוססי אימונופלורסצנציה, ניתן להשתמש ברקמת המוח גם לניסויים נוספים.

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח את מערכת העצבים המרכזית של הזחלים third תסיסנית instar.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

סרטון זה מתאר שיטה להרכבת מוחות שלמים מזבובים בוגרים מתחת למגלשת גשר ומציג את הפרוטוקול המבוצע על מוחות מוכתמים חיסונית עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הרכבת מוחות דרוזופילה בוגרים: שיטה להכנת שקופיות לדימות קונפוקלי

סרטון זה מתאר כיצד לנתח ולבודד את מוח הדרוזופילה הבוגר – הליך הכרחי לדמיון האיבר, שאחרת מוסתר על ידי הקוטיקולה, העין ורקמת קנה הנשימה. הפרוטוקול לדוגמה מראה הדגמה מפורטת המניבה תכשירים באיכות גבוהה שניתן להשתמש בהם לשיטות אימונוסטיין והדמיה בנוירוביולוגיה של דרוזופילה.

דרוזופילה דיסקציה מוחית של מבוגרים: שיטה בנוירוביולוגיה של זבובים

סרטון זה מדגים פרוטוקול חיסוני מפורט כדי להמחיש פגמים פנוטיפיים בגופי הפטריות של מוחות דרוזופילה מוטנטיים. הפרוטוקול כולל שימוש בנוגדנים נגד Fas2, חלבון המעורב בהנחיה אקסונלית המאפשרת התפתחות מורפולוגית ותפקודית תקינה של גוף הפטרייה.

הדמיה של תאי עצב בגוף פטריות במוחות דרוזופילה באמצעות צביעת מערכת החיסון

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

המוח תסיסנית הבוגרת הוא מערכת יקרה ללימוד מעגלים עצביים, תפקוד מוח גבוה, והפרעות מורכבות. שיטה יעילה כדי לנתח רקמות מוח כולו מראש הזבוב הקטן תקל מחקרים מבוססי מוח. כאן אנו מתארים פשוט, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע שלושה המושרה הנגרמת לפציעה מניוון (אקסון מוות) בחני ילה melanogaster כדי להעריך את השימור מורפולוגית ופונקציונלית של אקסונים קטוע הסינפסות שלהם.

הערכה מורפולוגית ופונקציונלית של Axons וסינפסות שלהם במהלך מוות Axons בדרוסופילה מלאנוסטר

פרוטוקול זה מתאר שלושה שלבים להכנת אונות אופטיות דרוזופילה בוגרות של זחלים ובוגרים להדמיה: 1) דיסקציות מוחיות, 2) אימונוהיסטוכימיה ו-3) הרכבה. דגש מושם על שלב 3, שכן נדרשים כיווני הרכבה ברורים כדי לדמיין מבנים ספציפיים של האונה האופטית.

דיסקציה, אימונוהיסטוכימיה והרכבה של מוחות זחלים ודרוזופילה בוגרים להדמיית האונה האופטית

מחקר זה מציג פרוטוקול פשוט לעיבוד רקמות הכולל עריפת ראש, קיבוע, קריוסקציה, צביעה פלואורסצנטית, צביעה חיסונית והדמיה, שניתן להרחיב להדמיה קונפוקלית ורב-פוטונית. השיטה שומרת על יעילות דומה לדיסקציות מורכבות, ועוקפת את הצורך במיומנויות מוטוריות מתקדמות. ניתוח תמונה כמותי מספק פוטנציאל חקירה נרחב.

הקפאה ישירה של ראשי דרוזופילה לצביעה פלואורסצנטית משופרת של המוח וצביעה חיסונית

למדו פרוטוקול ניתוח מוח בוגר בדרוזופילה melanogaster עם צביעת אימונופלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות נוירונים וקישוריות במוח הבוגר.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

גלה סרטונים נוספים