סמים מבוססי Cytometry זרימה מערכת הסינון לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים התמיינות של תאי גזע גליובלסטומה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנן ספריות מולקולות קטנות עבור חומרים המקדמים התמיינות אסטרוגליאלית בתאי גזע של גליובלסטומה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי הגזע הסרטניים, כגון מהם מסלולי האיתות הנדרשים לשמירה על תאי גזע של גליובלסטומה במצב לא ממוין. ביצוע נכון של טכניקה זו מאפשר זיהוי ישיר של מולקולות קטנות המקדמות התמיינות תאי גזע של גליובלסטומה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בגליובלסטומה של אהלרס-דנלוס מכיוון שהפחתת אחוז תאי הגזע של גליובלסטומה עשויה להפחית את הסבירות להישנות. ניתן ליישם שיטה זו גם להגדרת התמיינות לשושלות תאים אחרות באמצעות מבני מדווח אחרים. הדו"ח שלנו הוא הראשון שביסס גישה לתפוקה גבוהה כדי לסנן חומרים שמאלצים תאי גזע של גליומה להתמיין.

עבודה עם חלקיקי לנטי-וירוס בתאי סרטן שמקורם בחולים יכולה להיות מסוכנת ביותר. לכן יש להקפיד תמיד על נוהל סטנדרטי לעבודה עם פתוגנים הנישאים בדם. כדי להתחיל, זרעו מיליון תאי גזע של גליובלסטומה או GSCs בשני מיליליטר של מצע גידול תאי גזע עצביים שלם בצלחת של שש בארות.

לאחר מכן, התמרו את התאים עם מדווח ה-lentivirus בריבוי זיהומים השווה לחמש. לתערובת התאים והנגיפים, הוסיפו שני מיקרוליטרים של פוליברן כך שהריכוז הסופי יהיה שמונה מיקרוגרם למיליליטר, ודגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הלילה. לאחר הדגירה, החלף את מצע הגידול כדי להסיר נגיף לא קשור.

ותאי צנטריפוגה ב -360 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו בזהירות תאי בינוני וצלחת בחזרה בצלחת של שש בארות. והמשיכו לדגור על התאים למשך 24 שעות.

קציר 0.5 מיליליטר מנפח התרבות הכולל. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב -360 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השעיה מחדש של תאים במדיום גידול תאי גזע עצביים טריים של 0.5 מיליליטר.

הנח את הצלחת בחזרה בחממה כדי לאפשר התרחבות למשך 72 שעות לפחות. מוסיפים 200 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה ודוגרים במשך חמש דקות באמבט מים המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס. נתק תאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בעדינות.

לתאים המנותקים הוסף 800 מיקרוליטר של HBSS כדי להבטיח חיבור או צבירה מינימלית של תאים. לאחר מכן, העבירו 200 מיקרוליטר מכל מתלה תאים לבארות של צלחת 96 רב-בארות. קבע את אחוז התאים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק על ידי ציטומטריית זרימה.

רשום לפחות 10,000 תאים ברי קיימא בכל רכישה. בכל ניתוח ציטומטרי זרימה השתמש בתאים הוריים שאינם מתמרים או בתאים שאינם פלואורסצנטיים שהועברו וקטור כדי לבסס פלואורסצנטיות בסיסית. לבחור ולהרחיב תת-שיבוטים בודדים תאי זרע בצפיפות של 0.7 תאים לבאר ב-100 מיקרוליטר של מדיום תאי גזע עצביים בצלחת של 96 בארות.

שמור על שיבוטים אלה בתרבית למשך 11 יום. חפשו נוירוספרות בקוטר של יותר מ-100 מיקרון. קבענו בעבר את גודל החתך הזה כדי לקבוע בדיעבד אם הנויאורספירה נוצרה על ידי תא גזע גליובלסטומה המתחדש מעצמו.

גודל חתך זה עשוי להזדקק לאופטימיזציה בעת עבודה עם מודלים שונים של תאי גליובלסטומה. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן FITC וסמן בארות המכילות נוירוספירה אחת שבה כ-1% עד 5% מהתאים חיוביים ל-GFP. לאחר הסימון, הרחב שיבוטים בודדים עד שיהיה מספר מספיק של תאים זמין לניתוח ציטומטריית זרימה.

בהנחה ששיבוטי המדווח מכילים 1% עד 5% מהתאים החיוביים ל-GFP, קצרו 0.5 מיליליטר מכל שיבוט יחד עם כמות שווה של תאי ביקורת שאינם מתמרים כדי לקבוע את האחוז המדויק של תאים חיוביים ל-GFP. לאחר גלולת תאים ב-360 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, שאפו את הסופרנטנט. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה לכל גלולה ודגר את הצינורות באמבט מים המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, יש לשלש את התאים כ-20 עד 30 פעמים כדי להשיג תרחיף של תא בודד. לאחר מכן הוסף 800 מיקרוליטר של HBSS כדי להבטיח חיבור או צבירה מינימלית של תאים. כעת העבירו 200 מיקרוליטר מכל תרחיף תאים לבארות של צלחת 96 רב-בארות.

לבסוף, בצע ציטומטריית זרימה, ורשום לפחות 10,000 תאים ברי קיימא בכל רכישה. כדי להעריך את היכולת הקלונוגנית, הכינו תרחיפי תאים בודדים של תת-שיבוטים מדווחים על התמיינות על ידי טריטורציה של התאים כ-20 עד 30 פעמים. לאחר מכן צלחו את התאים הללו ב-100 מיקרוליטר של מדיום גידול תאי גזע עצביים שלמים בצפיפות של כ-5 עד 500 תאים לבאר ב-96 צלחות מרובות בארות.

שמור על תאים אלה בתרבית במשך תשעה עד 11 ימים. חפש נוירוספרות תחת מיקרוסקופ אור. באר המכילה לפחות נוירוספירה אחת גדולה נחשבת חיובית.

בהתחשב בתאים הוריים שאינם מתמרים ותאים מתמרים חיוביים לנטי-וירוס כקלט בקרות, סך הבארות שנותחו ומספר התאים החיוביים בממשק המקוון של ELDA. כדי להתחיל בסינון, צלחת 5000 תאים ב-99 מיקרוליטר של מדיום גידול תאי גזע עצביים שלמים בצלחת של 96 בארות. לאחר מכן עם פיפטור 12 ערוצים לטפל בתאים עם ריכוז סופי של שני מיקרו-מולרים של תרכובות ספרייה מדוללות או עם בקרת DMSO.

דגרו על התאים למשך 72 שעות. כעת הוסיפו 150 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה של תאים באמצעות פיפטור בן 12 תעלות בכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן יש לשלש בעדינות את התאים בכל באר כ-20 עד 30 פעמים באמצעות פיפטור בעל 12 ערוצים עד להשגת תרחיף תא בודד.

כעת בצע ציטומטריית זרימה וקבע את אחוז התאים המבטאים את מדווח GFAP:GFP. ראשית קבע את גודל התא ואת הכדאיות מהפיזור קדימה והצד ושער את אוכלוסיית התאים הקיימת. לאחר מכן קבע את התאים החיוביים ל-GFP בתוך אוכלוסיית התאים הקיימת.

עלייה באחוז התאים החיוביים ל-GFP בשלוש סטיות תקן על פני בקרות נחשבת לפגיעה חיובית שניתן להתאים אותה כדי להתאים להעדפת המשתמש להחמיר. מוצגות תמונות מייצגות של תת-שיבוטים HSR-GBM1 GSC המבטאים רמות נמוכות וגבוהות של GFAP:GFP. תת-השיבוטים החיוביים לביטוי GFAP:GFP נבחרו על ידי זרימה ציטומטרית עבור קו הנוירוספרה שמקורו בחולה.

כאן, GFAP:GFP נמוך מציין שפחות מ-5% מהתאים בשיבוט הם חיוביים ל-GFP, בעוד ש-GFAP:GFP גבוה מציין שיותר מ-75% מהתאים בשיבוט הם חיוביים ל-GFP. תוצאות אלה מראות כי יכולת החידוש העצמי במבחנה של תת-שיבוטים נמוכים של GFAP גבוהה יותר מעמיתיהם בעלי GFAP גבוה כפי שנקבע על ידי ELDA. לכן תת-שיבוטים של GH מובחנים יותר מתת-שיבוטים של GL.

לבסוף, ספריות תרופות נבדקו כדי לזהות חומרים המסוגלים לגרום להתמיינות אסטרוגליאלית ב-GSCs. 12 תרופות נמצאו כמגדילות משמעותית את אחוז התאים המבטאים את מדווח GFAP:GFP. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שבועות אם היא מבוצעת כראוי.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת alamarBlue, בדיקה קלונוגנית במדיה חצי מוצקה, הזרקת קסנוגרף מאגף או תוך גולגולת על מנת לענות על שאלות נוספות כמו השפעת תרופות סלקטיביות על התפשטות תאית וקלונוגניות במבחנה וגידול in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות תרכובות המסוגלות לגרום להתמיינות אסטרוגליאלית בתאי גזע של גליובלסטומה.