אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

המטרות הכלליות של פרוטוקול זה הן להשרות מחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T ספציפיים לאקוואפורין 4, ולנטר את ההשפעות הנובעות מכך על מערכת העצבים המרכזית ועל מערכת הראייה הדינמית. שיטה זו תסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לתפקידם של תאי T ספציפיים לאקוואפורין 4, המוכר בדרך כלל כ-AQP4, בניורומיליטיס אופטיקה וכן בהפרעות ראייה דלקתיות אחרות. היתרון המרכזי של טומוגרפיה בקוהרנטיות אופטית (OCT) הוא היכולת לבצע ניטור לאורכי של פגיעה ברשתית באופן לא פולשני.

את הפרוצדורה תדגים שרון סגן (Sharon Sagan), עובדת מחקר במעבדתי, יחד עם אנדראס קרוז הרנס (Andreas Cruz Harans), עמית במעבדתו של RE Greens. התחילו בחיבור ברור nylon תלת-כיווני עם שני חיבורי Luer lock זכרים למזרק זכוכית עם Luer lock ללא הבוכנה. העבירו את ידית הברבור לכיוון המזרק כדי לסגור אותו, והניחו את המזרק כך שהקצה הפתוח פונה כלפי מעלה.

לאחר ערבוב בוורטקס, הוסף למזרק נפח שווה של פפטיד ומספר פרוינד מלא (Complete Freund's Adjuvant), והחזר את בוכנת הזכוכית אל המזרק. תוך כדי החזקת הבוכנה במקומה, הפוך את המזרק כך שהברז פונה כלפי מעלה, והעבר את המנוף לחיבור הנקבי שאינו בשימוש. לחץ בזהירות על הבוכנה כדי להוציא את עודפי האוויר מהמזרק.

התמיסה תמלא את חיבור ה-Luer lock הזכר השני של הברז. לאחר מכן, חברו מזרק זכוכית שני, כאשר הבוכנה מוכנסת עד הסוף, אל חיבור ה-Luer lock הזכר השני. כדי ליצור אמולסיה, לחצו לסירוגין על הבוכנות כדי להעביר את התמיסה בין שני המזרקים במשך כד שתי דקות, וקררו את התמיסה למשך כ-10 דקות עד שיהיה שינוי נראה לעין בצמיגות של התמיסה.

כאשר נוצרת אמולסיה לבנה סמיכה מאוד, העבירו את כל התמיסה לאחת המזרקים, והחליפו את המזרק הריק במזרק Luer lock חדש בנפח של מיליליטר אחד. מלאו את המזרק החדש באמולסיה. נתקו את המזרק מהברז (stopcock), וחברו מחט בכיול 25-gauge.

כדי לבדוק את עקביות האמולסיה באמצעות מים, פלט טיפה מהאמולסיה לתוך צלחת קטנה עם מים. אם האמולסיה אינה מתפזרת, היא מתאימה להזרקה. לאחר מכן, הזרק לכל עכבר תורם עם knockout של AQP4 פעם אחת תת-עורית לכל צד של הבטן התחתונה, ולכל צד של דופן החזה מדיאלית לבית השחי.

10 עד 12 ימים לאחר החיסון, בצעו חתך בקו האמצע בעור מהמפשעה ועד לצוואר, ובכל אחת מהרגליים של העכבר הראשון. הרחיקו את העור מהפריטוניאום והדביקו אותו היטב ללוח. לאחר מכן, אספו את קשרי הלימפה המפשעיים והבתיים, והניחו את הרקמות במסננת תאים בתוך צלחת פטרי המכילה מצע גידול מלא.

לאחר איסוף כל קשרי הלימפה, הנח את מסנן התאים על מבחנה קונית של 50-milliliter המכילה מצע מלא טרי על קרח, והשתמש בקצה השטוח של בוכנת מזרק סטרילית של five-milliliter כדי לדחוף את תאי קשרי הלימפה דרך רשת הסינון. שטוף את הרשת עם 20 עד 30 milliliters של מצע מלא כדי להקל על התאוששות התאים, ולאחר מכן בצע שני שטיפות באמצעות סנטריפוגה. לאחר הסנטריפוגה השנייה, השהה מחדש את המשקע במצע תאי T לצורך ספירה.

הוסיפו לתאים את הריכוזים המתאימים של אנטיגן, recombinant mouse interleukin 23 ו-recombinant mouse IL-6, והוסיפו שני מיליליטר של תאים בתוך תערובת מקטבת זו של Th17 לכל באער של פלטה בעלת 12 באערים. לאחר מכן, הניחו את הפלטה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2 למשך 72 שעות. ביום השלישי של הפולריזציה, בצעו טריטורציה (trituration) של התרביות בכל באער מספר פעמים כדי לשחרר את התאים המקוטבים, ורכזו אותם במבחנה קונית של 50 מיליליטר על קרח לצורך ספירה.

לאחר שתי שטיפות ב-PBS, דללו את התאים לריכוז של 1×10⁸ תאים למיליליטר ב-PBS, וערבבו בעדינות את ת сусפנזיית התאים על ידי סיבוב. בתוך שעה מרגע איסופם, העבירו את התאים למזרק של 1 מיליליטר, והחדירו 200 µL של תאים לכל חיה מקבלת באופן תוורידי דרך וריד הזנב. לאחר מכן, והזריקו לכל עכבר באופן תוصفיתי (intraperitoneally), באופן מיידי ושוב לאחר יומיים, 200 ng של B pertussis toxin המדולל ב-200 µL של PBS.

עבור דימות רשתית in vivo של בעלי החיים המקבלים באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית, חמש דקות לפני הדימות, הרחב את האישונים באמצעות טיפה אחת של 1% tropicamide לכל עין, והפעל את משטח החימום. הנח את העכבר על גליל הדימות, והפנה את זרימת ההרדמה בהתאם. הגן על העיניים באמצעות 0.3% hydroxypropyl methylcellulose כדי לשמור עליהן לחות ולהבטיח רציפות של השבירה, והנח עדשת מגע מותאמת אישית על העין שתיבדק.

בהנחיית תמונת קרקית באינפרא-אדום, כוון את הלייזר לעין המכוסה בעדשה תוך הקפדה שהקרן תהיה ממורכזת על ראש העצב האופטי. בצע 25 סריקות B-scan במצב רזולוציה גבוהה, ובצע רסטריזציה לתמונות מ-30 סריקות A-scan ממוצעות. לאחר דימות שתי העיניים, החלף את עדשת המגע בג'ל אופתלמי, והנח את העכבר בכלוב התאוששות חם.

על מנת לנתח את התמונות שהושגו באמצעות תוכנת הדימוי המודולרית לסגמנטציה אוטומטית, תקנו תחילה ידנית את הסגמנטים המתאימים לממברנה המגבילה הפנימית (inner limiting membrane) ולשכבה הפלקסיפורמית הפנימית (inner plexiform layer) כדי לייצג את גבולות השכבות הרטינליות הפנימיות. לאחר מכן, ודאו ששכבת סיבי העצב הרטינליים ושכבת תאי הגנגליון נמצאות בתוך גבולות השכבה הרטינלית הפנימית ואינן חופפות. חיסון תת-עורי עם פפטידים של AQP4 המכילים אפיתופים פתוגניים של תאי T מעורר תגובות פרוליפרטיביות חזקות של תאי T בבלוטות הלימפה המנקזות של עכברי knockout ל-AQP4, בהשוואה לתגובות של תאי T מסוג wild type.

ניתוחים של ציטומטריית זרימה של ביטוי V beta אינדיבידואלי מדגימים שתאי T ספציפיים לפפטידים של AQP4 המכילים אפיתופים של תאי T פתוגניים משתמשים ברפרטוארים ייחודיים של TCR, ומדגימים היפר-פרוליפרציה סלקטיבית המצביעה על כך שתגובות תאי T פתוגניות לדטרמיננטים אלו מווסתות בדרך כלל על ידי סלקציה שלילית תימית. כשישה עד תשעה ימים לאחר הזרקת תאי T מקוטבים, כמעט בכל העכברים המקבלים התפתחו סימנים קליניים של מחלה אוטואימונית של ה-CNS, כולל זנב רפוי ושיתוק של הגפיים האחוריות. תאי T ספציפיים ל-AQP4 מקוטבים ל-Th17 גרמו למחלה קלינית חמורה יותר מאשר תאי T ספציפיים ל-AQP4 מקוטבים ל-Th1.

לדוגמה, עכבר זה פיתח שיתוק מלא של הגפיים האחוריות לאחר מתן תאי T ספציפיים לפפטיד AQP4 שהוכווננו ל-Th17. מחלה קלינית המושרה על ידי תאי Th17 ספציפיים לפפטיד AQP4 קשורה גם לחדירה של תאים חד-גרעיניים אל פה הארץ (parenchyma) של מערכת העצבים המרכזית ואל הקרומים, וכן לדלקת בעצב הראייה, כפי שמעידים נפיחות ועליה בעובי של שכבת הרשתית הפנימית, החוזרים לרמת הבסיס ככל שהעכברים מחלימים מהמחלה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ההשראה והניטור של אוטואימוניות המכוונת ל-AQP4, מה שיאפשר מחקרים נוספים להבנת האופן שבו תאי T משתתפים ב-neuromyelitis optica.