אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

המטרות הכלליות של פרוטוקול זה הן לגרום למערכת העצבים המרכזית או למחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית על ידי העברה מאמצת של תאי T ספציפיים לאקוופורין 4, ולנטר את ההשפעות הנובעות מכך על מערכת העצבים המרכזית ומערכת הראייה הדינמית. שיטה זו תעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתפקידו של אקוופורין 4, הידוע בכינויו AQP4, תאי T ספציפיים בנוירו-מיאליטיס אופטיקה וכן בהפרעות ראייה דלקתיות אחרות. היתרון העיקרי של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית הוא היכולת לבצע ניטור אורך של פגיעה ברשתית בצורה לא פולשנית.

שידגים את ההליך יהיו שרון סייגן, עמיתת מחקר במעבדה שלי וכן אנדראס קרוז הרנס, עמית במעבדת RE Greens. התחל בחיבור תא עצירה ניילון תלת כיווני עם שני חיבורי מנעול Luer זכר למזרק נעילת Luer מזכוכית ללא הבוכנה. העבר את ידית תא העצירה לכיוון המזרק כדי לסגור את תא העצירה ומקם את המזרק כשהקצה הפתוח פונה כלפי מעלה.

לאחר המערבולת, הוסף נפח אחד לאחד של פפטיד, ותמיסת האדג'ובנט של פרוינד השלם למזרק, והכנס מחדש את בוכנת הזכוכית למזרק. החזק את הבוכנה במקומה, הפוך את המזרק כך שתא העצירה פונה כלפי מעלה, והעביר את הידית לחיבור הנשי שאינו בשימוש. לחץ בזהירות על הבוכנה כדי להסיר את עודפי האוויר מהמזרק.

הפתרון ימלא את חיבור נעילת ה-Luer הזכר השני של תא העצירה. לאחר מכן חבר מזרק זכוכית שני כשהבוכנה מוכנסת במלואה לחיבור מנעול Luer הזכר השני. ליצירת תחליב, יש ללחוץ לסירוגין על הבוכנות כדי להעביר את התמיסה בין שני המזרקים למשך כשתי דקות, ולקרר את התמיסה כ-10 דקות עד שיהיה שינוי ניכר בצמיגות התמיסה.

כאשר נוצר תחליב לבן נוקשה מאוד, העבירו את כל התמיסה לאחד המזרקים, והחליפו את המזרק הריק במזרק מנעול לואר חדש בגודל מילימטר אחד. מלאו את המזרק החדש באמולסיה. הסר את המזרק מתא העצירה, והצמד מחט בגודל 25.

כדי לבדוק את עקביות האמולסיה במים, הוציאו טיפה של האמולסיה לתוך צלחת מים קטנה. אם האמולסיה אינה מתפזרת, היא מתאימה להזרקה. לאחר מכן יש להזריק כל עכבר נוקאאוט AQP4 תורם פעם אחת לכל צד של הבטן התחתונה, ולכל צד של דופן החזה המדיאלי לבית השחי.

10 עד 12 ימים לאחר החיסון, בצע חתך בקו האמצע בעור מהמפשעה ועד הצוואר, ובמורד כל רגל של העכבר הראשון. משוך את העור הרחק מהצפק, והדק אותו היטב ללוח. לאחר מכן קצרו את בלוטות הלימפה המפשעתית ובית השחי, והניחו רקמות במסננת תאים בתוך צלחת פטרי המכילה מדיום שלם.

לאחר איסוף כל בלוטות הלימפה, הנח את מסננת התאים על צינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל מדיום שלם טרי על קרח, והשתמש בקצה השטוח של בוכנת מזרק סטרילית של חמישה מיליליטר כדי ללחוץ את תאי בלוטות הלימפה דרך רשת המסנן. שטפו את הרשת עם 20 עד 30 מיליליטר של מדיום שלם כדי להקל על התאוששות התאים ואחריה שתי שטיפות צנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השעו מחדש את הגלולה במדיום תאי T לספירה.

הוסף לתאים את הריכוזים המתאימים של אנטיגן, עכבר אינטרלוקין רקומביננטי 23 ועכבר רקומביננטי IL-6, והוסף שני מיליליטר תאים לבאר בתערובת המקטבת Th17 הזו לכל באר של צלחת של 12 בארות. לאחר מכן הניחו את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 72 שעות. ביום השלישי של הקיטוב, יש לשלש את התרביות בכל באר כמה פעמים כדי לעקור את התאים המקוטבים, ולאגד אותם בצינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח לספירה.

לאחר שתי שטיפות ב-PBS, יש לדלל את התאים לריכוז אחד של 10 עד 8 תאים למיליליטר ב-PBS, ולערבב בעדינות את תרחיף התאים על ידי סיבוב. תוך שעה מאיסוףם, העבירו את התאים למזרק של מיליליטר אחד, והעבירו 200 מיקרוליטר של תאים לכל בעל חיים מקבל דרך וריד הזנב. לאחר מכן יש להזריק לכל עכבר באופן תוך-צפקי באופן מיידי ויומיים לאחר מכן 200 ננוגרם של רעלן שעלת B מדולל ב-200 מיקרוליטר PBS.

להדמיית רשתית in vivo של בעלי החיים הנמענים על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית, חמש דקות לפני ההדמיה, יש להרחיב את האישונים עם טיפה אחת של 1% טרופיקמיד לכל עין, ולהפעיל את שטיחון החום. הנח את העכבר על גליל ההדמיה, וכוון מחדש את זרימת ההרדמה בהתאם. הגנו על העיניים עם 0.3% הידרוקסיפרופיל מתיל צלולוז כדי לשמור על לחותן, וכדי להבטיח המשכיות שבירה, והניחו עדשת מגע מותאמת אישית על העין לבדיקה.

בהנחיית תמונת הפונדוס האינפרא אדום, כוון את הלייזר לעין המכוסה בעדשה תוך הקפדה שהקרן תהיה מרוכזת בראש עצב הראייה. בצע 25 סריקות B במצב רזולוציה גבוהה, והוסף רסטר לתמונות מ-30 סריקות A ממוצעות. לאחר הדמיית שתי העיניים, החלף את עדשת המגע בג'ל עיניים, והנח את העכבר בכלוב התאוששות חם.

כדי לנתח את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת ההדמיה המודולרית לסגמנטציה האוטומטית, תחילה יש לתקן ידנית את המקטעים המתאימים לקרום המגביל הפנימי ולשכבת הפרספקס הפנימית כדי לייצג את גבולות שכבות הרשתית הפנימיות. לאחר מכן ודא ששכבות סיבי העצב ברשתית ותאי הגנגליון שוכנים בגבולות שכבת הרשתית הפנימית, ושהם אינם חופפים. חיסון תת עורי עם פפטידים של AQP4 המכילים אפיטופים של תאי T פתוגניים מעורר תגובות חזקות של תאי T פרוליפרטיביים בבלוטות הלימפה המתנקזות של עכברי נוקאאוט AQP4 בהשוואה לתגובות תאי T מסוג בר.

ניתוחים ציטומטריים של זרימה של ביטוי בטא V בודד מדגימים שתאי T ספציפיים לפפטידים של AQP4 המכילים אפיטופים של תאי T פתוגניים משתמשים ברפרטואר TCR ייחודי, ומדגימים התפשטות יתר סלקטיבית המצביעה על כך שתגובות תאי T פתוגניות לגורמים אלה מווסתות בדרך כלל על ידי ברירה שלילית תימית. כשישה עד תשעה ימים לאחר הזרקת תאי T מקוטבים, כמעט כל העכברים המקבלים פיתחו סימנים קליניים של מחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית, כולל שיתוק זנב רפוי וגפיים אחוריות. עם תאי T ספציפיים ל-AQP4 מקוטבים Th17 הגורמים למחלה קלינית חמורה יותר מאשר תאי T ספציפיים ל-AQP4 מקוטבים Th1.

לדוגמה, עכבר זה פיתח שיתוק מלא של הגפיים האחוריות לאחר מתן תאי T ספציפיים לפפטיד AQP4 מקוטב Th17. מחלה קלינית הנגרמת על ידי תאי Th17 ספציפיים לפפטיד AQP4 קשורה גם לחדירה של תאים חד-גרעיניים לפרנכימה ולקרומי המוח של מערכת העצבים המרכזית, כמו גם לדלקת בעצב הראייה, כפי שמעידה גם נפיחות ועובי מוגבר של שכבת הרשתית הפנימית שחוזרת לנקודת ההתחלה כאשר העכברים מתאוששים מהמחלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום ולנטר אוטואימוניות ממוקדת AQP4, מה שיאפשר מחקר נוסף כדי להבין כיצד תאי T משתתפים בנוירו-מיאליטיס אופטיקה.