כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את פרופילי הקישור של שינויים שונים בהיסטון, תוך שימוש בדגימות עובריות בשפע נמוך על מנת לשפר את ההערות התפקודיות של גנומים של בעלי חוליות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית כגון, מהם המשפרים והגנים העיקריים המגדירים את זהותה של רקמה עוברית מסוימת. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא דורשת כמות מוגבלת של חומר מסוים והיא יכולה לשמש גם לניתוח ספציפי מקומי וגם לניתוח גנומי.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ויסות שעתוק או הטרוגניות תאית עם הרקמות העובריות, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון דגימות פטנט. כדי להשיג את שלב HH19, עוברי תרנגולות לניסוי זה, דוגרים ביצי תרנגולת לבנות פוריות בכיוון אופקי ב-37 מעלות צלזיוס ו-80% לחות למשך שלושה ימים. כדי להתחיל לבודד את עוברי HH19, הפוך אותם לנגישים על ידי חילוץ שלושה מיליליטר אלבומין עם מזרק של 10 מילימטר להורדת הבלסטודרם.

על מנת להסיר ממברנות עובריות מיותרות, השתמש במספריים עדינים כדי ליצור פתח קטן בעין. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת נעילה. בעזרת מחט כפופה מוסיפים 0.5 מיליליטר דיו שחור הודי.

השתמש במספריים כירורגיים עדינים ומלקחיים כדי לחתוך את הממברנה העוברית הנוספת המקיפה את העובר. לאחר מכן, העבירו את העובר בעזרת כף מחוררת לצלחת פטרי בגודל 4.5 סנטימטר המכילה 20 מיליליטר תמיסת PBS. בעבודה על קרח תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש במספריים עדינים ובמלקחיים כדי לנתח ולהשליך את מי השפיר ואת החלקים הנותרים של הממברנה העוברית.

לאחר מכן, חתוך את צינור העצב הרוחבי של עמוד השדרה או מקטע SNT ברמה הברכיאלית של העובר. הרחב את הדיסקציה בזנב לאזור בית החזה כדי לבודד את ה-SNT. לסיום, השתמש במלקחיים כדי להסיר את הרקמות המקיפות את ה- SNT לרוחב ובגחון.

לאחר בידוד SNTs, טבלו כל קטע בצלחת פטרי בגודל 3.5 סנטימטר המכילה טריפסין חם של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התרופפות הרקמות הלא נוירולוגיות סביב ה-SNT נראית תחת מיקרוסקופ סטריאו, העבירו את הדגימות ל-PBS 1x קר. כדי לעצור את הטריפסיניזציה, העבירו את הדגימות לכלי חדש עם DMEM קר המכיל 10% FBS.

השתמש במלקחיים כדי להסיר ידנית את הרקמות המזנכימליות והאקטודרמיסיות הנותרות מה-SNT. העבירו את קטע ה-SNT הנקי הזה לצינור של 1.5 מיליליטר והקפיאו אותו בחנקן נוזלי. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמה על פי פרוטוקול הטקסט.

מוסיפים 13.5 מיקרוליטר של פורמלדהיד 37% ודוגרים בטמפרטורת החדר על מסובב למשך 15 דקות. כדי להרוות את הפורמלדהיד, הוסיפו 25 מיקרוליטר של 2.5 גליצין מולארי לצינור ודגרו בטמפרטורת החדר על מסובב למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הצינור ולאחר מכן, שטפו את הגלולה לפי פרוטוקול הטקסט.

לאחר הצלבה, השעו מחדש את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של מאגר ליזה קר כקרח, מלא על ידי פיפטינג. דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס על משטח נדנדה למשך 10 דקות. לאחר מכן, סוניקציה של הדגימות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר סוניקציה, צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. העבירו את הסופרנטנט או הליזאט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר והשליכו את כדור הפסולת התאית. מדללים את הליזט על פי פרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, שמור כמות קטנה של כל דגימה כבקרת קלט והקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. דגרו את הדגימות הנותרות שיהיו נתונות למשקעי כרומטין או לשבב עם נוגדנים מתאימים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר של כרומטין קשור נוגדנים לחרוזים מגנטיים שנשטפו בעבר.

הפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות. כדי לקשור את הנוגדנים לחרוזים, הנח את הצינורות על מסובב צינור וסובב אנכית בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. כדי לשטוף את החרוזים הקשורים לכרומטין, הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה RIPA קר כקרח לצינור השמור על קרח וערבב על ידי היפוך או החלקה של הצינור.

לאחר הכנסת הצינור למחזיק המגנטי בטמפרטורת החדר, המתן עד שהחרוזים ישקעו בצד. יוצקים את הנוזל הצלול וחוזרים על שטיפה זו שלוש פעמים נוספות. לאחר הוספת מיליליטר אחד של נתרן כלורי TE 50 מילי-מולרי לשפופרת, העבירו את החרוזים הקשורים לכרומטין בתמיסה זו לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מילימטר.

הנח את הצינור לתוך המחזיק המגנטי וכאשר החרוזים התייצבו, שפכו את הנוזל. לאחר מכן, צנטריפוגה את החרוזים ב-900 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש. לאחר שהחרוזים התיישבו במחזיק המגנטי, הסר את כל ה-TE שנותר באמצעות קצה טעינת ג'ל.

עובדים בטמפרטורת החדר, מוסיפים 210 מיקרוליטר של מאגר פליטה לחרוזים ומשעים מחדש על ידי החלקה. דגרו את הצינור בגוש חום שחומם מראש בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, תוך כדי טלטול. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינורות עם החרוזים ב -16, 000 x G בטמפרטורת החדר, למשך דקה אחת.

לאחר שהחרוזים התיישבו במחזיק המגנטי, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי. הפשירו את דגימת בקרת הקלט שהוקפאה בעבר מ-20 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר. הוסף 90 מיקרוליטר של מאגר פליטה לדגימה וערבב על ידי מערבולת קצרה.

כדי להפוך את הקישורים הצולבים, דגרו על השבב ובקרו דגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. עובדים בטמפרטורת החדר, מוסיפים נפח אחד של מאגר TE לכל צינור והופכים לערבוב. כדי לעכל את ה-RNA, הוסף RNAse A לבקרה ושבב דגימות לריכוז סופי של 0.2 מיליגרם למיליליטר והפוך את הצינורות לערבוב.

דגרו את הצינורות בגוש חום שחומם מראש בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. כדי לעכל את החלבון לטיהור ה- DNA שלאחר מכן, הוסף פרוטאז K לריכוז סופי של 0.2 מיליגרם למיליליטר לצינורות והפוך את הצינורות לערבוב. דגרו את הצינורות בגוש חום שחומם מראש בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

חלץ וטהר את ה- DNA בהתאם לחומרים המשלימים. כעת ניתן להשתמש ב-DNA זה להכנת ספריית PCR כמותית וחיפוש שבבים. יעילות סוניקציה חיונית לשבב מוצלח מאושרת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של דגימות בקרת הקלט.

בדוגמה זו, באמצעות צינור עצבי בעמוד השדרה של עוף או קטעי SNT, נעשה שימוש ב-11 מחזורי סוניקציה כדי להשיג גודל שבר אופטימלי שנע בין 200 ל-500 זוגות בסיסים. DNA סדוק נותח על ידי PCR כמותי כדי למדוד את רמות ההעשרה של סימני היסטון מפעילים ומדכאים סביב אזורי המקדם של גנים פעילים ולא פעילים ב-SNT של התרנגולת. זה מראה שאפשר להעריך את האיכות הסדוק על ידי כימות רק כמה צדדים נמוכים מבלי לאבד הרבה DNA לניתוח נוסף.

לאחר שהוכנו ספריות חיפוש שבבים ברצף, מוצג ארבה מייצג עבור H3K27 tri methylation ו-H3K4 tri methylation chip חיפוש נתונים שנוצרו ב-SNT של עוף. פרופילים דומים של חיפוש שבבים נוצרו בהצלחה גם ברקמות עובריות שונות של תרנגולות, כגון בליטות מקסילריות ועוברים בשלב HH3. זה מדגים כי המוצג כאן, ניתן להשתמש בפרוטוקול שבב ליצירת פרופילים אפיגנומיים מכמויות מוגבלות של רקמות עובריות שונות.

על ידי שימוש בפרוטוקול זה ליצירת פרופילי שינוי ההיסטון ברקמה עוברית, חשוב לזכור שהאותות יגיעו מכל סוגי התאים השונים הקיימים ברקמה כזו. בעקבות פרוטוקול זה ושימוש בחומר ביולוגי התחלתי יותר, אמור להיות אפשרי לחקור את פרופילי הקישור של חלבונים אחרים המעורבים בוויסות שעתוק, כגון גורמי שעתוק, קו-אקטיבטורים או יחידות משנה של RNA פולימראז 2. לאחר הקמתם, פרוטוקולים אלה יאפשרו לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית או הגנטיקה הרפואית לשפר את השינוי התפקודי של גנומים של בעלי חוליות ולקבל תובנות חשובות לגבי הבסיס המולקולרי של מיוגנזה, אבולוציה ומחלות אנושיות.