Name: כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: למד פרוטוקול ChIP לדגימות עובריות בנפח נמוך מביצי תרנגולת. שיטה זו מאפשרת מיפוי אפיגנומי גלובלי וחקר שינויים בהיסטונים לקידום הבנת גנומים של חולייתנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים תודה Jan אפל לסיוע טכני מעולה שלו במהלך הקמתה של פרוטוקול זה. לעבודה במעבדה ראדה-איגלסיאס נתמך על-ידי CMMC מגזר מימון, מענקי מחקר DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1, ו טה 1007/3-1), UoC מתקדמים החוקרת קבוצת גרנט, המענק CECAD.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לכל אינטרסים כלכליים מתחרים להיות מגולה.

Epigenomic פרופיל של שינוי היסטון באמצעות שבב-seq יכול לשמש כדי לשפר את הביאור פונקציונלי של הגנום חוליות שונות בהקשרים הסלולר4,5,18. פרופילים אלה epigenomic יכול לשמש, בין היתר, כדי לזהות רכיבים משפר, להגדרת המדינה הרגולציה של מוצרי טיפוח טבעיים (קרי, פעיל, בשלה, או צפוי), וכדי להגדיר תא מרכזי זהות הרגולטורים ביולוגית שונה או הקשרים הפתולוגיים (למשל, תחומים יזם H3K4me3 רחב, סופר-מוצרי טיפוח טבעיים)<sup class="...

שינויים post-translational היסטון מעורבים ישירות תהליכים תלויי-כרומטין שונים, כולל תמלול, שכפול ה-DNA תיקון1,2,3. יתר על כן, שינויים שונים היסטון להראות חיובי (למשל, H3K4me3 ו- H3K27ac) או שלילי (למשל, H3K9me3 ו- H3K27me3) מתאמים עם ביטוי גנים, יכול להיות מוגדר באופן רחב כמו הפעלת או מדכאת היסטון מסמן, בהתאמה2,3. כתוצאה מכך, מפות שינוי היסטון גלובלית, המכונה גם epigenomic מפות, הופיעו כלי אוניברסלי ועוצמתי להוסיף ביאור פונקציונלית הגנום חוליות4,5. לדוגמה, דיסטלי רצפים רגולטוריות כגון משפרי ניתן לזהות המבוסס על הנוכחות של חתימות כרומטין ספציפיים (למשל, פעיל משפרי: H3K4me1 ו- H3K27ac), אשר להבדיל ביניהם לבין יזם proximal אזורים (למשל, היזמים פעיל: H3K4me3)6,7,8. מצד שני, גנים עם פונקציות הרגולציה של זהות תא העיקריים נמצאים בדרך כלל עם כרומטין רחבה תחומים מסומנים H3K4me3 או H3K27me3, בהתאם למצב פעיל או לא פעיל transcriptionally של גנים הבסיסית, בהתאמה9 ,10. באופן דומה, הביטוי של גנים זהות תא מרכזי נראה להיות לעתים קרובות תחת פיקוח מרובים והמרגשים מקובצים באשכולות משפרי (קרי, סופר משפרי), אשר יכול להיות מזוהה תחומים רחבה המסומן H3K27ac11.
כיום, מפות שינוי היסטון נוצרות באמצעות טכנולוגיית שבב-seq, אשר לעומת גישות קודמות כגון צ'יפס-שבב (צ'יפ מצמידים מיקרו-מערכים) מספק רזולוציה גבוהה יותר, חפצים פחות, פחות רעש, כיסוי גדול ואת התחתון עולה12. ובכל זאת, הדור של מפות epigenomic באמצעות טכנולוגיית שבב-seq יש מגבלות הטבועות, הקשורים בעיקר היכולת לבצע בהצלחה שבב הדגימות עניין. פרוטוקולים שבב מסורתי נדרש בדרך כלל מיליוני תאים, אשר מגבלת תחולתה של שיטה זו חוץ גופית בתוך תא קווים או תאים אשר ניתן בקלות מבודד ויוו (למשל, תאי דם). השנים האחרונות, מספר פרוטוקולים שבב ששונה תואם עם מספרי הטלפון הנייד נמוך כבר מתואר13,14,15,16. עם זאת, פרוטוקולים אלה נועדו במיוחד כדי להיות יחד עם הדור הבא רצפי (קרי, צ'יפ-seq), הם בדרך כלל להשתמש אד הוק ספריית הכנה שיטות13,14, 15 , 16.
כאן, אנו המתואר פרוטוקול הצ'יפ שיכול לשמש כדי לחקור שינוי היסטון פרופילים באמצעות מספרי הטלפון הנייד נמוכים בינוניים (5 x 104 - 5 x 105 תאים) או לוקוסים שנבחר (קרי, שבב-qPCR) או באופן גלובלי (קרי, שבב-seq) (איור 1). כאשר משולב שבב-seq לטכנולוגיה, פרוטוקול השבב שלנו יכול לשמש יחד עם שיטות הכנה ספרייה תקנית, ובכך בהרחבה נגיש מעבדות רבות10. פרוטוקול זה שימש לחקור מספר סימני היסטון (למשל, H3K4me3, H3K27me3 ו H3K27ac) ברקמות עוף שונה עובריים (למשל, בעמוד השדרה שפופרת פגמים בתעלה (SNT), frontonasal prominences ו epiblast). עם זאת, אנו צופים כי זה צריך להיות בהרחבה החלים על אורגניזמים אחרים שבו דגימות רלוונטי מבחינה ביולוגית או קלינית יכולה להיות מושגת רק בסכומים נמוכים.

<table><tbody><tr><td><מגיב>חזק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אבקת BSA</td><td>קארל רוט</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>חוצץ מלח פוספט (PBS)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8.0</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>קארל רוט</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>קארל רוט</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G/חרוזים מגנטיים</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% פורמלדהיד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-butyrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>מעכב פרוטאינאז</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb סולם</td><td>תרמופישר</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>תפוז G</td><td>סיגמא אלריך</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>אינוויטרוגן</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA (1x)</td><td>גיבקו</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>אוקטילפנול אתוקסילט (טריטון X 100)</td><td>רוט</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (דולבקו&אקוטי; s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לטעינת ג'ל Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR צלחות</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 באר</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 ומיקרו; L טיפים לסנן</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 ומיקרו; L טיפים לסנן</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 ומיקרו; L טיפים לסנן</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0.5 - 10 & micro; L קצות סינון</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 נוגדן</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac נוגדן</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 נוגדן</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 נוגדן</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>תערובת תיקון קצה</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים פרמגנטיים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>מאגר השעיה</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A-Tailing Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>RNA אינדקס מתאם</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>Stop Ligation</td><td>Buffer Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>PCR פריימר קוקטייל</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>תערובת PCR משופרת</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>סולם DNA גנומי</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>מאגר אלוטיון</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דגימה</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>ערכת</td> <td>כימות ספרייהKapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>ביצים לבנות עוף פוריות</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>מחט (Neoject)</td> <td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>מזרק (Ecoject 10 מ"ל)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</ חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>הרמל</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>מניע פעיל</td><td>EpiShear בדיקה סוניקטור</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>דיאגנוד</td><td>ביורופטור פלוס</td><td></td></tr><tr><td>מסובב</td><td>סטיוארט</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>נפח משתנה (5 &ndash; 1,000 &mu; L) פיפטות</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>טיימר</td><td>Sigma</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מגנטי</td><td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>ספינר שולחן</td><td>הית'רו מיקסר</td><td>נבטים</td><td></td>מדעי</tr><tr><td></td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>בזמן אמת PCR Cycler</td><td>Roche</td><td>Light Cycler; סדרתי Nr.5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Gene Amp PCR מערכת 9700</td><td></td></tr><tr><td>DNA ו-RNA מערכת בקרת איכות</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStation System</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>כפית מחוררת</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

כרומטין פרוטוקול immunoprecipitation (chip) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) היא טכניקה נפוץ עבור מיפוי הלוקליזציה של שינויים היסטוניים post-translationally שונה, גרסאות היסטון, גורמי שעתוק או שינוי כרומטין אנזימים של לוקוס נתון או בקנה מידה הגנום כולו. השילוב של מבחני שבב עם הדור הבא רצפי (קרי, צ'יפ-Seq) היא גישה רב-עוצמה לחשוף באופן גלובלי רשתות בקרה רגולטריות וכדי לשפר את הביאור פונקציונלי של הגנום, במיוחד של רצפי תקינה ללא קידוד. שבב פרוטוקולים מחייבים בדרך כלל כמויות גדולות של חומר הסלולר, ובכך מסלק את הישימות של שיטה זו לחקירת סוגי תאים נדיר או ביופסיות רקמות קטנה. על מנת להפוך וזמינותו שבב תואם כמות חומר ביולוגי אשר בדרך כלל ניתן להשיג ויוו במהלך המוקדמות מופרה חוליות, נתאר כאן פרוטוקול שבב פשוטה שבה מספר השלבים הדרושים להשלמת assay הצטמצם כדי למזער את אובדן הדגימה. פרוטוקול שבב זה שימש בהצלחה לחקור שינוי היסטון שונים שונים עוף עובריים ורקמות העכבר למבוגרים באמצעות נמוך עד בינוני תא מספרים (5 x 104 - 5 x 105 תאים). חשוב, פרוטוקול זה תואם טכנולוגיית שבב-seq בשיטות הכנה ספרייה תקנית, ובכך לספק epigenomic גלובל מפות ברקמות עובריים מאוד רלוונטי.

כדי להמחיש את הביצועים של פרוטוקול השבב שלנו, ביצענו ניסויים באמצעות סעיפים SNT במאגר מעוברים עוף HH19, prominences בלסת העליונה של HH22 עוף העוברים ולאחר שלב-HH3 עוברי עוף לחקור את הפרופילים איגוד של שבב-seq למגוון היסטון שינויים (קרי, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 ו- H3K27me3). ברגע DNAs שבב התקבלו, היעילות sonication הוערך על ידי agarose בג'ל של קלט התואם DNAs (איור 3). לאחר מכן, השבב DNAs קלט שימשו לניתוח שבב-qPCR כדי למדוד את enrichments ב לוקוסים צ...

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את פרופילי הקישור של שינויים שונים בהיסטון, תוך שימוש בדגימות עובריות בשפע נמוך על מנת לשפר את ההערות התפקודיות של גנומים של בעלי חוליות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית כגון, מהם המשפרים והגנים העיקריים המגדירים את זהותה של רקמה עוברית מסוימת. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא דורשת כמות מוגבלת של חומר מסוים והיא יכולה לשמש גם לניתוח ספציפי מקומי וגם לניתוח גנומי.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ויסות שעתוק או הטרוגניות תאית עם הרקמות העובריות, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון דגימות פטנט. כדי להשיג את שלב HH19, עוברי תרנגולות לניסוי זה, דוגרים ביצי תרנגולת לבנות פוריות בכיוון אופקי ב-37 מעלות צלזיוס ו-80% לחות למשך שלושה ימים. כדי להתחיל לבודד את עוברי HH19, הפוך אותם לנגישים על ידי חילוץ שלושה מיליליטר אלבומין עם מזרק של 10 מילימטר להורדת הבלסטודרם.על מנת להסיר ממברנות עובריות מיותרות, השתמש במספריים עדינים כדי ליצור פתח קטן בעין. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת נעילה. בעזרת מחט כפופה מוסיפים 0.5 מיליליטר דיו שחור הודי.השתמש במספריים כירורגיים עדינים ומלקחיים כדי לחתוך את הממברנה העוברית הנוספת המקיפה את העובר. לאחר מכן, העבירו את העובר בעזרת כף מחוררת לצלחת פטרי בגודל 4.5 סנטימטר המכילה 20 מיליליטר תמיסת PBS. בעבודה על קרח תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש במספריים עדינים ובמלקחיים כדי לנתח ולהשליך את מי השפיר ואת החלקים הנותרים של הממברנה העוברית.לאחר מכן, חתוך את צינור העצב הרוחבי של עמוד השדרה או מקטע SNT ברמה הברכיאלית של העובר. הרחב את הדיסקציה בזנב לאזור בית החזה כדי לבודד את ה-SNT. לסיום, השתמש במלקחיים כדי להסיר את הרקמות המקיפות את ה- SNT לרוחב ובגחון.לאחר בידוד SNTs, טבלו כל קטע בצלחת פטרי בגודל 3.5 סנטימטר המכילה טריפסין חם של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התרופפות הרקמות הלא נוירולוגיות סביב ה-SNT נראית תחת מיקרוסקופ סטריאו, העבירו את הדגימות ל-PBS 1x קר. כדי לעצור את הטריפסיניזציה, העבירו את הדגימות לכלי חדש עם DMEM קר המכיל 10% FBS.השתמש במלקחיים כדי להסיר ידנית את הרקמות המזנכימליות והאקטודרמיסיות הנותרות מה-SNT. העבירו את קטע ה-SNT הנקי הזה לצינור של 1.5 מיליליטר והקפיאו אותו בחנקן נוזלי. לאחר מכן, הומוגניזציה של הרקמה על פי פרוטוקול הטקסט.מוסיפים 13.5 מיקרוליטר של פורמלדהיד 37% ודוגרים בטמפרטורת החדר על מסובב למשך 15 דקות. כדי להרוות את הפורמלדהיד, הוסיפו 25 מיקרוליטר של 2.5 גליצין מולארי לצינור ודגרו בטמפרטורת החדר על מסובב למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הצינור ולאחר מכן, שטפו את הגלולה לפי פרוטוקול הטקסט.לאחר הצלבה, השעו מחדש את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של מאגר ליזה קר כקרח, מלא על ידי פיפטינג. דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס על משטח נדנדה למשך 10 דקות. לאחר מכן, סוניקציה של הדגימות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר סוניקציה, צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. העבירו את הסופרנטנט או הליזאט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר והשליכו את כדור הפסולת התאית. מדללים את הליזט על פי פרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, שמור כמות קטנה של כל דגימה כבקרת קלט והקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. דגרו את הדגימות הנותרות שיהיו נתונות למשקעי כרומטין או לשבב עם נוגדנים מתאימים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר של כרומטין קשור נוגדנים לחרוזים מגנטיים שנשטפו בעבר.הפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות. כדי לקשור את הנוגדנים לחרוזים, הנח את הצינורות על מסובב צינור וסובב אנכית בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. כדי לשטוף את החרוזים הקשורים לכרומטין, הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה RIPA קר כקרח לצינור השמור על קרח וערבב על ידי היפוך או החלקה של הצינור.לאחר הכנסת הצינור למחזיק המגנטי בטמפרטורת החדר, המתן עד שהחרוזים ישקעו בצד. יוצקים את הנוזל הצלול וחוזרים על שטיפה זו שלוש פעמים נוספות. לאחר הוספת מיליליטר אחד של נתרן כלורי TE 50 מילי-מולרי לשפופרת, העבירו את החרוזים הקשורים לכרומטין בתמיסה זו לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מילימטר.הנח את הצינור לתוך המחזיק המגנטי וכאשר החרוזים התייצבו, שפכו את הנוזל. לאחר מכן, צנטריפוגה את החרוזים ב-900 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש. לאחר שהחרוזים התיישבו במחזיק המגנטי, הסר את כל ה-TE שנותר באמצעות קצה טעינת ג'ל.עובדים בטמפרטורת החדר, מוסיפים 210 מיקרוליטר של מאגר פליטה לחרוזים ומשעים מחדש על ידי החלקה. דגרו את הצינור בגוש חום שחומם מראש בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, תוך כדי טלטול. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינורות עם החרוזים ב -16, 000 x G בטמפרטורת החדר, למשך דקה אחת.לאחר שהחרוזים התיישבו במחזיק המגנטי, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי. הפשירו את דגימת בקרת הקלט שהוקפאה בעבר מ-20 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר. הוסף 90 מיקרוליטר של מאגר פליטה לדגימה וערבב על ידי מערבולת קצרה.כדי להפוך את הקישורים הצולבים, דגרו על השבב ובקרו דגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. עובדים בטמפרטורת החדר, מוסיפים נפח אחד של מאגר TE לכל צינור והופכים לערבוב. כדי לעכל את ה-RNA, הוסף RNAse A לבקרה ושבב דגימות לריכוז סופי של 0.2 מיליגרם למיליליטר והפוך את הצינורות לערבוב.דגרו את הצינורות בגוש חום שחומם מראש בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. כדי לעכל את החלבון לטיהור ה- DNA שלאחר מכן, הוסף פרוטאז K לריכוז סופי של 0.2 מיליגרם למיליליטר לצינורות והפוך את הצינורות לערבוב. דגרו את הצינורות בגוש חום שחומם מראש בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.חלץ וטהר את ה- DNA בהתאם לחומרים המשלימים. כעת ניתן להשתמש ב-DNA זה להכנת ספריית PCR כמותית וחיפוש שבבים. יעילות סוניקציה חיונית לשבב מוצלח מאושרת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של דגימות בקרת הקלט.בדוגמה זו, באמצעות צינור עצבי בעמוד השדרה של עוף או קטעי SNT, נעשה שימוש ב-11 מחזורי סוניקציה כדי להשיג גודל שבר אופטימלי שנע בין 200 ל-500 זוגות בסיסים. DNA סדוק נותח על ידי PCR כמותי כדי למדוד את רמות ההעשרה של סימני היסטון מפעילים ומדכאים סביב אזורי המקדם של גנים פעילים ולא פעילים ב-SNT של התרנגולת. זה מראה שאפשר להעריך את האיכות הסדוק על ידי כימות רק כמה צדדים נמוכים מבלי לאבד הרבה DNA לניתוח נוסף.לאחר שהוכנו ספריות חיפוש שבבים ברצף, מוצג ארבה מייצג עבור H3K27 tri methylation ו-H3K4 tri methylation chip חיפוש נתונים שנוצרו ב-SNT של עוף. פרופילים דומים של חיפוש שבבים נוצרו בהצלחה גם ברקמות עובריות שונות של תרנגולות, כגון בליטות מקסילריות ועוברים בשלב HH3. זה מדגים כי המוצג כאן, ניתן להשתמש בפרוטוקול שבב ליצירת פרופילים אפיגנומיים מכמויות מוגבלות של רקמות עובריות שונות.על ידי שימוש בפרוטוקול זה ליצירת פרופילי שינוי ההיסטון ברקמה עוברית, חשוב לזכור שהאותות יגיעו מכל סוגי התאים השונים הקיימים ברקמה כזו. בעקבות פרוטוקול זה ושימוש בחומר ביולוגי התחלתי יותר, אמור להיות אפשרי לחקור את פרופילי הקישור של חלבונים אחרים המעורבים בוויסות שעתוק, כגון גורמי שעתוק, קו-אקטיבטורים או יחידות משנה של RNA פולימראז 2. לאחר הקמתם, פרוטוקולים אלה יאפשרו לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית או הגנטיקה הרפואית לשפר את השינוי התפקודי של גנומים של בעלי חוליות ולקבל תובנות חשובות לגבי הבסיס המולקולרי של מיוגנזה, אבולוציה ומחלות אנושיות.

chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol-for-low-abundance

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

תקנת כוונון עדינה של שעתוק גנים בבסיס החלטת גורל תא עוברי. בזאת, אנו מתארים מבחני immunoprecipitation הכרומטין לשמש כדי לחקור תקנה אפיגנטיים של שני בידול הלב של תאי גזע ופיתוח הלב של עוברי עכברים.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע שבב-Seq ומפות CARIP-Seq, כולל ספריית לקראת הדור הבא רצפי, ליצירת epigenomic הכללית ו- RNA הקשורים כרומטין תאים ES.

CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

מאמר זה מתאר פרוטוקול ChIP-Seq בעל קנה מידה זעיר של אזורי DNA הקשורים לשינוי histone ספציפי (H3K27ac) באמצעות פלטפורמת מטפל בנוזל ChIP, ואחריו הכנת ספריה באמצעות tagmentation. ההליך כולל הערכת בקרה למטרות איכות וכמות וניתן לאמץ אותו לשינויי histone אחרים או גורמי תמלול.

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

למד פרוטוקול ChIP לדגימות עובריות בנפח נמוך מביצי תרנגולת. שיטה זו מאפשרת מיפוי אפיגנומי גלובלי וחקר שינויים בהיסטונים לקידום הבנת גנומים של חולייתנים.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

גלה סרטונים נוספים