Name: Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנא המכיל 2 הו שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: למד סינתזה של אוליגומרי RNA בשלב מוצק, טיהור ואפיון באמצעות דיכרואיזם מעגלי ו-UV-vis. פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לחוקרים בכימיה של חומצות גרעין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הכנת כתב היד הזה נתמכה באמצעות קרנות הזנק מאוניברסיטת קולורדו דנבר (JMRE). AF רוצה להכיר בתמיכה מענק מחקר ופעילויות יצירתיות (RaCAS, CU Denver). מימון של משרד שירותי מחקר, אוניברסיטת קולורדו דנבר כדי לכסות את הוצאות הפרסום הוא הודה. ברצוננו להודות לחברת המעבדה גב &#39;קסנדרה הרברט ומר יאניק ק&#39; דז&#39;ו על תרומתם בחלק הווידאו.

<ol><li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229210603_The_synthesis_of_oligodeoxyprimidines_on_a_polymer_support">The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support.</a> Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).</li>
<li>Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040403901904617">Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides.</a> Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+Chemistry+and+its+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses.</a> Science. 230 (4723), 281-285 (1985).</li>
<li>Nguyen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+Thermal+Stability%2C+Biophysical+Properties%2C+and+Molecular+Modeling+of+Oligonucleotides+of+RNA+Containing+2%27-O-2-Thiophenylmethyl+Groups%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups.</a> J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).</li>
<li>El-Sagheer, A. H., Brown, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Click chemistry with DNA.</a> Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).</li>
<li>Puffer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoro+pyrimidines%3A+labels+to+probe+DNA+and+RNA+secondary+structures+by+1D+19F+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).</li>
<li>Wan, W. B., Seth, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medicinal+chemistry+of+therapeutic+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides.</a> J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).</li>
<li>Zhou, C., Greenberg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage+by+histone+radicals+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles.</a> J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-Induced+proton-coupled+electron+transfer+in+cyclic+DNA+miniduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes.</a> J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).</li>
<li>Anosova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+diversity+of+artificial+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The structural diversity of artificial genetic polymers.</a> Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).</li>
<li>Riml, C., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+5-Hydroxymethylcytidine-+and+5-Hydroxymethyl-uridine-Modified+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Synthesis%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA.</a> Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).</li>
<li>Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+Two+Strategies+for+Mixed-Sequence+Recognition+of+Double-Stranded+DNA%3A+Pseudocomplementary+Invader+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes.</a> J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).</li>
<li>Beaucage, S. L., Iyer, R. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040402001879588">Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach.</a> Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).</li>
<li>Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+N-%28deoxyguanosin-8-yl%29-2-acetylaminofluorene+%28dG-AAF%29+into+oligonucleotides+using+modified+%27ultra-mild%27+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis.</a> Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+a+very+long+oligoribonucleotide+with+2-cyanoethoxymethyl+%28CEM%29+as+the+2%27-O.-protecting+group%3A+structural+identification+and+biological+activity+of+a+synthetic+110mer+precursor-microRNA+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate.</a> Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).</li>
<li>Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties%2C+thermal+stability+and+functional+impact+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+on+oligonucleotides+of+RNA+-+a+study+of+duplex%2C+hairpins+and+the+aptamer+for+preQ1+as+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models.</a> Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).</li>
<li>Ranjbar, B., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+dichroism+techniques%3A+Biomolecular+and+nanostructural+analyses+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review.</a> Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).</li>
<li>Mergny, J. -L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thermal+melting+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Oligonucleotides%22%5BJournal%5D)">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraplex+formation+of+a+guanine-containing+nonameric+DNA+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment.</a> Science. 250 (4980), 543-546 (1990).</li>
<li>Virgilio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethyl-2%27-deoxyuridine+residues+in+the+thrombin+binding+aptamer%3A+Investigating+anticoagulant+activity+by+making+a+tiny+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22CHEMBIOCHEM%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification.</a> CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).</li>
<li>Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+and+thermal+stability+of+oligonucleotides+of+RNA+containing+7%2C8-dihydro-8-hydroxyadenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine.</a> Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).</li>
<li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNAFold%3A+software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).</li>
<li>Breslow, R., Huang, D. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+ions+including+Mg2%2B+and+lanthanides+on+the+cleavage+of+ribonucleotides+and+RNA+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).</li>
<li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li>
<li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://blogsdelagente.com/cefimijegyte/rna-methodologies-fourth-edition-laboratory-guide-for-isolation-and-characterization-ebook-download/">RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization</a>. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הכוונה של כתב היד הזה היא לשמש מדריך לחוקרים בתחום, מתחילים או מומחה, כדי להשיג בהצלחה או לשפר את הסינתזה של oligonucleotides של DNA או RNA. המתודולוגיה המתוארת מתמקדת בשימוש סינתזה שלב מוצק באמצעות סינתיסייזר DNA / RNA אוטומטי באמצעות כימיה phosphoramidite סטנדרטי. הדו&quot;ח מתאר תיאור שלב אחר שלב של סינתזה, טיהור, אפיון של DODecamers RNA. בנוסף, השימוש בתקליטור משמש לזהות מוטיבים מבניים משניים ומעברים denaturation תרמית. <p class="jove_content" style=";text-align:right;dire...

סינתזה שלב מוצק כדי להשיג oligonucleotides של DNA / RNA הוא כלי רב עוצמה אשר שימש מספר יישומים בתחומים שונים מאז 1970s 1 , 2 , 3 באמצעות אבני הבניין phosphoramidite 4 . דוגמאות להשפעה הרחבה שלה כוללות: השפעתה על תיוג ( באמצעות תגובת כימיה בלחץ) 5 , בדיקה מבנית 6 , וטכנולוגיות אנטיסנס 7 , כמו גם הבהרה של מנגנונים ביולוגיים 8 , 9 , מקור כחומר גנטי 10 , שונה טבעי ו / או שינויים כימיים 11 , 12 , בין רבים אחרים.השינוי שאנו משתמשים כאן מייצג את הצעד הראשון במאמצינו להשיג oligonucleotides RNA המכיליםבדיקות פוטואקטיביות כדי לאפשר שליטה זמנית של המבנה והפונקציה של biopolymer חשוב זה. סינתזה של Dodecamers RNA עם רצפים: 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [AUG AUU CCG UAG] -3&#39; (עמדות קו תחתון מייצגות שילוב של שינוי C2&#39;- O -thiophenylmethyl ) מהווה את המוקד של מחקר זה. רצפים נבחרו כדי לאפשר כימות ומדידה של גדילי רנ&quot;א כמו גדילי יחיד, או כמו מבנים דופלקס המקביל שלהם (שום מבנים משניים אחרים לא חזו יציבות יציבה תרמודינמית). CD שימש כדי לקבוע את הפרמטרים המבניים, כלומר , היווצרות דופלקס ומעברים denaturation תרמית. סִינתֶזָה ההליך הכולל להשגת אלה oligonucleotides מודגם באיור 1 ו עוקב את התהליך בשלבים: אוטומטי שלב מוצק סינתיזה → DeprOtection → טיהור → כימות → אפיון. איור 2 מציג את היחידות המונומריות הנחוצות בהליך זה. הסינתזה מוצק השלב של RNA היא דומה לזה של ה- DNA בכך שהיא מבוססת על כימית phosphoramidite (איור 2, משמאל) את השימוש בקבוצות הגנה-רָפִיף בסיס האמין exocyclic nucleophilic על G, A ו- C, למשל, אצטיל, בנזואיל, phenoxyacetyl, t- בוטיל או N , N- dimethylformamide ( איור 2 , מימין). היבט נוסף שיש להביא בחשבון ב RNA, בשל נוכחות של C2&#39;-OH הקבוצה (חסר bioxymers deoxyoligucleototide), הוא צעד נוסף שיש לשלב את ההגנה, ולאחר מכן deprotection, של עמדה זו נוקלאופילי. מבחינה זו, קבוצות הגנה מבוססות סיליקון הפכו לאסטרטגיה אטרקטיבית בשל הפוטנציאל שלהם כמו moieties biorthogonal (ספציפייםy deprotected בנוכחות פלואוריד), עם -butyldimethylsilyl טרט (TBDMS) ו triisopropylsilyloxymethyl (טום) קבוצות כמו האפשרויות הפופולריות (איור 2, ימין למטה). בעבודה זו, הסינתזה האוטומטית בוצעה על סינתיסייזר DNA / RNA המשתמש בכימיה phosphoramidite סטנדרטי. הגדרות היצרן על המכשיר כוללות צעד דילול אוטומטי בעת שימוש בגרסאות מסחריות של phosphoramidites עבור DNA, או את האפשרות לדלל בכרכים שנקבעו על ידי המשתמש. עם זאת, החלטנו לשקול את phosphoramidite רנ&quot;א לדלל באופן ידני בהתחשב בכך: 1) המחיר של phosphoramidites הקנונית של רנ&quot;א גבוה (עד פי 50 פעמים יקר יותר במקרים מסוימים); 2) phosphoramidites שונה מתקבלים לעתים קרובות בכמויות קטנות; ) 3 כמות החומר המבוזבז בעת שימוש בצעד דילול אוטומטי (שנקבע על ידי היצרן) הוא גדול. בנוסף, השתמשנו: 1) תומך מוצק זמין מסחרית( למשל , CPG) המכיל נוקלאובאז מוגן לתפקד כמו 3-end; ו 2) phosphoramidites מסחריים (nucleobases הקנונית) מוגן עם קבוצת TBDMS ב C2&#39;- O -position. רשימה מפורטת של השלבים סינתזה מסופק באיור 3 ו 1 טבלה , יחד עם תיאור נוסף והערות על צעדים שהותאמו לסינתזה RNA. יתר על כן, איור 4 ממחיש את התשואות בשלבים שנצפו עבור כל צעד לאחר בחירת האפשרות &#39;Trityl צג&#39;, אשר quantitates קטיון trityl שוחרר מכל צעד detritylation. ראוי לציין כי בדרך כלל, מניסיוננו, הגורם המגביל היה קבלת phosphoramidite המכיל את השינוי הרצוי. כלומר, פיתוח מתודולוגיה סינתטית המאפשרת שילוב של שינויים באתרים נבחרים. בדוח זה, אנו מתמקדיםשילוב של נוקליאוטיד שונה שעבורו הקמנו את המתודולוגיה הסינתטית המתאימה, קבוצת C2&#39;- O -thiophenylmethyl. קבוצה זו קטנה בגודלה ואינה משפיעה על סינתזת הפאזה המוצקה בכל צורה שהיא. מאז שילוב של קבוצה זו לתוך oligonucleotides של RNA כבר דיווחו, יחד עם פרמטרים מבניים תרמודינמיים 4 , שום היבטים של סינתזה אורגנית המובילה phosphoramidites שונה יתואר כאן. הגנה, טיהור ואפיון Deprotection של אמינים exocyclic וקבוצות cyanoethyl- K מתרחשת באותו צעד כמו זה של המחשוף שרף CPG. אנו להחיל את התנאים הנפוצים של חימום שרף שהתקבל בנוכחות פתרון מימי של AMA, ואחריו מחשוף של קבוצות C2&#39;- O- silyl בנוכחות יוני פלואוריד, ולאחר מכן טיהור באמצעות ג&#39;לאלקטרופורזה. בעוד אלה הפכו תנאים סטנדרטיים במקרים רבים, שינויים כי הם labile לתנאים בסיסיים או יונים פלואוריד עשוי לדרוש תנאים מתונים 13 , 14 , למשל , מתנול / אשלגן פחמתי (MeOH / K 2 CO 3 ), או בוטילאמין. לפיכך, קבוצה אחרת של הגנה על קבוצות על phosphoramidites המקביל הוא הכרחי. יתר על כן, בחרנו אלקטרופורזה כחלופה מועדפת כדי לטהר את oligomers deprotected בהתחשב הניסיון הקודם שלנו עם שיטה זו וחוסר מכשור אחרים. עם זאת, HPLC יכול לחילופין לשמש שיטה יעילה 15 . אפיון של oligonucleotides מטוהרים בוצע באמצעות ספקטרומטריית מסה, מטריצה ​​בסיוע לייזר desorption / יינון זמן הטיסה (MALDI-TOF), באמצעות הליך דיווח על ידי הקבוצה שלנו 16 . אפיון מבני<html> יציבות מלוא של דופלקסים שהתקבלו בוצעו באמצעות תקליטור. באופן ספציפי, אנו עושים שימוש בתקליטור כדי לקבוע את מעברי denaturation תרמית של oligonucleotides שונה ושונה של RNA על ידי ביצוע הירידה אליפטיות של הלהקה ב CA. 270 ננומטר, כמו גם היעלמות של הלהקה (עם אליפטיות שלילית) עם מקסימום λ ב 210 ננומטר. השוואת ספקטרה לפני ואחרי הכלאה מסופק כדי להמחיש את ההבדלים שלהם ולספק אימות של המתודולוגיה המועסקים. השימוש בתקליטור מקובל באופן נרחב בקביעת מוטיבים מבניים בחומצות גרעין ובאמינואידים 17 , ולכן ניתן להשתמש בהם ככלי לקביעת פרמטרים מבניים ותרמודינמיים שונים 18 ; עם זאת, אין דוגמאות רבות שבו הטכניקה משמשת כדי להעריך מעברים denaturation תרמית. מקרים מסוימים כוללים קביעת יציבות תרמית על דנ&quot;א המכיל G-quadruplexesהתחת = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 או בדופלקסים וסיכות של רנ&quot;א 21 . דוח זה מתכוון לספק את הקורא שאינו מומחה או הצופה עם סט של כלים המאפשרים התחלה חלקה של סוג זה של מחקר. זה ישמש כדי לשפר ולהשוות עם מתודולוגיות וטכניקות במעבדות מחקר אחרים המעורבים בענף זה מרגש של המדע. התוכן בדו&quot;ח זה מוסיף לפרוטוקולים הקיימים של טכנולוגיה זו ממקורות שונים, ומעשיר ומקדם את החוויה בסיוע חזותי לכל צעד.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל 99.9%, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל 99.9%, נטול מים לריצוף DNA</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד, 99+%</td> <td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ציטראט, דו-בסיסי 98%</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פלואוריד&nbsp; 98.0%, ACS דרגה</td><td>אלפא Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד 28 - 30% במים, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>ארגון-טוהר גבוה במיוחד</td><td>&nbsp; איירגז</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>ביס-אקרילאמיד טהור במיוחד</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט, 97%</td> <td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, נטול מים, בדרגה היסטולוגית</td><td>פישר כימיקל</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמין טטראצטית, מלח דיסודיום לייבש 100.2%</td> <td>פישר כימיקל</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית, 36.5 - 38.0%, מאושר ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט, 99%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>מתנול, 99.9%,&nbsp; HPLC כיתה</td><td>פישר כימיקל</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>מתילאמין 40% במים</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-מתיל-2-פירולידינון, ומי, 99.5%</td> <td>אולדריץ'</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>אופטי-TOFTM 96 באר הכנסה (123 x 81 מ"מ)&nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>מוצרים ביולוגיים מולקולריים</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט, נטול מים 99.2%, מאושר ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי, 100.5%, מאושר ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי דיהידרט 99.0%</td> <td>סיגמא</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2',4' טריאתילאמין, 99+%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine trihydrofluoride, 98%</td> <td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית, 99%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6'-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים לסינתזה של RNA: תערובת </חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>משחררת חסימות, 3% חומצה טריכלורואצטית בדיכלורומתאן</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>תערובת כמוסות A, THF/פירידין/אנהידריד אצטי</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>תערובת כמוסות B, 10% 1-מתילימידזול ב-THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>מפעיל, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole באצטוניטריל נטול מים</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חמצון, 0.02 מ' יוד ב-THF/פירידין/מחקר גלן מים</td><td></td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>מחקר גלן</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE פוספורמידיט&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE פוספורמידיט</td><td>גלן ריסרץ</td>' <td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE פוספורמידיט</td><td>גלן מחקר</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE פוספורמידיט&nbsp;</td><td>גלן ריסרץ</td>' <td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ&quot;א המכיל 2 &#39;<em&gt; הו</em&gt; שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

סינתזה של שלב מוצק שימשה להשגת פולימרים קנוניים ומשתנים של חומצות גרעין, במיוחד של DNA או RNA, שהפכו אותה למתודולוגיה עממית ליישומים בתחומים שונים ולמטרות מחקר שונות. הנוהל המתואר כאן מתמקד בסינתזה, טיהור, אפיון של dodecamers של RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; המכיל אפס, אחד, או שני שינויים הממוקם ב C2&#39;- O -position. בדיקות מבוססים על קבוצות 2-thiophenylmethyl, משולבים לתוך נוקליאוטידים RNA באמצעות סינתזה אורגנית סטנדרטית הציג לתוך oligonucleotides המקביל באמצעות phosphoramidites שלהם בהתאמה. דו&quot;ח זה עושה שימוש כימית phosphoramidite באמצעות הארבעה nucleobases הקנונית (uridine (U), ציטוזין (C), guanosine (G), אדנוזין (א)), כמו גם 2-thiophenylmethyl נוקלאוטידים פונקציונליים השונים על 2&#39;- O - עמדה; עם זאת, המתודולוגיה היא מקובלת עבור var גדולשינויי ההתפתחות שהתפתחו במשך השנים. את oligonucleotides היו מסונתז על זכוכית מבוקר הנקבוביות (CPG) תמיכה ואחריו מחשוף של שרף deprotection בתנאים סטנדרטיים, כלומר , תערובת של אמוניה מתילאמין (AMA) ואחריו מימן פלואוריד / טריאתילאמין / N-methylpyrrolidinone. Oligonucleotides המקביל היו מטוהרים באמצעות electroporesis polyacrylamide (20% denaturing) ואחריו elution, desalting, ובידוד באמצעות כרומטוגרפיה הפוכה שלב (ספטמבר, פאק, C 18 -Cumnumn). כימות ופרמטרים מבניים הוערכו באמצעות ניתוח אולטרה-סגול גלוי (UV-V) ו- Dycroism (CD), בהתאמה. דו&quot;ח זה נועד לשמש משאב ומדריך לחוקרים מתחילים ומבקשים המעוניינים לצאת לתחום זה. הוא צפוי לשמש עבודה ב-התקדמות כמו טכנולוגיות מתודולוגיות חדשות מפותחות. תיאור המתודולוגיות והטכניקות שבתוךשל מסמך המתאים DNA / RNA סינתיסייזר (שופץ ונרכש בשנת 2013) המשתמשת כימיה phosphoramidite.

הסינתזה של DNAecamers RNA המכיל אפס, אחד, או שני 2-thiophenylmethyl שינויים ב C2&#39;- O- אופוזיציה מתואר יחד עם טיהור המקביל שלו אפיון. כמו כן, נכלל תיאור מפורט של הניתוח המבני שבוצע באמצעות התקליטור. ארבעת גדילי RNA (כולל גדיל עם רצף משלימים) התקבלו באמצעות סינתזת שלב מוצק, אשר בעקבותיו תשואה טיהור בין 300 - 700 nmol של כל oligonucleotid...

מאמר זה מספק הליך מפורט על סינתזה שלב מוצק, טיהור, אפיון של dodecamers של רנ&quot;א שונה ב C2&#39;- O -position. UV- מול וניתוח מעגלי דיכרואי פוטומטרי משמשים לכמת ולאפיין היבטים מבניים, כלומר , גדילים בודדים או פעמיים גדילים.

Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ&quot;א המכיל 2 &#39;<em&gt; הו</em&gt; שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

המטרה הכללית של דו"ח זה היא להדגים את הפרוצדורה להשגת אוליגונוקלאוטידים של RNA באמצעות סינתזה על פאזה מוצקה. דודקמרים של RNA יסונתזו כמודלים, וכן יודגמו תהליכי הטיהור והאפיון שלהם. באמצעות הרכיב הוויזואלי שלו, פרסום זה ירחיב את היקף המתודולוגיות והאמצעים העומדים לרשות חוקרים בתחומים שונים.אספקת עזר חזותי, יחד עם פרוטוקול קצר, תאפשר לחוקרים להשתמש בטכניקות אלו. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא היכולת להתאימה למגוון רחב של שינויים. ככל שהיישומים הנוכחיים הופכים תובעניים יותר, חשוב שיהיה פרוטוקול סטנדרטי.כימיית הפוספוראמידיט חווה התחדשות בשל חסון השיטה והפוטנציאל שלה להשגת oligonucleotides ליישומים טיפוליים. בעוד שרכישת oligonucleotides היא אטרקטיבית, המחיר והזמינות של שינויים (modifications) מסיטים את העניין לעבר הכנת האוליגומרים הללו במעבדה, ובכך הופכים פרוצדורה זו לחשובה ביותר. כדי להתחיל בפרוצדורה, שקלו כל פוספוראמידיט לתוך בקבוק עגור של 10 מיליליטר שיובש בתנור, וסגרו כל בקבוק עם ספטום (septum) שנקב מראש עם מחט בכילוי 20-gauge.הנח את הבקבוקים מיד תחת ואקום באמצעות דסיקטור המכיל חומר מייבש. לאחר מילוי הדסיקטור בארגון יבש, הוצא כל בקבוק והוסף מיד אצטוניטריל אנहाइडרמסי לפני החיבור למסנתי פפטידים במוצק (solid-phased peptide synthesizer). לאחר מכן, הסר את הספטה מכל בקבוק, והנח אותם על המסנתי באמצעות פונקציית החלפת הבקבוקים.כדי להגדיר את הסינתזה במוצק (solid-phase synthesis), יש לבחור באייקון התוכנה. בחרו את שם הסינתיסייזר ולחצו על OK. לאחר מכן, צרו סינתזה חדשה על ידי בחירה ב-File ולאחר מכן ב-New Synthesis Order. לאחר מכן, השתמשו בחלון ההנחיות כדי להזין את תאריך ההרצה, את שם הלקוח ואת מזהה ההרצה (run ID). בחרו את המכשיר, את שם הרצף ואת הרצף.בלשונית Cycle, הקצה את השיטה שנוצרה קודם לכן. לאחר מכן, בחר באפשרות End Procedure manual, המותירה את האוליגונוקלאוטיד קשור לשרף ה-CPG. בחר ב-DMT Off.שמרו את הקובץ על ידי בחירה ב-File ולאחר מכן ב-Save As. לאחר מכן, תנו שם לניסוי ולחצו על Save. בשלב הבא, שלחו את הקובץ כדי להתחיל בסינתזה על ידי בחירה ב-Order וב-Send Order to Synthesizer. בחלון ההודעה, בחרו מיקום עמודה ולחצו על OK. בחלון ה-Synthesizer, בחרו ב-Trityl Monitor.לחצו על Choose Function, ובחרו ב-Trityl Monitor עבור כל שלב על ידי הקלדת 1. התחילו את הסינתזה על ידי בחירה ב-Synthesizer וב-Prepare to Start. הניחו את העמודות עם הקצה התלת-prime הרצוי במיקומים המצוינים על המכשיר.לאחר מכן, לחצו על Start ו-No במכשיר. ברגע שהסינתזה הושלמה, הוציאו את העמודה מהמכשיר והניחו אותה בבקראוק עם תחתית עגולה. ייבשו את העמודה תחת לחץ מופחת למשך כ-0.5 שעות.העבירו את שרף הלבן מהעמודה למבחנה צנטריפוגית בנפח 1.6 מיליליטר, והוסיפו 0.5 מיליליטר של תמיסת מים של מתילאמין ואמוניה. אטמו את מכסה המבחנה הצנטריפוגית עם פאראפילם, וחממו את התוכן ל-60 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. הניחו חפץ כבד מעל המבחנות כדי להבטיח שהריכוז יישמר קבוע.לאחר קירור לטמפרטורת החדר, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך זמן קצר כדי לשקיע את התוכן. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) לפקעת צנטריפוגה חדשה. קררו את הפקעת ל-70 degrees Celsius על ידי הנחה באמבט אתנול ויובש קרח למשך חמש דקות, ולאחר מכן רכזו עד ליובש באמצעות speed vac concentrator.כעת, השביה מחדש את המוצקים ב-0.4 milliliters של תמיסת amine trihydrafluoride, ולאחר מכן אטום את הפקק באמצעות סרט דביק למעבדה. חמם את התמיסה ל-60 °C למשך שעה וחצי. הנח חפץ כבד מעל המבחנות כדי להבטיח ריכוז קבוע.לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, הוסיפו 0.04 milliliters של תמיסת סודיום אצטט, ולאחר מכן ערבבו בעדינות באמצעות קצה פיפטה. הוסיפו מיליליטר אחד של אתנול וקררו את התמיסה לערך של 70- degrees Celsius באמצעות אמבטיית קרח יבש ואתנול למשך 15 דקות. לאחר מכן, סובבו את התמיסה בצנטריפוגה במהירות של 15,000 RPM בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius למשך עשר דקות.השתמשו בפיפטה כדי להוציא את העילוי (supernatant) ויבשו את המשקע שהתקבל תחת לחץ מופחת. לאחר הייבוש, השביו את המוצק שהתקבל בבפר loading buffer, וערבבו עד שהתמיסה תהיה הומוגנית. לאחר מכן, טענו את התסמין אל תוך ג'ל פוליאקרילמיד שהוכן מראש.העבירו זרם דרך הג'ל עד שסימן ה-bromethymol blue יגיע למרחק של חצי עד שני שלישים מגובה הג'ל. לאחר הוצאת הג'ל מהמעמד, העבירו את תכולת הג'ל מהזכוכית אל ניילון נצמד והניחו אותה על פלטת כרומטוגרפיה בשכבה דקה המכוסה בסיליקה, כדי להוות ויזואליזציה של הפסים באמצעות מנורת UV. השתמשו בטוש כדי לסמן את המיקום שבו נמצא הפס העליון, וחתכו אותו באמצעות להב תער.העבירו את הג'ל המכיל את ה-RNA לשפופרת קונית של 50 מיליליטר, ומעכו אותו לחלקים קטנים באמצעות מוט זכוכית. כעת, השעו את שאריות הג'ל בתמיסת נתרן כלורי מימית, ונער את התרחיף בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 12 שעות. העבירו את התרחיף לשפופרת של 15 מיליליטר, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-3400 RPM למשך עשר דקות.כדי להסיר מלחים מהמדגם באמצעות עמודי C18 בעגש הפוך, שטפו תחילה את העמוד באצטוניטריל, מים, אמון חלוריד מימי ותמיסת ה-RNA, כך ששאריות הג'ל יישארו מאחור. לאחר השטיפה במים, בצעו אלוציה של ה-RNA מהעמוד באמצעות שלושה מיליליטרים של תמיסת מתנול מימית בריכוז 60% לתוך שלוש מבחנות שונות. קררו את המבחנות ל-70 מעלות צלזיוס באמבט קרח יבש למשך חמש דקות, ולאחר מכן רכזו את התוכן עד ליובש באמצעות רכז SpeedVac.לאחר ריכוז האלואנט תחת לחץ מופחת, המיס מחדש את השארית ב-0.3 milliliters של מים נקיים מ-RNase. לאחר דילול התמיסה, הנח מיקרוליטר אחד על מכשיר ה-UV vis כדי למדוד את ספקטרום ה-UV vis בין 200 ל-450 nanometers. לצורך אנליזת MALDI-TOF, שטוף תחילה קצה של פיפטה מסוג C18 עם 50% acetonitrile.יש להשרות את קצה הפספגה ב-0.1% trifluoroacetic acid להשגת שיווי משקל. לאחר מכן, יש להטעין את קצה הפספגה בתמיסה המכילה 100 עד 150 picomoles של דגימה. לאחר שטיפת קצה הפספגה ב-0.1% TFA ובמים, יש לאלוט את הדגימה לתוך תמיסה המכילה את המטריצה הרצויה.הטילו 0.9 µL מהתמיסה על פלטת MALDI והמתינו לייבוש הדגימה. לצורך ניתוח מבנה RNA, העבירו את הדגימה המכילה RNA למיקרו-קוובט ומיקמו במחליף הדגימות של מכשיר הדיכרואיזם מעגלי. פתחו את מיכל החנקן כדי לספק זרימה שתניע את מד הזרימה הממוקם במכשיר לערך של כ-40.לאחר מכן, הדליקו את הקירור. כעת, הדליקו את המכשיר. פתחו את התוכנה על ידי לחיצה על סמל ה-Spectrum Manager, ולאחר מכן פתחו את חלון הרכישה (Acquisition) על ידי לחיצה על Spectrum Measurement.לאחר ניקוי המכשיר בחנקן, רכשו את ספקטרום הדיכרואיזם המעגלי על ידי בחירה ב-Measure וב-Parameters. תחת הלשונית General, בחרו ב-200-350 nanometers לסריקה, ב-CD וב-HT עבור הערוצים, ב-0.1 nanometers למרווח הנתונים (data pitch), ב-100 nanometers per minute למהירות הסריקה, ב-one nanometer לרוחב הפס וב-five למספר הצבירות (accumulations). תחת הלשונית Cell Unit, בחרו ב-20 degrees Celsius.בלשונית Control, בחר באפשרות Shutter is opened and closed automatically. בלשונית Information, הזן את שם הדגימה, המפעיל, הריכוז והממס. בלשונית Data, דפדף אל התיקייה הרצויה ולחץ על OK. רכוש את הספקטרה על ידי לחיצה על Measure ולאחר מכן על Sample Measurement.לבסוף, זהו את מיקומי הקובטות במחליף הדגימות מאחת עד שש, ולחצו על OK. ארבעה גדילי ה-RNA הופקו באמצעות סינתזה במוצק, ולאחר טיהור התקבלו בין 300 ל-700 nanomoles מכל אוליגוניוקלאוטיד. כרומטוגרמות ה-MALDI-TOF של האוליגוניוקלאוטידים מוצגות כאן. לא נצפה הבדל משמעותי בספקטרום ה-UV vis הנורמליזציה בהשוואה בין הפס ב-260 nanometers לבין אוליגוניוקלאוטידים קנוניים ומו модиפיים, בין אם בהשוואה של דגימות בעלות גדיל בודד ובין אם במבני duplex.עם זאת, נצפו שינויים קלים במדידת ספקטרום הדיכרואיזם המעגלי שלהם. בנוסף, מדידות Tm של שלושת מבני הדופלקס הראו ערך מובחן שהעיד על destabilization שנגרמה מההטמעה של שינוי ortho-phenylmethyl במיקום הפרימר על אחד הגדילים. חשוב לזכור כי תפוקת הסינתזה במוצק תלויה בטוהר הרכיבים.ללחות תהיה השפעה שלילית על כל שלב, שכן יש לשמור על כמות המים הנוכחת כריאגנט בכל עת. המתודולוגיה המדווחת נועדה לשמש כמשאב כללי עבור מדענים. הטכניקה עשויה להשתנות בהתאם לשינוי הרצוי, למכשור הזמין או למגבלות זמן.סוג הכימיה המיושם כאן מייצג מתודולוגיה חסונה מאוד הנמצאת בשימוש מאז שנות ה-80, ועדיין נמצאת בשימוש נרחב הן במסגרות אקדמיות והן במסגרות תעשייתיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להיות מסוגלים לבצע סינתזה, טיהור ואפיון של אוליגנוקלאוטידים של RNA או DNA, קנוניים או שונו, בעצמכם. זכרו כי עבודה עם הריאגנטים הדרושים עלולה להיות מסוכנת, ויש להשתמש בציוד מגן כגון משקפי מגן, כפפות וחלוקי מעבדה בכל עת.יש לטפל בכל הרכיבים בזהירות, ובתוך מ 빠르게 מסיח כאשר הדבר נדרש.

protocol-for-solid-phase-synthesis-oligomers-rna-containing-2-o

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

עבודה זו מראה כיצד ליצור כלאיים RNA / DNA ברמה כרומוזומליות ולחשוף העברת מידע גנטי מ-RNA ל-DNA הגנומי בתאי שמרים.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

acylation הידרוקסיל '2 סלקטיבית תפוקה גבוהה נותח על ידי הארכה תחל (SHAPE) מנצל כימי רומן חיטוט טכנולוגיה, שעתוק לאחור, אלקטרופורזה נימים ותוכנות לחיזוי מבנה משנית כדי לקבוע את המבנים של RNAs מכמה מאה עד כמה אלף נוקלאוטידים ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

צבעי ציאנין עמידים לאור מחוברים לאוליגונוקלאוטידים כדי לנטר הכלאה על ידי העברת אנרגיה.

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

כאן אנו מציגים פרוטוקול להפגין שיטה יעילה לסינתזה של spirocyclic heterocycles. תהליך חמישה צעדים מנצל מוצק-שלב הסינתזה והתחדשות מייקל מקשר אסטרטגיות. בדרך כלל קשה לסנתז, נציג שיטת הסינתזה של מולקולות spirocyclic אחרת נגיש גישות מודרניות אחרות הניתנות להתאמה אישית.

מוצק-שלב הסינתזה של Oximes Spirocyclic [4.4]

כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשיטת ריצוף מבוססת LC-MS שיכולה לשמש כשיטה ישירה לרצף RNA קצר (&lt;35 nt לריצה) ללא ביניים cDNA, וכשיטה כללית לרצף שינויים שונים בנוקלאוטידים במחקר יחיד בדיוק של בסיס יחיד.

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

אנו מציגים פרוטוקול למדידת דינמיקה מיקרו-אלפית השנייה על ספקטרוסקופיית RNA עם תווית N של 13C/15עם תווית N עם ספקטרוסקופיית פיזור הרפיה של 1H R1ρ.  המוקד של פרוטוקול זה טמון הכנה מדגם טוהר גבוהה והגדרת ניסויי NMR.

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA

אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים הם מרכיבים הנמצאים בכל מקום במסלולים ביולוגיים חיוניים וראו שימוש הולך וגובר ביישומי ביוטכנולוגיה. כאן אנו מתארים טכניקות לסינתזה וטיהור שגרתיים של אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים, החל מאוליגונוקלאוטידים שהוכנו על ידי טכניקות סינתזה אוטומטיות סטנדרטיות.

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים

למד סינתזה של אוליגומרי RNA בשלב מוצק, טיהור ואפיון באמצעות דיכרואיזם מעגלי ו-UV-vis. פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לחוקרים בכימיה של חומצות גרעין.

Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ"א המכיל 2 '

גלה סרטונים נוספים