Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ"א המכיל 2 ' הו שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי
July 28th, 2017
מאמר זה מספק הליך מפורט על סינתזה שלב מוצק, טיהור, אפיון של dodecamers של רנ"א שונה ב C2'- O -position. UV- מול וניתוח מעגלי דיכרואי פוטומטרי משמשים לכמת ולאפיין היבטים מבניים, כלומר , גדילים בודדים או פעמיים גדילים.
המטרה הכוללת של דוח זה היא להמחיש את ההליך להשגת אוליגונוקלאוטידים של RNA באמצעות סינתזה בשלב מוצק. Dodecamers של RNA יסונתזו כמודלים וגם יודגמו טיהור ואפיון שלהם. באמצעות המרכיב הוויזואלי שלו, פרסום זה ירחיב את היקף המתודולוגיות והמתקנים המשמשים לחוקרים בתחומים שונים.
מתן עזר חזותי, יחד עם מעט פרוטוקול יאפשר לחוקרים להשתמש בטכניקות אלה. יתרון אחד של טכניקה זו הוא התאמתה למגוון רחב של שינויים. ככל שהיישומים של היום הופכים תובעניים יותר, חשוב שיהיה פרוטוקול סטנדרטי.
כימיית הזרחן חווה תחייה מחודשת בשל חוסן השיטה והפוטנציאל שלה להשגת אוליגונוקלאוטידים ליישומים טיפוליים. בעוד שרכישת אוליגונוקלאוטידים היא אטרקטיבית, המחיר והזמינות של שינויים מסיטים את העניין לכיוון הכנת אוליגומרים אלה בבית, ובכך הופכים הליך זה לחשיבות עליונה. כדי להתחיל בהליך זה, שקלו כל זרחן לבקבוקי ענבר של 10 מיליליטר מיובשים בתנור וכסו כל בקבוק במחיצה שקודרה בעבר במחט בגודל 20.
הנח את הבקבוקים מיד תחת ואקום באמצעות חומר ייבוש המכיל חומר ייבוש. לאחר מילוי המייבש בארגון יבש, הסר כל בקבוק והוסף מיד אצטוניטריל נטול מים לפני החזקתו על סינתיסייזר פפטידים מוצק. לאחר מכן, הסר את המחיצה מכל בקבוק, והניח על הסינתיסייזר באמצעות פונקציית החלפת בקבוקים.
כדי להגדיר את סינתזת השלב המוצק, בחר בסמל התוכנה. בחר את שם הסינתיסייזר ולחץ על אישור. לאחר מכן, צור סינתזה חדשה על-ידי בחירה באפשרות קובץ וסדר סינתזה חדש. לאחר מכן, השתמש בחלון ההנחיה כדי להזין את תאריך ההפעלה, הלקוח ומזהה ההפעלה.בחר את המכשיר, שם הרצף והרצף.
תחת הכרטיסיה מחזור, הקצה את השיטה שנוצרה קודם לכן. לאחר מכן, בחר במדריך סיום הנוהל, שמשאיר את האוליגונוקלאוטיד קשור לשרף ה-CPG. בחרו DMT כבוי.
שמור את הקובץ על ידי בחירת קובץ ושמור בשם.לאחר מכן, ספק שם לניסוי ולחץ על שמור. לאחר מכן, שלח את הקובץ כדי להתחיל בסינתזה על ידי בחירה בהזמנה ושליחת הזמנה לסינתיסייזר. בחלון ההנחיה, בחר מיקום עמודה ולחץ על אישור. בחלון סינתיסייזר, בחר צג טריטיל.
לחץ על בחר פונקציה, ו-Trityl Monitor כל שלב על ידי הקלדת 1. התחל את הסינתזה על ידי בחירת סינתיסייזר והתכונן להתחיל. הנח את העמודות עם הקצה התלת-ראשוני הרצוי על המיקומים המצוינים על המכשיר.
לאחר מכן, לחץ על התחל ולא במכשיר. לאחר השלמת הסינתזה, הסר את העמוד מהמכשיר והנח אותו בבקבוק עם תחתית עגולה. יבש את העמוד בלחץ מופחת למשך כ- 0.5 שעות.
העבירו את השרף הלבן מהעמוד לצינור צנטריפוגה של 1.6 מיליליטר, והוסיפו 0.5 מיליליטר של תמיסת מתילאמין ואמוניה מימית. אבטח את מכסה צינור הצנטריפוגה עם פרפילם, וחמם את התכולה ל 60 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. הנח חפץ כבד על גבי הצינורות כדי להבטיח שהריכוז נשמר קבוע.
לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, צנטריפוגה קצרה את הדגימה כדי לסובב את התוכן. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש. מצננים את הצינור ל-70 מעלות צלזיוס על ידי הנחתם באמבט אתנול בקרח יבש למשך חמש דקות, ולאחר מכן מתרכזים עד לייבוש באמצעות רכז ואקום מהיר.
כעת, השעו מחדש את המוצקים ב-0.4 מיליליטר של תמיסת אמין טריהידראפלואוריד, ולאחר מכן אבטחו את המכסה עם סרט מעבדה. מחממים את התמיסה ל 60 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. הנח חפץ כבד על גבי הצינורות כדי להבטיח ריכוז קבוע.
לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, הוסיפו 0.04 מיליליטר של תמיסת נתרן אצטט ואחריה ערבוב עדין עם קצה פיפטה. מוסיפים מיליליטר אחד של אתנול ומצננים את התמיסה לכ-70 מעלות צלזיוס עם אמבט אתנול בקרח יבש למשך 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה ב-15,000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך עשר דקות.
השתמש בפיפטה כדי לחלץ את הסופרנטנט ולייבש את הכדור שהתקבל בלחץ מופחת. לאחר הייבוש, יש להשעות מחדש את המאגר המוצק והטעינה המתקבל, ולערבב עד שהתמיסה הומוגנית. לאחר מכן, טען את המתלה על ג'ל פוליאקרילאמיד שהוכן בעבר.
יש למרוח זרם דרך הג'ל עד שהסמן הכחול של הברומתימול ממוקם בין חצי לשני שליש במורד הג'ל. לאחר הוצאת הג'ל מהמעמד, מעבירים את תכולת הג'ל מהכוס לניילון ומניחים על צלחת כרומטוגרפיה שכבה דקה מכוסה בסיליקה, כדי להמחיש את הרצועות באמצעות מנורת UV. השתמש בטוש כדי לתאר את המיקום שבו נמצאת הרצועה העליונה, וחתוך אותה באמצעות סכין גילוח.
מניחים את הג'ל המכיל את ה-RNA לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר, ומועכים אותו לחתיכות קטנות בעזרת מוט זכוכית. כעת, השעו את שאריות הג'ל לתמיסת נתרן כלורי מימית, ונערו את התרחיף בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. העבירו את המתלה לצינור של 15 מיליליטר, ואז צנטריפוגה ב -3400 סל"ד למשך עשר דקות.
כדי להפיל את הדגימה באמצעות מחסנית C18 הפוכה, יש לשטוף תחילה את המחסנית באצטוניטריל, מים, אמוניום כלוריד מימי ותמיסת ה-RNA, ולהשאיר את שאריות הג'ל מאחור. לאחר שטיפה במים, יש להוציא את ה-RNA מהעמודה באמצעות שלושה מיליליטר של תמיסת מתנול מימית של 60% לשלוש מבחנות שונות. מצננים את הצינורות ל-70 מעלות צלזיוס באמבט קרח יבש למשך חמש דקות, ולאחר מכן מרכזים את התכולה לייבוש באמצעות רכז ואקום מהיר.
לאחר ריכוז הנוזל בלחץ מופחת, ממיסים מחדש את השאריות ב-0.3 מיליליטר מים נטולי RNase. לאחר דילול התמיסה, הניחו מיקרוליטר אחד על מכשיר ה-UV vis כדי למדוד את ספקטרום ה-UV בין 200 ל-450 ננומטר. לניתוח MALDI-TOF, יש לשטוף תחילה קצה פיפטה C18 עם 50% אצטוניטריל.
יש לאזן את קצה הפיפטה עם 0.1% חומצה טריפלואורואצטית. לאחר מכן, טען את קצה הפיפטה בתמיסה המכילה 100 עד 150 פיקומולים של דגימה. לאחר שטיפת קצה הפיפטה עם 0.1% TFA ומים, יש להוציא את הדגימה לתמיסה המכילה את המטריצה הרצויה.
הפקידו 0.9 מיקרוליטר מהתמיסה על צלחת MALDI והניחו לדגימה להתייבש. לניתוח מבנה RNA, העבירו את הדגימה המכילה RNA למיקרו-קובטה ומקמו במחליף הדגימה של מכשיר דיכרואיזם מעגלי. פתח את מיכל החנקן כדי לספק זרימה שמניעה את מצוף האוויר הממוקם על המכשיר לכ-40.
לאחר מכן, הפעל את הצידנית. כעת, הפעל את הכלי. פתח את התוכנה על ידי לחיצה על סמל מנהל הספקטרום, ולאחר מכן פתח את חלון הרכישה על ידי לחיצה על מדידת ספקטרום.
לאחר טיהור המכשיר בחנקן, רכוש את ספקטרום הדיכרואיזם המעגלי על ידי בחירת מידה ופרמטרים. תחת הכרטיסייה כללי, בחר 200-350 ננומטר לסריקה, CD ו-HT לערוצים, 0.1 ננומטר לגובה הנתונים, 100 ננומטר לדקה למהירות הסריקה, ננומטר אחד לרוחב הפס וחמישה למספר ההצטברות. תחת הכרטיסיה יחידת תא, בחר 20 מעלות צלזיוס.
תחת הכרטיסייה בקרה, בחר תריס נפתח ונסגר אוטומטית. תחת הכרטיסיה מידע, הזן את שם המדגם, האופרטור, הריכוז והממס. תחת הכרטיסייה נתונים, דפדף לתיקיה הרצויה ולחץ על אישור. רכוש את הספקטרום על ידי לחיצה על מדידה ומדידת מדגם.
לבסוף, זהה את מיקומי הקובטות במחליף הדגימה 1 עד 6, ולחץ על אישור. ארבעת גדילי ה-RNA הושגו באמצעות סינתזה בשלב מוצק, ולאחר הטיהור הניבו בין 300 ל-700 ננומול של כל אוליגונוקלאוטיד. כרומטוגרמות MALDI-TOF של האוליגונוקלאוטידים מוצגות כאן. לא נצפה הבדל משמעותי בספקטרום ה-UV המנורמל בהשוואה של הפס ב-260 ננומטר ואוליגונוקלאוטידים קנוניים ושונה, בין אם בהשוואה לדגימות חד-גדיליות או מבנים דופלקסיים.
עם זאת, שינויים קלים נצפים בעת מדידת ספקטרום הדיכרואיזם המעגלי שלהם. בנוסף, מדידות Tm של שלושת מבני הדופלקס הראו ערך מובהק שהעיד על חוסר היציבות שנגרם על ידי שילוב של שני השינויים הראשוניים של אותיו פנילמתיל באחד הגדילים. חשוב לזכור כי התשואה של סינתזת השלב המוצק תלויה בטוהר המגיב.
לחות תשפיע לרעה על כל שלב, מכיוון שכמות המים הקיימת חייבת להיות מגיבה בכל עת. המתודולוגיה המדווחת נועדה לשמש כמשאב כללי למדענים. הטכניקה עשויה להשתנות בהתאם לשינוי הרצוי, המכשור הזמין או אילוצי הזמן.
סוג הכימיה המשמש כאן מייצג מתודולוגיה חזקה מאוד שנמצאת בשימוש מאז שנות ה-80, ועדיין נמצאת בשימוש נרחב במסגרות אקדמיות ותעשייתיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבצע את הסינתזה, הטיהור והאפיון של אוליגונוקלאוטידים ששונו או קנוניים משלך של RNA או DNA. אל תשכח שעבודה עם הריאגנטים הדרושים עלולה להיות מסוכנת, ויש ללבוש ציוד מגן כגון משקפי מגן, כפפות ומעילי מעבדה בכל עת.
יש לטפל בכל הריאגנטים בזהירות, ובתוך מכסה אדים במידת הצורך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה ממחיש את הנוהל לקבלת אוליגונוקלאוטידים של RNA באמצעות סינתזה בפאזה מוצקה, תוך התמקדות בדודיקאמרים. הוא כולל טכניקות טיהור ואופיינות, ומשפר את המתודולוגיות של החוקרים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
- כימיה של חומצות גרעין
רקע
- סינתזה בפאזה מוצקה היא טכניקה נפוצה לייצור אוליגונוקלאוטידים.
- אופיינות של מבני RNA חיונית להבנת תפקודיהם.
- עזרים ויזואליים יכולים לשפר את ההבנה של מתודולוגיות מורכבות.
- פרוטוקולים סטנדרטיים חיוניים לשחזור במחקר.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לסינתזת דודיקאמרים של RNA.
- להדגים שיטות טיהור ואופיינות.
- להרחיב את היקף המתודולוגיות הזמינות לחוקרים.
שיטות בשימוש
- סינתזה בפאזה מוצקה של דודיקאמרים של RNA.
- טכניקות טיהור לאוליגונוקלאוטידים.
- ניתוח פוטומטרי UV-vis לכימות.
- דיכרואיזם מעגלי לאופיינות מבנית.
תוצאות עיקריות
- סינתזה מוצלחת של דודיקאמרים של RNA הושגה.
- האופיינות אישרה את שלמות המבנה של ה-RNA המסונתז.
- השיטות שהוצגו ישימות לשינויים שונים של RNA.
- עזרים ויזואליים משפרים משמעותית את ההבנה של הפרוטוקולים.
מסקנות
- הפרוטוקול המוצג הוא משאב חשוב לחוקרים.
- שיטות סטנדרטיות משפרות את השחזור בסינתזת RNA.
- ניתן לחקור יישומים נוספים באמצעות הטכניקות המתוארות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables in-house synthesis of modified RNA oligonucleotides, supporting target validation and lead identification in nucleic acid therapeutics. By providing a robust, amenability-driven method for incorporating 2'-O-thiophenylmethyl modifications, it reduces reliance on external vendors and accelerates preclinical de-risking. The integration of circular dichroism for structural assessment adds predictive value to early-stage oligonucleotide design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through site-specific incorporation of 2'-O-thiophenylmethyl modifications to assess functional impact on RNA structure and stability.
- Operational Value: Supports rapid generation of structure-activity relationship (SAR) data by allowing synthesis of oligonucleotides with zero, one, or two modifications at defined positions.
- Predictive Value: Circular dichroism data provides quantitative structural readouts that help de-risk target engagement hypotheses before cellular or in vivo testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces purified, quantifiable RNA dodecamers suitable for use as probes or standards in binding assays and structural screening platforms.
- Operational Value: Standardized solid-phase synthesis and purification workflow (CPG support, AMA cleavage, HF/TriEtOH treatment, PAGE, and C18 RP-HPLC) ensures batch-to-batch reproducibility for assay development.
- Scalability: Methodology is amenable to parallel synthesis and can be adapted to various modifications, supporting medium-throughput oligonucleotide generation for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables generation of modified RNA constructs that mimic potential therapeutic candidates, facilitating extrapolation from chemical modification to biological activity.
- Preclinical De-risking: Observed changes in circular dichroism spectra and thermal melting (Tm) values provide early indicators of structural perturbation and duplex destabilization, informing go/no-go decisions.
- Mechanistic Insight: Allows correlation of 2'-O-thiophenylmethyl incorporation with altered RNA conformation, supporting mechanistic understanding of modification effects on target binding or ribonuclease resistance.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting lead identification through structured oligonucleotide generation and biophysical characterization prior to preclinical advancement.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven synthesis of modified RNA to probe structure-function relationships and validate targets through chemical perturbation.
- Screening: Delivers quantifiable, structurally characterized oligonucleotides suitable for use in affinity-based or functional screening assays.
- Analytics: UV-vis provides accurate quantification; circular dichroism delivers secondary structure metrics (e.g., ellipticity changes) that allow comparison between modified and canonical RNA.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical by generating modified RNA species that can be evaluated for stability, binding, and functional activity in downstream models.
- Enterprise Reuse: Phosphoramidite-based solid-phase synthesis is a platform capability applicable across multiple oligonucleotide projects, reducing revalidation burden and enabling modular adaptation to new chemistries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by enabling precise modification placement and direct assessment of structural consequences via circular dichroism.
- Operational Value: Delivers reproducible, purified RNA oligonucleotides with defined modification patterns, reducing variability in downstream experiments.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling internal production of complex, modified oligonucleotides that may be costly or unavailable commercially.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing early biophysical data (e.g., Tm, CD shifts) to inform progression of lead candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phosphoramidite chemistry, oligonucleotide handling, and anhydrous conditions to prevent moisture-induced synthesis failures.
- Needs access to a nucleic acid synthesizer, HPLC or C18 solid-phase extraction equipment, polyacrylamide gel electrophoresis setup, and a circular dichroism spectrometer with temperature control.
- Demands standardized workflows for synthesis, cleavage, deprotection, gel-based purification, desalting, and QC to ensure cross-team consistency.
- Must account for modification-specific coupling efficiencies and potential steric effects during solid-phase synthesis, particularly with bulky 2'-O-thiophenylmethyl groups.
- Limited by the need for specialized reagents (e.g., HF/TriEtOH for deprotection) and safety infrastructure due to hazardous chemical handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Solid-phase Synthesis of RNA Oligonucleotides
3:25
Deprotection and Purification of RNA Oligonucleotides
7:12
Characterization via MALDI-TOF and RNA Structure Analysis vi CD
9:24
Results: Characterization of RNA Oligomers Containing 2'-Othiophenylmethyl Modification
10:25
Conclusion
![מוצק-שלב הסינתזה של Oximes Spirocyclic [4.4]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F58508.jpg%3Fv%3D2026-07-04T05%253A56%253A50.000Z&w=384&q=75)
