וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את הפעילות הציטוטוקסית של תאי NK אנושיים. ניתן להשתמש בשיטה זו למעקב אחר חולים עם חסר תאי NK פונקציונלי או קלאסי. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו, המבוססת על ציטומטריית זרימה, הם רגישותה, הדירותה (reproducibility) והיותה מהירה יותר משיטות סטנדרטיות להערכת תפקודי תאי NK, כגון בדיקת שחרור כרום רדיואקטיבי.

ניתן להשתמש בשיטה זו לבדיקה של טיפולים חדשניים המכוונים לתאי NK, כמו גם לניתוח פלוא-ציטומטרי רב-פרמטרי מעמיק של ביולוגיית תאי NK, דבר שלא היה בר-השגה בעבר. התחילו בביצוע הפרדה במדרג צפיפות כדי לבודד תאים חד-גרעיים מדם פריפרי, או PBMC's, מדגימות דם מלא בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. שימוש ב-PBMC's במקום בתאי NK מבודדים הוא בעל יתרון רב בעבודה עם דגימות קליניות.

דללו את התאים המבודדים לריכוז של 5×10⁶ תאים למיליליטר במצע מלא ואספו מיד את תאי המטרה K562 על ידי סנטריפוגציה. השביהו מחדש 5×10⁵ תאי 562 ב-500 µL של מצע טרי המועשר ב-1% FBS. לאחר מכן, סמנו את תאי המטרה באמצעות 500 µL של תמיסת עבודה CFSE וערבבו בעדינות את תמיסת התאים באמצעות פיפטור 3 עד 5 פעמים.

לאחר 10 דקות ב-37 degrees Celsius תחת הגנה מאור, עצרו את תגובת הסימון באמצעות 10 milliliters של מצע מלא למשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בסיום דגירת העצירה, אספו את התאים על ידי סנטריפוגציה ושספו מחדש את משקע תאי המטרה המסומנים ב-one milliliter של מצע מלא לצורך ספירה. לאחר מכן, דללו את התאים לריכוז של 1 × 10⁵ תאים למיליליטר במצע מלא טרי, והעבירו את תאי המטרה לאינקובטור לח ב-37 degree Celsius ו-5% carbon dioxide.

לקבלת תוצאות בדיקה מוצלחות, יש להפחית למינימום את העקה של תאי המטרה ולבדוק את תאי האפקטור בהקדם האפשרי לאחר האיסוף. תוך 30 דקות מהסימון של תאי המטרה, סמנו פלטה בעלת 96 בארות עם תחתית בצורת U שעברה טיפול לתרביות רקמה, בהתאם לטבלה. לאחר מכן, הוסיפו 100 microliters של מצע מלא לבארות עם יחס תאי אפקטור לתאי מטרה של 25 ל-1, 12.5 ל-1 ו-6.25 ל-1, לבארות עם תאי מטרה בלבד ולבארות עם תאי אפקטור בלבד.

הוסיפו 100 µL של תאי אפקטור לבארות ביקרת הציטוטוקסיות ולבארות עם יחס תאי אפקטור לתאי מטרה של 50:1 ו-25:1. לאחר מכן, החל מבארת עם יחס תאי אפקטור לתאי מטרה של 25:1, העבירו 100 µL של תאים לבאר עם ריכוז יחס התאים הנמוך הבא עבור שתי הבארות הבאות, תוך דילוג על הבארות המכילות תאי מטרה בלבד, ערבבו היטב בין כל העברה של תאים, והוסיפו את 100 µL האחרונים של תאים לבארות המכילות תאי אפקטור בלבד. הוסיפו 100 µL של תמיסת עבודה 2X של 0.2% Tween לבארות ביקרת המוות החיובית של K562 עם Tween בלבד.

הוסיפו 30 µL מתמיסת העבודה של מבחנה שתיים לבארות של ביקורת החיוביות לציטוטוקסיות של תאי NK. לאחר מכן, הוסיפו 1×10⁵ תאי מטרה K562 מסומנים למילליליטר ב-100 µL של מצע מלא לכל הבארות, למעט הבארות המכילות תאי אפקטור בלבד. לאחר שכל התאים הועברו לבארות, ערבבו את כל הבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית.

שקעו את התאים באמצעות צנטריפוגציה קצרה והניחו את הפלטה באינקובטור לתרביות תאים למשך ארבע שעות. בסיום האינקובציה, הניחו את הפלטה על קרח או על משטח קרר, והוסיפו 50 µL של צבע לתאים מתים שהוכרה טרי לכל באר. לאחר מכן, ערבבו בעדינות את כל הבארה ונתחו את התאים באמצעות ציטומטריה של זרימה.

ניתוח פלואו-ציטומטרי של CSFE וצביעת תאים מתים לאחר ארבע שעות של תרבית קרה, כפי שהודגם זה עתה, מגלה כי התאים בבארים המכילות תאי מטרה בלבד חווים מוות תאי של 15% או פחות. לא מזוהה אות CSFE בבארים המכילות תאי אפקטור בלבד, כאשר נצפה מוות תאי של פחות מחמישה אחוזים בבארים אלו. לעומת זאת, מוות התאים בבארים שבהן התהליך מתווך על ידי Tween להריגת תאי המטרה הוא בדרך כלל מעל 85%. בחולים עם פגם בתפקוד תאי NK, נצפית פעילות הריגה מופחתת ברוב או בכל היחסים שנבדקו בהשוואה לאנשים בריאים, דבר המעיד כי תאי ה-NK של חולים אלו מראים הפחתה דיפרנציאלית בציטוטוקסיות המתואמת עם ירידה ביחס בין התאים האפקטורים לתאי המטרה.

לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בשישה וחצי שעות, כולל שעתיים של הכנה וזריעה, ארבע שעות של דגירה ו-30 דקות של רכישת נתונים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין את תאי המטרה ותאי האפקטור במקביל, כדי לצמצם את זמן ההמתנה בין הכנת התאים לתחילת הדגירה המשותפת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד את הפעילות הציטוטוקסית של תאי NK אנושיים כנגד תאי מטרה מסומנים פלואורסצנטית באמצעות ציטומטריה של זרימה.