Name: הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: למדו כיצד לשנות חדירות של מוטציות שלד קטלניות בדגי זברה באמצעות ריבוי סלקטיבי ומבחני צאצאים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של תסמינים גנטיים ומנגנוני פיתוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות צ'אק קימל להדרכה, ג'ון דאוד לעזרה בפיתוח אסטרטגיה זו רבייה, ווקר Macie שלה לעבודה בלשפר את הכתם השלד, ואת Charline ווקר בוני אולמן לעצות מועילות דג זברה. עבודה זו נתמכה על ידי K99/R00 DE024190 כדי JTN.

כל הניסויים המתוארים פרוטוקול זה הושלמה בשנת בהתאם ותאימות עם מאוניברסיטת קולורדו, של אוניברסיטת אורגון מוסדיים טיפול בעלי חיים, שימוש ועדות (IACUC).
 1-הכנת המניה מתחילה שלא נבחרו <ol><li>זיהוי שירות heterozygous של אלל mutant הריבית על ידי פין קליפ 11 genotyping מלאי של מלא-אחים בעלי חיים על ידי שיטת הבחירה, כגון 13 , 12 , KASP 14. פרוטוקול זה בוצעה עם המתח דג זברה mef2ca b1086.</li>
	<li>KASP genotyping 
	הערה: צבעי יסוד מסוים אלל KASP תוכננו על ידי החברה המספקת את ריאגנטים (ראה טבלה של חומרים). כדי להשיג 6-carboxyl-X-rhodamine (רוקס) לצבוע הריכוז המתאים עבור המכונה PCR בזמן אמת מסוימת לבקר באתר האינטרנט של החברה.
	µL <ol><li>המקום הרקמה זנב דג זברה ב-50 מאגר פירוק (טריס 10 מ מ (pH 8.3), 50 מ מ אשלגן כלורי, MgCl 1.5 מ מ 2, 0.3% ללא יונית חומרים פעילי שטח, 0.3% Octylphenyl-פוליאתילן גליקול). להוסיף 10 µL של 10 מ"ג/מ"ל Proteinase-K לכל טוב של 96-ובכן PCR צלחת וכן תקציר הצנטרפוגה תרמי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 2-5 h ואחריו צעד איון 94 ° C 20 דקות. להכניס למקרר תוצר פירוק לאחר עיכול. הערה: פירוק מוצרים יכול לשמש בהצלחה במשך מספר חודשים לאחר ההכנה. כאשר רקמות היה lysed באמצעות 50 מ"מ NaOH, התגובות KASP היו לא מוצלח. ממצאים אלה מראים כי שיטת NaOH ההכנה דנ א גנומי אינה תואמת ל- KASP.</li>
		<li>לכמת את הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את תבנית DNA גנומי באמצעות מים כיתה ביולוגיה מולקולרית, כך כל התגובה מכילה כ- 20-30 ננוגרם. 
		הערה: לכמת דגימות 4 או 5, בריכה אותם ולאחר מכן להכין דילולים עבור כל הדגימות מבוסס על הממוצע. בעת שימוש בפרוטוקול זה על הזנב הבוגרים רקמות, לדילול מטריים לעתים קרובות מספיק. כימות מדויק של ריכוז הדנ א אינה נדרשת.</li>
		µL <li>הוסף 0.14 של פריימר KASP לערבב, 5 µL של המאסטר KASP לערבב עבור דגימה על קרח לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL לערבב היטב לפני בקצרה צריך שתוציאו לאסוף תוכן בתחתית השפופרת. 
		הערה: מיקס מאסטר KASP חום, אור רגיש, שומרים מלאי בקרח ולהימנע אור ישיר-</li>
		<li>Pipet 5 µL של פריימר/מאסטר לערבב פתרון לתוך הבארות של צלחת PCR 96-ובכן אופטי מתאים המכונה PCR בזמן אמת בשימוש.</li>
		<li>Pipet 5 µL של מדולל (כ 5-7 ng/µL) דגימות די אן איי תבנית לתוך כל טוב ואני האחות עם פיפטה לערבב.</li>
		<li>µL 5 להוסיף מים נטולי נוקלאז 3 בארות כדי לשמש כפקדי לא-תבנית (NTC) ולהוסיף 5 µL מסוג מדולל אישר homozygous בר, משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים homozygous מוטציה דנ א בתבנית עבור פקדים חיובי.</li>
		<li>הצב של החותם שטיחות מובהק על הבטחת הצלחת הסרט הוא אטום לחלוטין על כל טוב.</li>
		<li>Centrifuge בקצרה את הצלחת ב g x 600 כדי לאסוף את התוכן בתחתית וכדי להסיר את הבועות מהתערובת. 
		הערה: למנוע את הצלחת על קרח, מגן אור עד מוכן להמשיך.</li>
		<li>להשתמש בתוכנית אופניים שמוצג בטבלה 1 לביצוע התגובה העיקרית KASP.</li>
		<li>להציג את העלילה פיזור וכתוצאה מכך המופק על ידי המחשב ניתוח. תגובת מוצלח יציג 4 קבוצות נפרדות של נקודות על המגרש ( איור 3): שלושה לטעום קיבוצים המתאים גנוטיפ, ולקיבוץ אחד NTCs ליד המקור. הפקדים חיובית צריך לארגן עם הקיבוץ הדגימה המתאימה.</li>
		<li>אם התוכנית המחשב אינו מזהה את העלילה קיבוצים כמו המקביל ספציפיים אחרים, נוסף על אופניים ערכות עשוי להיות נחוץ (טבלה 2). חזור על התוכנית נוספים עד המחשב מזהה קיבוצים חזק על ידי גנוטיפ.</li>
		<li>לייצא את התוצאות genotyping בקובץ הגיליון האלקטרוני קל לשימוש ללא ניתוח.</li>
	</ol></li> <li>בית החיות משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מזוהה יחד על מערכת המים הראשי.</li></ol>
 2. הראשונה בסיבוב של רומא הניקוד <ol><li>של Pairwise לחצות heterozygotes אח <ol><li>אחרי החיות להתאושש הסרטון סנפיר, להגדיר pairwise intercrosses. השתמש חוצצים כדי להבטיח עוברי סינכרונית 16.</li>
		<li>לאסוף את העוברים ולשמור את זוגות הורים מבודד רביה כלובים.</li>
		<li>לפקח מבוגרים מבודד כך אגרסיבי דגים יכול להיות מופרדים או מסופק עם כיסוי (דגים גרוסים רשתות יפה עבודה). הדג צריך להיות מוזן ואת המים שלהם השתנה בעקבות הנחיות IACUC בזמן במים סטטי.</li>
	</ol></li> <li>העובר לגידול <ol><li>הבמה ומעלים את העוברים דג זברה רימות תחת תנאים סטנדרטיים 17 עד.</li>
		<li>לאסוף חיות phenotypically פראי-סוג באמצעות פיפטה מזכוכית ביום 5 או 6, כאשר השלפוחית מנופח ב 75% של המצמד. למקם סוגים הפרוע פנוטיפי בחדר הילדים הקלטה של הורים אשר הניב אותם. 
		הערה: עם אללים mutant כי הם גן # מושגים בסיסיים קטלני, מה שנכון של מוטציות רבות השלד, מוטציות homozygous להיכשל טופס שלפוחיות שחייה 18 , 19. לכן, סוגי הפרוע פנוטיפי בקלות מבחינים מן אחיהם מוטציה בהתבסס על שלפוחיות שחייה המנופח.</li>
	</ol></li> <li>מכתים עצם סחוס אדום כחול/Alizarin Alcian <ol><li>עזים ומתנגד בזחלים, אל תנפח את שלפוחיות שחייה באמצעות 0.17 g/L Tricaine-S העובר בתקשורת. לאסוף חיות לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL עם כוס רחב נשא pipet פסטר. הוספת הזחלים לא יותר מ 100 למחזור.</li>
		<li>להסיר העובר מים מהצינור כל ולתקן חיות ב מ 1 ל 2% paraformaldehyde ב 1 x PBS למחזור. 
		התראה: כדורגלן מימית דליק, יגרום לגירוי העור והעין רציני. ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כגון כפפות הגנה העין, רחץ את ידיך ביסודיות לאחר שימוש.</li>
		<li>אבן 1 h; קיבוע יותר פוגע עצם מכתים. לבדוק את הצינורות באופן קבוע במהלך זה, כל והשלבים נדנדה על מנת להבטיח את הזחלים לא להיות תקוע בצד או התגבש בתחתית השפופרת.</li>
		<li>להסיר את מקבע משפופרות באמצעות פיפטה של זכוכית, להוסיף 1 מ"ל של 50% אתנול, ו רוק במשך 10 דקות</li>
		Premix אדום Alizarin לכל 1 מ ל Alcian <li>הכן טרי מכתימה את הפתרון על-ידי הוספת 20 µL של 0.5% (0.04% Alcian כחול/10 מ מ MgCl 2 / 80% אתנול). הסר את 50% אתנול, להוסיף 1 מ"ל של צביעת לפתרון כל שפופרת, ו רוק בן לילה. הזחלים יכולה להישאר בתיקייה הכתם עד 5 ימים.</li>
		<li>להסיר הפתרון כתם של הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל של 80% אתנול/10 מ מ MgCl 2 פתרון כל שפופרת. רוק הצינורות במשך לפחות שעה; שטיפה לילה יכול לייצר כתם כחול Alcian ברור יותר.</li>
		<li>להסיר את 80% אתנול/10 מ מ MgCl פתרון 2 מן הצינורות, להוסיף 1 מ"ל של 50% אתנול; אבן 5 דק.</li>
		<li>להסיר את הפתרון אתנול 50% מן הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל של 25% אתנול וביו -רוק עבור 5 דק.</li>
		<li>להסיר הפתרון אתנול 50% מן הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל טריה 3% H 2 O 2 <פתרון הלבנת KOH /sub>/0.5%. להשאיר את כמוסות פתוח ולתת הצינורות לעמוד במעמד מיקרו-שפופרת למשך כ- 10 דקות או עד צבע חום חלש ניתן לראות את החלק העליון של הפתרון. 
		הערה: שכבה של טופס בועות על הפתרון. זהירות העיתוי נדרש בשלב זה, כמו מעל הלבנת וכתוצאה מכך כתם זוגי המסכן.</li>
		<li>להסיר הפתרון הלבנה והסרת להוסיף 1 מ"ל של 25% glycerol/0.1% קו; אבן 10 דקות לח' 1</li>
		<li>ולהסיר 25% glycerol/0.1% קו פתרון של הצינורות, להוסיף 1 מ"ל של 50% glycerol/0.1% קו פתרון כל שפופרת, רוק 10 דקות ללון.</li>
		<li>להסיר 50% glycerol/0.1% קו פתרון של הצינורות ולהוסיף שוב 50% glycerol/0.1% קו פתרון כל שפופרת. נדנדה בין לילה יסייע להסיר בועות אוויר זה יכול להצטבר בתוך הזחלים. חנות צבעונית ההכנות השלד ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש.</li>
	</ol></li> <li>פנוטיפ הניקוד <ol><li>ציון צבעונית צאצא מוטציה. עבור penetrance של פנוטיפ שנבחר. ב. ניקולס et al. 1 מוטציות זכו עבור כל מופע של עצם חוץ רחמי- 
		הערה: מאחר דג זברה ההורים במים סטטי הכתם האדום Alizarin יכול לדעוך עם הזמן, זה חשוב להבקיע שלדים בתוך ימים ספורים של השלמת הכנת השלד.</li>
		<li>Penetrance הוא היחס גנוטיפ בעל פנוטיפ. לחשב את אחוז penetrance לפי הנוסחה הבאה: % penetrance = (מוטציות עם פנוטיפ) / (מספר כולל של מוטציות) × 100</li></ol></li></ol> 3. בחירת המשפחה penetrance גבוהה <ol><li>בחר שתי, שתי משפחות penetrance נמוך עבור הדור הבא. בנוסף penetrance, חשוב לשקול פוריות, מרץ כאשר בוחרים אילו משפחות להפיץ; ראה דיון לקבלת פרטים נוספים על זה.</li>
	<li>לתת כל זוג הורים מזהה מלאי sub: המשפחה.01,.02, וכו</li>
	<li>בית זוגות הורים במערכת המרכזית בסקס מעורב מספר &#39; לוויה &#39; דגים. לוויה דגים יכולים להיות כל קו דג זברה עם תכונות מזהות קבוע, ברור, כגון מבנה פיגמנטציה או סנפיר שינו. 
	הערה: בעוד חוקרים רבים לשמור בהצלחה רק זוגות בתוך מיכל רבייה, תוצאות חיוביות נראים על ידי דיור זוגות עם כמה דגים לוויה. שלב אופציונלי זה מאפשר זוגות של חיות יוחזקו בבתי ספר גדולים יותר, לאחזר בקלות אז הם יכולים להיות שוב ושוב חצו כנדרש. זוגות הורים ניתן חצה שוב ושוב כדי ליצור משפחות גדולות מלא-אחים; לחכות לפחות שבוע לפני חוזר חוצה את אותו זוג הורים-</li>
	<li>ללקט את המשפחות הזחל מ שלב 2.2.2. אשר לא נבחרו עבור הדור הבא.</li>
	<li>תווית המיכלים המכילים את הזחלים פראי-סוג אחים ממשפחות שנבחרו עם penetrance של אחיהם מוטציה ולגדל לבגרות כרגיל.</li>
	<li>הדור הבא יהיו לפחות ארבע משפחות מלא-אחים, 2 עבור שורת כלפי מעלה ו-2 עבור שורת כלפי מטה-</li>
	<li>כאשר הזחלים מגיעים לבגרות מינית, חזור על פרוטוקול החל השלב הראשון עם הדור החדש.</li>
</ol>

<ol><li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li>
<li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism%2C+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+%28HDR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li>
<li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938(2012).</li>
<li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li>
<li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190(2014).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li>
<li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030235931095">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li>
<li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLerner%2C+IM+%22Population+Genetics+and+Animal+Improvement%22">Population Genetics and Animal Improvement</a>. , Cambridge University Press. (1950).</li>
<li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li>
<li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCAPS%2C+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms%3A+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li>
<li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138(2014).</li>
<li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping%3A+the+KASP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li>
<li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11032-013-9917-x">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li>
<li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273260117_Introduction_of_High_Throughput_and_Cost_Effective_SNP_Genotyping_Platforms_in_Soybean">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li>
<li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I%3A+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li>
<li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+ways+to+lose+your+bladder%3A+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Dev%22%5BJournal%5D)">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li>
<li>Mrakovčič, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1095-8649.1979.tb03612.x/abstract">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li>
<li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n11/full/nrg2664.html">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li>
<li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li>
<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
<li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39(2015).</li>
<li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FishFace%3A+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Bio%22%5BJournal%5D)">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23(2013).</li>
<li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li>
<li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522(2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ברירה מלאכותית חשפה הדקויות של הפונקציה ג'ין
הסטה פנוטיפים מוטציה כדי להיות יותר או פחות חמור על ידי ברירה מלאכותית היא דרך פשוטה לקבל תובנות חדשות הגן פונקציה. כאשר לעומת בשיטות סטנדרטיות של גידול שלא נבחרו, פרוטוקול המובאת כאן יכולות להניב הבנה יותר מלאה של פנוטיפים מוטציה. באופן ספציפי, על ידי יצירת זנים כי הם קשים, בקונסנזוס פנוטיפים מוטציה מלאה תוכל להיחשף, ובהם כמה שהיו לניכוי עם מניות שלא נבחרו. לפיכך, תפקידים התפתחותיים חדשים עבור הגן שנבחנה ניתן לגלות. לעומת זאת, יציר...

דג זברה היא מערכת מודל רב עוצמה להבנת התפתחות השלד. עם דג זברה מוטנטים זנים, ביולוגים יכולה לפענח תפקוד הגן במהלך skeletogenesis. עם זאת, דג זברה מוטנטים פנוטיפים השלד יכול להציג עם משתנה penetrance1,2,3,4 אשר יכול לעכב ניתוחים גנטיים ובעיות התפתחותיות. מטרת שיטה זו הוא פי שלושה. ראשית, יצירת קווי מוטציה דג זברה אשר מייצרים באופן עקבי פנוטיפים חמור מאפשר מחקרים התפתחותיים במורד הזרם כמו הקלטה זמן לשגות5 והשתלת6. אלה מיני מחקרים, יכול להיות נכה-ניסיון ללמוד פנוטיפים רק לידי ביטוי באופן בלתי עקבי. שנית, הניחוש הראשון שלי דג זברה זנים יכול להפחית וריאציה הרקע הגנטי, ובכך לקדם הפארמצבטית והעקביות ניסיוני. לדוגמה, ביצוע כל רגע בחיי עיר הכלאה ניתוחים על זן טבעי סלקטיבי אחד יכול להפחית את השתנות מבלבלים ולחזק את המסקנות. שלישית, יצירת זנים קשות ורכות תחשוף את הסידרה פנוטיפי כולה יכולה לנבוע מוטציה מסוימת.
במבט ראשון, ברירה מלאכותית של מוטציות קטלני נראה בלתי אפשרי. איך זן אחד של penetrance כאשר בעלי החיים הם הבקיע עבור הבחירה מתים? למרבה המזל, שיטות ריבוי סלקטיבי לפי בחירה משפחה, במיוחד רומא בדיקות, הדגימו יעילות תוכניות עבור שנים רבות7,8לגידול בעלי חיים. תוכניות אלה משמשים בעיקר מלאכותית עבור התכונות קיימים רק מין אחד, כמו ייצור החלב בפרות או ייצור הביצים של התרנגולות. הזכרים של המינים הללו לא הבקיע ישירות, אבל הצאצאים שלהם הם הבקיע, לאחר מכן, ערך מוקצית עם ההורים. מגזרים של אסטרטגיה זו, פרוטוקול המובאת כאן כרוכה הבקיע את קבוע, מיטה צאצא מוטציה של זוג דג זברה כי הם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור הגן המוטנטי עניין. Penetrance של הפנוטיפ של צאצא מוטציה קטלנית homozygous מוקצה ההורים כאשר מחליטים אנשים אשר יהיה לייצר את הדור הבא של הקו. אנו מוצאים כי שיטה זו היא אמצעי יעיל של הסטה penetrance דג זברה מוטנטים השלד קטלני1.
בדומה מחקרים אחרים, פרוטוקול ריבוי סלקטיבי זה לוקח תחת שיקול קריטריונים כמו גודל תטולה, ההישרדות של הצאצאים, התפתחות תקינה של העוברים, יחס9. עם זאת, גורמים אלו כל נחשבים בהקשר של רקע מוטציה עם המטרה של הסטה של penetrance מוטציה. לכן, פרוטוקול זה מרחיב פרדיגמות מלאכותית הקודם על-ידי המציע שיטה כדי לחזק ניתוחים מוטציה התפתחותית, כמו גם להגביר את הרקע הומוגניות.
פרוטוקול זה דורש genotyping נרחב, לכן חשוב לפתח פרוטוקול אמין, מהיר genotyping מראש. ישנם רבים genotyping הפרוטוקולים הזמינים10,11, עם זאת אנו מוצאים את KASP genotyping12,13,14 הוא מהיר יותר, עלות גבוהה יותר יעילה ואמינה יותר מאשר שיטות מבוסס על אנזים הגבלה המחשוף של רצפי מוגבר10. לכן, אנו כוללים את פרוטוקול KASP בעבודה זו. בנוסף, אנו מתמקדים השלד פנוטיפים מוטציה בפרוטוקול זה, לכלול הליך של אדום כחול/Alizarin Alcian מכתים ששונה בין הפרוטוקולים הקודמים15.
השיטה המתוארת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור העברת penetrance מוטציה קטלנית כלפי מעלה או כלפי מטה. בעוד פרוטוקול זה מתמקד פנוטיפים מוטציה השלד, אנו מאמינים שזה יהיה שימושי אסטרטגיה האחזקה של כל הקווים דג זברה מוטנטים. למעשה, התועלת של אסטרטגיה זו רבייה סביר חורג דג זברה. אנו צופים כי פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להזיז penetrance במגוון רחב של אורגניזמים. הסטה penetrance קטלני על-ידי בדיקת רומא יכול לעזור לדחוף קדימה את ההתקדמות של כל חוקר גנטיקה התפתחותית.

<table><tbody><tr><td>פרפורמלדהיד, כדורים, מוצק</td><td>טד פלה ושות'.</td><td>18501</td><td>גלולה PFA היא אלטרנטיבה בטוחה יותר לאבקת PFA</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד, מוצק</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, פישר מימי</td><td></td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 הוכחה אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלסיאן כחול, מוצק</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>חייב להיות מ- Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin אדום, מוצק</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול,</td><td>נוזלי פישר</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן,</td><td>נוזלי פישר</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד, &nbsp; מוצק</td><td>פישר</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus מכונת PCR בזמן אמת</td><td>מיושמת ביו-סיסטמס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp לוח תגובה אופטי מהיר 96 בארות עם ברקוד (0.1 מ"ל)</td> <td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>חותם Microseal 'B'</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, High</td><td>ROX LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, מוצק</td><td>פישר</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי, מוצק</td><td>פישר</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, נוזלי</td><td>פישר</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>צניחת פסטר מבוקרת פישר</td><td></td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>לכימות DNA</td></tr></tbody></table>

הסטה דג זברה קטלני השלד penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

דג זברה מוטנטים פנוטיפים לעיתים קרובות שהיישום penetrant, מתבטא רק בכמה מוטציות. מעניין פנוטיפים המופיעים באופן בלתי עקבי יכול להיות קשה ללמוד, יכול להוביל משתנה מתערב תוצאות. פרוטוקול המתואר כאן הוא פרדיגמה הרבייה פשוטה כדי להגדיל או להקטין penetrance של מוטציות שלד דג זברה קטלני. כי מוטציות קטלני לא יכול להיות bred סלקטיבי ישירות, האסטרטגיה הקלאסי ברירה מלאכותית של רומא בדיקות הוא מועסק. שיטה זו כוללת גם פרוטוקולים עבור דג זברה genotyping Kompetitive אלל PCR ספציפיים (KASP), צביעת דג זברה זחל סחוס ועצם. יישום האסטרטגיה גידול שמתואר כאן יכול להגביר את penetrance של פנוטיפ השלד מעניין הפעלת עוד תוצאות לשחזור ביישומים במורד הזרם. בנוסף, הפחתת את penetrance מוטציה באמצעות אסטרטגיה זו ברירה מלאכותית יכול לחשוף תהליכים התפתחותיים רוב מכריע דורשות בפונקציה של גן שעבר מוטציה. בעוד השלד במיוחד נחשב כאן, אנו מציעים כי מתודולוגיה זו יהיה שימושי עבור כל השורות דג זברה מוטנטים.

פרוטוקול זה היא טכניקה גידול לטווח ארוך שימושי עבור הבנה דג זברה מוטנטים השלד (איור 1). ברירה מלאכותית על ידי רומא בדיקות אמור להניב משמרת ב- penetrance הכללית כלפי מטה והן כלפי מעלה תוך מספר דורות (איור 2). בעבודה הקודמת, שני סיבובים של ברירה מלאכותית הסיע את penetrance הממוצע כלפי מטה מ- 17% ל- 3%1. באופן דומה, בקו שלנו כלפי מעלה, אנחנו העביר את penetrance הממוצע כלפי מעלה מ- 63% 93% תוך שלוש דורות. אם ל...

המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.

הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

המטרה הכללית של אסטרטגיית הרבייה זו היא לשנות את חדירות המוטציה (penetrance) כלפי מעלה או כלפי מטה. שיטת רבייה סלקטיבית זו מאפשרת הבנה מלאה יותר של פנוטיפים מוטנטיים. באמצעות יצירת זני מוטנטים בעלי חדירה גבוהה ונמוכה, ניתן להבין את הסדרה הפנוטיפית המלאה של מוטציה מסוימת.ברוב מקרי דגי zebrafish, כאשר המוטציות הן ל saling-lethal רצסיביות, מוטנטים הומוזיגוטיים מתים לפני שניתן להרביע אותם באופן ישיר. לכן, אנו משתמשים באסטרטגיית הרבעה סלקטיבית קלאסית של בדיקת צאצאים, אותה אנו מדגימים כאן. פיתחנו את השיטה זו במקור בעת ניסיון לבצע הקלטת time lapse של התפתחות תאי עצם אקטופיים.למרבה תסכול, תאי עצם נוספים הופיעו בו לעיתים קרובות, ולכן פעלנו לשנות את חדירות המוטציות באמצעות רבייה סלקטיבית. למרות שביצענו שיטה זו בקנה מידה של דגי זברפיש עם קו מוטנטי, ניתן להחיל אותה גם על פנוטיפים מוטנטיים אחרים של דגי זברפיש, וככל הנראה, על אורגניזמים אחרים. לאחר הכנת מלאי דגי זברפיש התחלתי לא נבחר בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בצעו טיפוס גנטי בשיטת KASP באופן הבא.הנח את רקמת הזנב של דג הזברה ב-50 µL של lysis buffer בתוך בארות של פלטת 96 בארות. הוסף 10 µL של 10 mg/mL proteinase k לכל בארה ועשה עיכול של דגימות הרקמה בטרמוסייקלר בטמפרטורה של 55 °C למשך שעתיים עד חמש שעות. לאחר מכן, בצע שלב אינאקטיבציה של 20 דקות בטמפרטורה של 94 °C.יש לשמור את תוצר הליזיס בקירור לאחר העיכול. השתמש בספקטרופוטומטר כדי לכמת את ה-DNA הגנומי. לאחר מכן, באמצעות מים בדרגת נקיות לביולוגיה מולקולרית, דלל את התבנית הגנומית כך שכל תגובה תכיל כ-20 עד 30 nanograms.הוסף על קרח 0.14 µL מתערובת הפריימרים של KASP וחמישה µL מתערובת ה-KASP master mix לכל דגימה, לתוך מבחנת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL, וערבב היטב. לאחר מכן, בצע צנטריפוגה קצרה כדי לרכז את התוכן בתחתית המבחנה. העבר באמצעות פיפטה חמישה µL מתמיסת ה-primer master mix אל בארות של פלטת PCR אופטית בעלת 96 בארות המתאימה למכשיר ה-real time PCR שבשימוש.לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפט חמישה µL של דגימות תבנית DNA מדוללות לתוך כל באער ושאיפו בעזרת פיפט כדי לערבב. הניחו מדבקת איטום שקופה אופטית על הפלטה, תוך וידוא שהסרט אטום לחלוטין על כל באער. סובבו את הפלטה בצנטריפוגה לזמן קצר ב-600 x G כדי לרכז את התוכן בתחתית ולהסיר בועות מהתערובת.לאחר ביצוע תגובת ה-KASP הראשית, יש לבחון את תרשים הפיזור שהופק על ידי מחשב הניתוח. יש להחזיק את בעלי החיים ההטרוזיגוטים שזוהו יחד במערכת המים הראשית. לאחר התאוששות בעלי החיים מקירית הסנפיר, יש להקים הצלבות זוגיות, ולהשתמש במפרידים כדי להבטיח סנכרון של העוברים.אספו את העוברים, והשאירו את זוגות ההורים מבודדים בכלובים להרבייה. עקבו אחר הבוגרים המבודדים, כדי שניתן יהיה להפריד דגים אגרסיביים או לספק להם מחסה. כדי לגדל את העוברים ביום החמישי או השישי, כאשר שלפוחי השחייה מנופחות ב-75% מהשחייה, השתמשו בפיפט זכוכית כדי לאסוף בעלי פנוטיפ מסוג בר (wild type).העבירו את הסוגים הפנוטיפיים הפראיים למשבצת הגידול, ורשמו אילו הורים הניבו אותם. לאחר הרדמה של זחלים שאינם מנפחים את שלפוחיות השחייה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו בפיפט פסטור מזכוכית בעלת פיה רחבה כדי לאסוף את בעלי החיים לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliters. הסירו את מיומי העוברים מכל שפופרה והחליפו אותם ב-one milliliter של 2%paraformaldehyde ב-1x PBS.נער את המבחנות במנער (rocker) למשך שעה אחת כדי לקבע את בעלי החיים. עקוב אחר המבחנות באופן סדיר במהלך שלב זה ובכל שלבי הניעור הבאים כדי לוודא ששום זחל לא נדבק לדופן או נצמד לתחתית המבחנה. השתמש בפיפטת זכוכית כדי להסיר את חומר הקיבוע מהמבחנות.לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של 50% ethanol. נערנו את הדגימות בתנועת נדנוד למשך 10 דקות נוספות. הכינו תמיסת צביעה טרייה על ידי הוספה של 20 µL של 0.5% alizarin red לכל 1 mL של Alcian premix.הסיר את ה-50% ethanol, והוסף מיליליטר אחד של תמיסת צביעה לכל מבחנה. לאחר מכן, הנח את המבחנות בערבול (rocking) למשך הלילה. תוך מספר ימים לאחר הלבנת העוברים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בדוק את צאצאי המוטנטים הצבועים כדי לזהות חדירות (penetrants).בדוגמה זו, אנו נותנים ציון לכל הופעה של עצם נושאת (topic bone). עבור הדור הבא, בחרו שתי משפחות עם חדירות גבוהה (high penetrants) ושתי משפחות עם חדירות נמוכה (low penetrants). העניקו לכל זוג הורים מזהה תת-מלאי, לדוגמה, משפחה 4.01, 02, וכן הלאה.מועיל גם לציין את מספר דור ה-inbred על כל התוויות. שכן את זוגות ההורים במערכת הראשית עם מספר דגי לוויה מעורבי מינים. דגי לוויה יכולים להיות כל קו של zebrafish עם תכונות מבדילות ברורות וקבועות, כגון פיגמנטציה משונתה או מבנה סנפיר שונה.סמנו את המכלים המכילים את הזחלי האחים מסוג הבר (wild type) ממשפחות נבחרות יחד עם הזחלי האחים המוטנטיים בעלי החדירות (penetrants), וגדלו את הדגים עד לבגרות באופן רגיל. רבייה סלקטיבית באמצעות בדיקת צאצאים אמורה להוביל להסטה במספר penetrants הכולל, הן כלפי מטה והן כלפי מעלה, תוך מספר דורות. בדוגמאות אלו, עבור המוטנט mef2ca b1086, נבחרה חדירות גבוהה או נמוכה של עצם אטיפי בין קרן האופרקולום לקרן הברנכיאוסטגלית במוטנטים הומוזיגוטיים קטלניים.בפרוצדורה מוצלחת של יציקה, קבוצות סוגים של דגימות התואמות לסוג הגן צריכות לזוהות על ידי תוכנת המחשב, וה-NTCs צריכות להיות ממוקמות סמוך למקור של התרשים לאחר ביצוע מספר מחזורים מספיק. כפי שמוצג כאן, צביעה מוצלחת ב-Alcian blue וב-alizarin red תניב אלמנטים של עצם וסחוס צבועים בצורה עזה שאינם שקופים או חיוורים. הגבולות של אלמנטים הסחוס צריכים להיראות חדים, וניתן יהיה להבחין בסיטוציטים בודדים.ריכוז גבוה מדי של Alcian blue מנע הפרדה ברורה מרקמות אחרות, דבר שהפך את האנליזה לבלתי אפשרית. יישום טכניקה זו במהלך תחזוקת קווי דגי zebrafish עשוי לשנות את רמת החדירות (penetrants) תוך מספר דורות. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, שיטות אחרות כגון היברידיזציית NC2 ומחקרי דימוי timelapse עשויות להניב תוצאות עקביות יותר.אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לחקור את התורשתיות של שונות הפנוטיפ. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע רבייה סלקטיבית של זני המוטינטים שלך כדי לשנות את החדירות (penetrance), גם אם המוטציה היא קטלנית.

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

דג הזברה הוא כיום כלי מבוסס ורב עוצמה למידול ניוון שרירים, מיופתיות מולדות ומחלות נוירומוסקולריות קשורות. שבירה כפולה והתנהגות בריחה מעוררת מגע הן שתי בדיקות לא פולשניות נפוצות המשמשות לקביעת מידת חוסר הארגון השרירי והפגיעה הקטרתית של עוברי דג הזברה במהלך ההתפתחות המוקדמת.

ניתוח פגמים בשרירי השלד בדג זברה זחל על ידי מבחני שבירה כפולה ותגובת בריחה מעוררת מגע

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות צורת הסחוס הקרניופציאלי באמצעות תוכנה חופשית (tpsDigs2, MorphoJ ו-PAST) למדידת שינויים במבנה הפנים של זחלי דגי זברה.

ניתוחים מורפומטריים של צורה: ארגז כלים לתוכנת ניתוח לכימות צורת קרניופנים בדגי זברה

למדו כיצד לשנות חדירות של מוטציות שלד קטלניות בדגי זברה באמצעות ריבוי סלקטיבי ומבחני צאצאים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של תסמינים גנטיים ומנגנוני פיתוח.

הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

גלה סרטונים נוספים