הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להעריך הן הזדקנות (senescence) והן תכנות מחדש (reprogramming) in vivo בשריר השלד בעקבות פגיעה ברקמה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות קריטיות בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון כיצד ניתן להגביר את הפלסטיות התאית כדי לקדם התחדשות של השריר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא אספקת שיטה מהימנה לזיהוי וכמות של תאים מזדקנים בסביבתם המקורית.

לאחרונה נקשרה הזדקנות תאים (Cell senescence) לתהליכי תיקון והתחדשות של רקמות. הבנת המנגנוים שדרכם תורמת הזדקנות לתיקון הרקמה ולהתחדשותה תהיה ללא ספק בעלת השפעה על הרפואה הרגנרטיבית. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר חקרנו את ההשפעה הפוטנציאלית של נזק רקמתי על תכנות מחדש (reprogramming) in vivo בשריר שלד.

כדי להתחיל בהליך זה, קבעו את נתיחי דגימות השריר ב-1%paraformaldehyde ו-0.2%glutaraldehyde ב-PBS למשך ארבע דקות. לאחר מכן, שטפו את הנתיחים עם PBS פעמיים, בכל פעם למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את הנתיחים עם PBS, pH 5.5 למשך 30 דקות.

בשלב הבא, דגרו את החתכים עם תמיסת ה-X-gal בחשיכה בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות לפחות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים, ובכל פעם למשך 10 דקות. לאחר מכן, בצעו קיבוע משני לשקופיות באמצעות PBS המכיל 1% paraformaldehyde למשך 30 דקות.

לבסוף, שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים. לאחר מכן, בצעו צביעה נגדית באמצעות eosin בריכוז 0.2% על ידי טבילת השקופיות בתמיסת ה-eosin למשך דקה אחת. לאחר מכן, שטפו אותן בקצרה במים מזוקקים.

הצמד את הזריקות באמצעות מדיום הצמדה מימי שאינו פלואורסצנטי. קבע את הזריקות ב-PBS המכיל 4% paraformaldehyde למשך 10 דקות. שטוף אותן עם PBS פעמיים, בכל פעם למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הוסף את תמיסת ההחדרה (permeabilization solution), והדגר למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטוף את הנסקיות עם PBS פעמיים, בכל פעם למשך חמש דקות. בשטיפה האחרונה, הוסף 200 µL של PBS, המכיל 0.25% BSA, ישירות על הנסקיות למשך חמש דקות.

דגרו את השקופיות עם הנוגדן הראשוני anti-Nanog בריכוז 1.25 micrograms per milliliter למשך לילה בטמפרטורה של 4 degrees Celsius ב-PBS המכיל 5%FBS. שטפו את השקופיות עם PBS פעמיים, בכל פעם למשך 10 דקות. בשטיפה האחרונה, השתמשו ב-200 microliters של PBS המכיל 0.25%BSA למשך חמש דקות.

לאחר מכן, דגרו את השקופיות עם 100 µL של נוגדן משני RAB-HRP מתוך ערכה מוכנה לשימוש למשך 45 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים, בכל פעם למשך חמש דקות, כדי להסיר את הנוגדן המשני. לאחר מכן, דללו DAB בבופר המצע (substrate buffer) המסופק בערכה המוכנה לשימוש.

ערבבו במערבל Vortex בעוצמה. הוסיפו 100 µL של תמיסת DAB, ישירות על כל זכוכית, והדגירו למשך מקסימום 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את תמיסת ה-DAB על ידי שטיפת הזכוכית במים.

בצעו צביעה נגדית של הנסקיות באמצעות תמיסת Fast Red למשך שתי דקות. לאחר מכן, שטפו שוב את הנסקיות במים באופן קצר. לאחר מכן, בצעו דהידרטציה באמצעות 95% ethanol למשך חמש דקות, ולאחר מכן פעמיים ב-100% ethanol, בכל פעם למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הגביהו את הפלתיות באמצעות מדיום להגבהה בעל התקשות מהירה. בחנו את הפלתיות תחת מיקרוסקופ בשדה בהיר (brightfield) בהגדלה של 20x כדי למנוע רעש רקע. בהליך זה, סרקו את הפלתיות ובחרו את שני החתכים בעלי האיכות הגבוהה ביותר בכל פלתיות, במרחק המקסימלי האפשרי זה מזה, בהתבסס על שלמות הרקמה, איכות הצביעה והצביעה הנגדית.

ספרו את התאים החיוביים ל-SA-Beta-Gal בשני החתכים הללו וחשבו את ערך הממוצע. לאחר מכן, קבעו את דירוג גודל הפיקסלים על ידי בחירה ידנית של התאים החיוביים ל-SA-Beta-Gal הקטנים ביותר והגדולים ביותר. בממשק של ImageJ, לחצו על Analyze, Tools, ROI Manager, Analyze, Set Measurement.

לאחר מכן, בחרו ב-Area. השתמשו בכלי הבחירה כדי להקיף את התאים החיוביים ל-SA-Beta-Gal הקטנים ביותר והגדולים ביותר, והוסיפו אותם ל-ROI Manager על ידי לחיצה על Add. לאחר מכן, מדדו את הגדלים באמצעות כפתור ה-Measure, ושמרו את הערכים לשימוש מאוחר יותר.

בשלב הבא, התאימו את פרמטר הסף (threshold) כדי להבטיח שכל התאים החיוביים הנראים נבחרים. המירו את התמונה לגווני אפור על ידי לחיצה על Image, Type, ולאחר מכן 8-bit. לאחר מכן, עברו ל-Image, Adjust, ו-Threshold.

הזז את הסמן השני עד שכל תאי ה-SA-Beta-Gal החיוביים מכוסים באדום, ולאחר מכן לחץ על Apply. נתח את החלקיקים על ידי לחיצה על Analyze, ואז Analyze Particles, ולאחר מכן Size והחל את הערך שהוגדר קודם לכן. הזן ב-Circularity את הערכים 0.00-1.00, ולחץ על OK. סיכום של כל החלקיקים שנספרו יוצג ב-ROI Manager.

כעת, העבירו את כל החלקיקים שנבחרו לתמונה המקורית. התאימו את הבחירה באופן ידני כדי להבטיח כימות מדויק. הוסיפו תאים חיוביים או הסירו תאים חיוביים שגויים.

לבסוף, מדדו את השטח על ידי סימון המתאר של החלק באמצעות כלי הברירה. לחצו על ROI Manager, ואז על Add, ולאחר מכן על Measure. תחת המיקרוסקופ, ספרו ידנית את התאים החיוביים ל-Nanog בשדה בהיר (brightfield) בהגדלה של 20x.

מוצגת כאן תרשים סכמטי להערכת תכנות מחדש (reprogramming) ורמת הסניסנציה (senescence) in vivo לאחר פגיעה בשריר. להלן תמונות מייצגות של צביעת SA-Beta-Gal ו-Nanog בחתכים קפואים של שריר שלד פגוע. תמונות אלו מציגות צביעת SA-Beta-Gal, עם צביעת נגד באאוזין, וצביעת Nanog, עם צביעת נגד ב-fast red.

השרירים שאינם פגועים מוצגים למעלה, בעוד שהשרירים הפגועים מוצגים למטה. גרף זה מציג את הכימות והמתאם של תאים חיוביים ל-SA-Beta-Gal ותאים חיוביים ל-Nanog בחתכים רצופים 10 ימים לאחר הפגיעה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לכלול תמיד ביקורת שלילית כדי להבטיח את ספציפיות הצביעה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע את כל השיטות, כגון אימונופלואורסצנציה ובחירה של סמני הזדקנות שונים, בכל סוגי התאים כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון הזהות התאית של התאים המזדקנים. לאחר כל פיתוח, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ההזדקנות, או תיקון והתחדשות רקמות, לבחון כיצד הזדקנות תאית יכולה לקדם פלסטיות תאית כדי להקל על תיקון והתחדשות רקמות ביונקים. לכן, לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לזהות תאים מזדקנים ותאים שעברו תכנות מחדש in vivo.