Name: הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למדו לזהות תאים זקנים ותאי גזע פלוריפוטנטיים בשריר השלד לאחר פציעה, באמצעות שיטת SA-Beta-Gal ו-Nanog. שיטה זו מאפשרת הערכה של תכנות מחדש בתוך הגוף ותורמת להבנת מנגנוני החידוש הרקמי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

. אנחנו חבים Clemire Cimper לתמיכה טכנית מעולה שלה. העבודה במעבדה של מרגשת מומן על ידי מכון פסטר, מרכז לאומי pour la רשרש מדעי, ואת סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (d'Excellence Laboratoire Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR-16-CE13-0017-01) ואת Fondation ארק (PJA 20161205028). . סיסי, איי. סי ממומנות על ידי Ph.d., פוסט דוקטורנטים מן האיחוד להחיות.

חיות שטופלו לפי הנחיות הקהילה האירופית, ועדת האתיקה של הפרוטוקולים Institut Pasteur (CETEA) אישרה.
 1. ההכנות של הפתרונות מניות <ol><li>להכין את החומרים לבניית השריר לדוגמה קיבוע. להמיס 0.5 ג'י tragacanth מסטיק עם 20 מ ל מים ב RT כדי להפוך המדיום הטבעה-הקפאה עבור שריר קיבעון.</li>
	<li>להכין את הפתרונות עבור צביעת SA-β-גל-
	<ol><li>להכין מלאי פתרונות של K 3 Fe(CN) 6 (100 מ מ), K 4 Fe(CN) 6 (100 מ מ), MgCl 2 (1 מ') על ידי המסת אבקות בהתאמה במים מזוקקים.</li>
		<li>להכין את הפתרון מניות של 0.2% C 20 H 6 Br 4 נה 2 O 5 (אאוזין) על-ידי לדלל אותה במים.</li>
		<li>להכין הפתרון מניות של C 14 H 15 BrClNO 6 (X-גל) (50 מ"ג/מ"ל) על ידי המסת אבקה X-גל ב- C 3 H 7 אין (dimethylformamide, DMF).</li>
		<li>K חנות 3 Fe(CN) 6 ו- K פתרונות 4 Fe(CN) 6-4 ° C, ו- MgCl 2-RT. 
		הערה: X-גל ניתן לאחסן ב- aliquot ב-20 ° C, עד 6 חודשים. אאוזין הפתרון יכול להיות שמרו ב RT, לאחר סינון במידת הצורך. K-3-Fe(CN)-6 K 4 Fe(CN) 6 פתרונות protectedfromthe אור בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. X-גל פתרון אינו יציב במים והוא חייב להיות מוגן מפני האור.</li>
	</ol></li> <li>הכנה של הפתרונות Nanog מכתים: הפתרון permeabilization מכיל 0.1% נה 3 ג' 6 H 5 או 7 (ציטראט trisodium), 0.1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (טריטון X-100) במים מזוקקים, אשר צריך להיות מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס. להכין את הפתרון חסימה המכילה 5% סרום שור עוברית (FBS) בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), צריך להיות מאוחסן ב- RT.</li>
</ol> 2. Staining SA-β-גל בחלק שריר TA קפוא <ol><li>להכין החומר קיבוע עבור שריר ת א על ידי הנחת כמות קטנה של tragacanth מסטיק על חתיכת פקק.</li>
	<li>עכברים נפגע משני המינים (2 בן חודש, C57/B6) נפצעו 10 ימים לפני עם cardiotoxin (CDX) כפי שתואר לעיל 13. שימוש שאינו נפגע TA (הזרקת PBS) מן העכבר זהה של הפקד שלילי. אם אין ויוו התכנות רצוי, לטפל בכל עכבר עם Dox (1 מ"ג/מ"ל) במי השתייה באותו יום (מוגן מפני האור), מיד לאחר הפציעה אקס. 
	הערה: הפתרון Dox צריך להיות שונה כל 3 ימים עבור משך הטיפול הכולל של 7 ימים.
	<ol><li>לבודד שני השרירים TA (נפגע ולשלוט) של עכברים כפי שתואר לעיל ( איור 1 א') 13. כדי להבטיח הסעיפים רוחבי, להכניס המסטיק tragacanth הגיד דיסטלי של שריר ת א ולא להשאיר בערך ¾ חלק השריר בחוץ ( איור 1B) ומקפיאים ישירות בחנקן נוזלי מקורר איזופנטאן עבור &#60; 1 הגבלת 
		הערה: ודא שלשריר ת א הוא מאונך, במרכז של הפקק. דוגמאות שניתן לאחסן ב- 80 ° C, או ישירות cryosectioned בסעיפים 10 מיקרומטר.</li>
	</ol></li> <li>לעבד את השרירים TA כפי שמתואר על איור 1B.
	<ol><li>להפיץ 1 th st-10 סעיפים בסדר הנכון על גבי עשר שקופיות שונות במיקום השמאלי העליון של כל שקופית. למקם את המקטע th 11 סמוכים במקטע st 1 בשקופית הראשונה; בסעיף ה 12 יעברו באותו סדר למקם נכון חוץ בסעיף 2 nd על שקופית ראשונה. חזור על תהליך זה עד סעיפים 10/שקופית מתקבלים עבור שקופיות עשר (סעיפים 100 סה כ) כדי להבטיח מינימום 1 מ"מ המרחק בין החלק הראשון לבין המקטע האחרון.</li>
	</ol></li> <li>לתקן את הסעיפים במשך 4 דקות ב- PBS המכיל 1% paraformaldehyde ו- 0.2% גלוטראלדהיד. לשטוף עם PBS, 2 x 10 דקות. בשלב הבא, דגירה בסעיפים PBS (ה-pH = 5.5) במשך 30 דקות לבצע את כל השלבים ב RT. 
	הערה: הקיבעון חייב להיות מתון כדי לשמור על פעילות אנזימטיות. לבצע שלב זה מתחת למכסה המנוע. ה-pH של מגניב הוא קריטי, הפתרון X-גל חייב להיות מוגן מפני האור.</li>
	<li>Incubate במקטעים המכילים X-גל פתרון: 4 מ מ K3Fe(CN) 6, 4 מ מ K4Fe(CN) 6, 2 מ מ MgCl2 ו 400 µg/mL X-גל ב- PBS, pH = 5.5. דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 24h. לשטוף את השקופיות עם PBS, 3 x 10 דקות, ב- RT. 
	הערה: הדגירה דורש מינימום של 24 שעות ביממה, יכול להימשך למשך 48 שעות על מנת למקסם את האות SA-β-גל. הפתרון צריך להיות שונה לאחר 24 שעות של דגירה. השקופיות צריכים להיות מוגנים מפני אור. אם רק מכתימה SA-β-גל היא הרצויה, המשך לשלב 2.5. אם צביעת במשותף עם Nanog רצוי, אנא דלג קדימה לשלב 3.1.</li>
	Paraformaldehyde <li>תיקון שקופיות 1% ב- PBS במשך 30 דקות לשטוף שקופיות עם PBS, 3 x 10 מינימלית Counterstain עם 0.2% אאוזין. לטבול את השקופיות הפתרון אאוזין עבור 1 דקות ולשטוף אותם עם מים מזוקקים בקצרה. לבסוף, לטעון את השקופיות מימית-שאינם-ואזוריט הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים). 
	הערה: זה חיוני לבצע את קיבוע שאחרי. לבצע שלב זה מתחת למכסה המנוע. כל הפעולות מבוצעות ב- RT.</li>
</ol> 3. אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן Anti-Nanog <ol><li>לתקן את השקופיות עם PBS המכיל 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות לשטוף עם PBS, 2 x 10 דק להוסיף 200 µL של הפתרון permeabilization ישירות על השקופיות, תקופת דגירה של 5 דקות. <ol><li>שטיפת שקופיות עם PBS, 2 x 5 דקות, בכביסה האחרונה, השימוש 200 µL PBS המכיל 0.25% BSA ישירות על השקופיות. ביצוע כל הצעדים הללו-RT. 
		התראה: בצע את שלב קיבוע מתחת למכסה המנוע.</li>
	</ol></li> <li>Incubate שקופיות עם נוגדן נגד ראשי-Nanog (ריכוז סופי: 1.25 ug/mL) לילה ב 4 ° C ב- PBS המכילה 5% FBS. שקופיות עם PBS, 2 x 10 דקות וקונטה בכביסה האחרונה, השימוש 200 µL PBS המכיל BSA 0.25% עבור 5 דק. בצע כל הכביסה מדרגות בכל RT. 
	הערה: דגירה שקופיות בתוך קופסה עם מגבת נייר רטובה כדי למנוע אידוי.</li>
	שקופיות <li>Incubate עם µL 100 של נוגדנים משניים ראב-HRP מ מוכן לשימוש קיט (ראה טבלה של חומרים) במשך 45 דקות לשטוף שקופיות עם PBS, 3 x 5 דק ', כדי להסיר נוגדנים משניים. לבצע את כל השלבים ב RT עם הגנה מפני האור.</li>
	<li>ויזואליזציה <ol><li>תחילה, לדלל את 3,3 &#39;-diaminobenzidine (ג 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), כי אמחה קלות) במאגר המצע מסופקים על ידי מוכן להשתמש ערכת (20 µL של DAB עבור 1 מ"ל של המצע בופר). להוסיף 100 µL של פתרון DAB ישירות על גבי כל שקופית ולאחר תקופת דגירה של לכל היותר 10 דקות ב- RT. 
		הערה: הפתרון מדולל DAB צריך להיות מוכן טרי, ניתן לאחסן עד שבוע ב 4 º C. זמן הדגירה יכול להיות מותאם כדי למזער את האות רקע אבל חייב להישמר זהה עבור כל השקופיות.</li>
		<li>להסיר הפתרון DAB על ידי שטיפה עם מים. Counterstain השקופיות עם פתרון מהיר אדום (מוכן להשתמש, ראה את הטבלה של חומרים) במשך 20 דקות לשטוף את השקופיות עם מים שוב בקצרה.</li>
		<li>מייבשים אותם עם אתנול 95% עבור 5 מ'ואחריו 100% אתנול, 2 x 5 דקות. לבסוף, לטעון את השקופיות הקשחת מהיר הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>לצפות בשקופיות במיקרוסקופ בשדה בהיר בגיל 20 X כדי להימנע רקע. 
		הערה: פתרון מהיר אדום יכול להיות שמרו ב RT ומשמש מחדש לאחר סינון.</li>
	</ol></li></ol> 4. ניתוח, כימות <ol><li>SA-β-גל כמת <ol><li>סרוק את השקופיות ובחרו הסעיפים הכי טוב בכל שקופית המבוסס על תמונות נרכשות. להשתמש לפחות 2 סעיפים/ת א עבור כימות. לשפוט את המקטע &#39; s איכות המבוססת על רקמות תקינות, איכות של צביעת, ו counterstaining. עבור כימות, לבחור בין שני המקטעים באיכות הגבוהה ביותר עם המרחק אפשרי המקסימלי בין דגימות, אשר מאפשר ייצוג טוב יותר של SA-β-גל כימות לאורך כל השריר TA-</li>
		<li>כימות של SA-β-גל חיובי תאים ( איור 2).
		<ol><li>לקבוע הדירוג של גודל פיקסל על-ידי בחירה ידנית הקטן ביותר, את התאים SA-β-גל חיובי הגדול.
			<ol><li>פתחו את התמונה הדיגיטלית של השקופית סריקה באמצעות תוכנת ImageJ.</li>
				<li>הממשק, לחץ על &#39; ניתוח &#39; &#62; &#39; כלי &#39; &#62; &#39; רועי מנהל &#39; &#62; &#39; ניתוח &#39; &#62; &#39; קבע מדידה &#39; &#62; &#39; בחר אזור &#39;. השתמש בכלי בחירה ולהקיף הקטן ביותר ואת הכי חיובי SA-β-גל תא ולהוסיף אותו למנהל רועי על ידי לחיצה על &#39; הוסף &#39;. למדוד את גודל באמצעות &#39; מידה &#39; כפתור ולשמור את הערכים לשימוש מאוחר יותר.</li>
			</ol></li> <li>להתאים את הפרמטר סף כדי להבטיח כל התאים הגלויים חיובי נבחרו.
			<ol><li>להמיר התמונה סולם אפור על ידי לחיצה &#39; תמונות &#39; &#62; &#39; סוג &#39; &#62; &#39; 8 סיביות &#39; ( איור 2 א). בשלב הבא, ללכת &#39; תמונות &#39; &#62; &#39; התאם &#39; &#62; &#39; סף &#39;, להזיז את הסמן השני עד כל התאים SA-β-גל חיובי מכוסים בצבע אדום ( איור 2B) ולאחר מכן לחץ &#39; החל &#39;.</li>
				<li>ניתוח חלקיקים על-ידי לחיצה &#39; נתח &#39; &#62; &#39; חלקיקים לנתח &#39; &#62; &#39; גודל (פיקסל ^ 2) &#39;, והחלת את הערך המוגדר בשלב 4.1.2.1, הזן &#39; מעגליות &#39;: &#39; 0.00 1.00 &#39;, לחץ על &#39; בסדר &#39;; סיכום של כל מה חלקיקים שנספרו מוצג במנהל ROI ( איור דו-ממדי).</li>
			</ol></li> <li>להעביר את כל החלקיקים שנבחרו לתמונה המקורית. להתאים את הבחירה באופן ידני כדי להבטיח כימות מדויק. הוסף תאים חיוביים (חץ ירוק, איור 2E) ו/או להסיר תאים חיובי כוזב (חץ אדום, 2E איור). לבסוף, למדוד את השטח על ידי חלוקה לרמות באמצעות סעיף ( איור דו-ממדי) &#39; הכלי בחירה &#39;. לחץ על &#39; רועי מנהל &#39; &#62; &#39; הוסף &#39; &#62; &#39; מידה &#39;.</li>
			<li>חשוב, לנרמל את מספר התאים חיובי על-ידי האזור של המקטע.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog כמת <ol><li>לספור את התאים Nanog חיובי תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באופן ידני בהגדלה X 20- 
		הערה: counterstaining מהר אדום מאפשר הערכה טובה של המורפולוגיה של שריר ת א. עם זאת, ההכתמה קלילה מאוד, חסר מתווה ברור של המקטע. הסורק לעיתים קרובות לא יצליח לזהות את הגבול של הסעיפים, לא יכול להתמקד כראוי. זה אפשרי להשתמש סמן בעיגול את הקצוות של הסעיפים לפני סריקה או להשתמש בסורק רגיש יותר לזהות את המקטע. עבור פרוטוקול הנוכחי, זה היעילה לספור את התאים חיובי Nanog באופן ידני.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype%3A+the+dark+side+of+tumor+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li>
<li>Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+turnover+of+senescent+cells+during+regeneration+of+a+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+senescent+cells+in+optimal+wound+healing+through+secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Mosteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+and+senescence+provide+critical+signals+for+cellular+reprogramming+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo.</a> Science. 354 (6315), (2016).</li>
<li>Chiche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-Induced+Senescence+Enables+In+Vivo+Reprogramming+in+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li>
<li>Ritschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype+induces+cellular+plasticity+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration.</a> Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).</li>
<li>Abad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+in+vivo+produces+teratomas+and+iPS+cells+with+totipotency+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features.</a> Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).</li>
<li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li>
<li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Acute+Skeletal+Muscle+Regeneration+by+Cardiotoxin+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+is+required+to+prevent+p53-dependent+senescence+following+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury.</a> Nat Commun. 6, 8528(2015).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li>
<li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li>
<li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SA+beta+Gal+staining%3A+biomarker+or+delusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כאן, אנו מציגים שיטה לאתר את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד של עכברים reprogrammable. ניתן להשתמש בשיטה זו להעריך לכמת בשני הזדקנות ביולוגית, זירוז פלסטיות הסלולר ויווושל לבחון את התפקיד של הזדקנות ביולוגית של רקמות תיקון והתחדשות.
בפרוטוקול הנוכחי, וזמינותו הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל) משמש כדי לזהות ויוו senescent התאים בשריר השלד. Assay זו מזהה את פעילות מוגברת lysosomal β-galactosidase ב- pH suboptimum (6.0 או 5.5), הקשורים באופן ספציפי ...

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא צורה של התגובה לעקה מאופיין על ידי מעצר יציב של מחזור התא. בעשור האחרון, מחקר הקימה בחוזקה הזדקנות ביולוגית מזוהה עם תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים שונים כולל התפתחות, פיברוזיס של האורגניזם בתהליך ההזדקנות1,2. הזדקנות ביולוגית הסלולר זוהה לראשונה ב fibroblasts האנושי בסוף על תוחלת החיים שלהם replicative המופעלות על-ידי טלומר קיצור3. מלבד הלחץ replicative, ישנם הרבה גירויים אחרים, זה יכול לגרום הזדקנות ביולוגית, כולל ה-DNA נזק, סטרס חמצוני, אותות oncogenic גנומית/epigenomic תיקונים קטנים, שכל אחד מהם יכול בסופו של דבר להפעיל המסלולים p53/p21 ו/או pRB כדי לבסס ולחזק את מעצרו של צמיחה קבוע1. אחד המאפיינים החשובים של תאים senescent הוא שהם נשארים פעילים סמויה ו robustly אקספרס (SASP) הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה: הפרשת ציטוקינים דלקתיים רבים, גורמי גדילה ו מטריצה חוץ-תאית גורמים4. גורמים SASP הוצעו כדי לשחק תפקיד חשוב תיווכה ותגביר את אפקט הזדקנות ביולוגית, בגלל השפעתם חזק על משיכת תאים חיסוניים ושינוי המקומי ומערכתית רקמת milieus1. מעניין, הזדקנות ביולוגית הוצע לאחרונה להיות חשובה עבור רקמות תיקון והתחדשות5,6. בנוסף, נתונים מספר מעבדות, כולל שלנו, הציע כי רקמת נזק-induced הזדקנות ביולוגית יכול להגביר פלסטיות סלולרית, באמצעות SASPs, כדי לקדם התחדשות7–9. לכן, כל הנתונים המתעוררים להדגיש את החשיבות של לימוד הזדקנות ביולוגית בתוך vivo.
בעידן פוסט pluripotent המושרה תא גזע (iPSC) פלסטיות הסלולר הוא הקיבולת של תא לרכוש זהות חדשה, לאמץ מגורל חלופי כאשר הם נחשפים לגירויים שונים ב- תרבות, אין ויוו10. זה ידוע כי התכנות מלאה יכולה להיות מושגת ויוו11,12, שבו הביטוי בקלטת המכיל ארבעה גורמים יאמאנאקה: Oct4, Sox2, Klf4ו- c-Myc (OSKM) יכול להיות מושרה ויוו לקדם היווצרות teratomas באיברים רבים. לכן, מודל העכבר reprogrammable (i4F) יכול לשמש מערכת חזקה כדי לזהות הרגולטורים קריטי מסלולים חשובים עבור הסלולר פלסטיות11.
מערכת מתאימה ורגיש ויוו הכרחי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מסדיר פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. כאן, אנו מציגים מערכת איתנה, פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את הקשר בין הזדקנות ביולוגית פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. הנזק שריר שילוב של cardiotoxin (אקס) המושרה בקבוצה השריר השוקתי הקדמי (TA), מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות, המודל העכבר i4F, מאפשר הזיהוי של הזדקנות ביולוגית הסלולר והן vivo התכנות במהלך התחדשות השרירים.
כדי להעריך את הקשר בין הסלולר פלסטיות הזדקנות ביולוגית, עכברים i4F נפגע עם אקס כדי לגרום לנזק חריפה הינם מטופלים עם דוקסיציקלין (0.2 מ"ג/מ"ל) במשך 7 ימים כדי לגרום ויוו התכנות. אמנם אקס המושרה לנזק חריפה התחדשות פרוטוקול כבר שפורסמו לאחרונה13, מסיבות מוסריות, הליך זה יושמט בפרוטוקול הנוכחי. TA שריר מדגמים ייאספו בגיל 10 ימים שלאחר פגיעה13, כאשר השיא של תאים senescent בעבר נצפו14. . הנה, פרוטוקול מפורט זה מתאר את כל הצעדים הדרושים כדי להעריך את רמת הזדקנות ביולוגית (דרך SA-β-גל) ואת התיכנות (דרך IHC צביעת של Nanog).
הזדקנות ביולוגית-הקשורים בטא-galactosidase (SA-β-גל) וזמינותו היא וזמינותו הנפוצות ביותר לזהות senescent התאים שניכם תרבות, אין ויוו15. לעומת מבחני אחרים, וזמינותו SA-β-גל מאפשר הזיהוי של התאים senescent בסביבה הטבעית שלהם האדריכלות רקמות ללא פגע, אשר חשוב במיוחד למחקר ויוו . יתר על כן, זה אפשרי זוג וזמינותו SA-β-גל עם סמנים אחרים באמצעות IHC. עם זאת, וזמינותו SA-β-גל לדרוש את דגימות טרי או קפוא, הנשאר מגבלה עיקרית. כאשר רקמות טרי או קפוא זמינות באופן שגרתי, כגון דגימות שריר ת א קפואים, SA-β-גל היא כמובן וזמינותו המתאימים ביותר כדי לזהות תאים senescent. Nanog הוא הסמן להשתמש כדי לזהות תאים reprogramed משתי סיבות: 1) זה סמן חיוני עבור pluripotency; 2) ויותר חשוב, הביטוי שלה לא מונעת על ידי דוקסיציקלין (dox), ולכן הוא מזהה pluripotency המושרה במקום הביטוי כפויה בקלטת יאמאנאקה.
חשוב לציין, הפרוטוקולים מכתימים שהוצגו במחקר זה יכול להתבצע בנפרד כדי לפשט את ההליך כמת, אך ניתן לבצע גם הליך שיתוף מכתימים כדי להמחיש את שניהם senescent, גזע pluripotent על אותו סעיף.

<table><tbody><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>עבור SA-&BETA; תמיסת צביעת גל</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>עבור SA-&BETA; תמיסת צביעה</td></tr><tr><td>גל MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>עבור SA-&BETA; תמיסת צביעה</td></tr><tr><td>גל X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>עבור SA-& beta; תמיסת צביעת גל</td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>סיגמא</td><td>D3447</td><td>להשראת תכנות מחדש in vivo</td></tr><tr><td>קרדיוטוקסין</td><td>לוטקסאן ואלנס, צרפת</td><td>L8102</td><td>לפציעת שרירים</td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>111-30-8</td><td>לתמיסת קיבוע</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>מדע מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>50-980-487</td><td>לתמיסת</td></tr> <tr><td>קיבועNaCitrate : נתרן ציטראט monobasic bioxtra, anhydre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>לתמיסת פרמביליזציה</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>לתמיסת פרמיביליזציה</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A3608</td><td>תמיסת כביסה</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-ננוג</td><td>איתות תאים</td><td>8822S ערכות</td><td>נוגדן חד שבטי ארנב</td></tr><tr><td>EnVision+ (HRP. ארנב. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>לגילוי Nanog</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td> <td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Fast</td><td>Red Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td>פתרון הרכבה</td></tr> אמצעי <tr><td>הרכבה מתקשה מהיר למיקרוסקופיה: Eukitt&reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>פתרון הרכבה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה Brightfield CKX41: 10X-20X-40X מטרות</td><td>אולימפוס</td><td>CKX41</td><td>לכימות ננוג</td></tr><tr><td>עכבר: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>מודל עכבר הניתן לתכנות מחדש</td></tr><tr><td>שריר השלד, סורק</td> שקופיות קדמי <td></td><td></td><td></td>טיביאליס</tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>סריקת שקופיות</td></tr></tbody></table>

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, in vivo התכנות בשריר השלד

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא תגובה מתח זה מאופיין על ידי מעצר צמיחה סלולרי יציב, וזה חשוב עבור תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון סרטן, הזדקנות. לאחרונה, הזדקנות ביולוגית גם היה מעורב רקמות תיקון והתחדשות. לכן, זה הפך קריטי יותר ויותר לזהות תאים senescent ויוו. הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל) assay הוא הבדיקה הנפוצה ביותר לזהות תאים senescent הן בתרבות והן ויוו. Assay הזה מבוסס על התכנים lysosomal מוגבר תאים senescent, מה שמאפשר זיהוי פתולוגיה lysosomal β-galactosidase פעילות ב- pH suboptimum (6 או 5.5). לעומת מבחני אחרים, כגון cytometry זרימה, זה מאפשר הזיהוי של תאים senescent בסביבתם תושב, המציע מידע בעל ערך כגון מיקום הנוגעים הארכיטקטורה רקמות, המורפולוגיה, ו האפשרות של צימוד עם סמנים אחרים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC). המגבלה העיקרית של SA-β-גל וזמינותו היא הדרישה של דגימות טרי או קפוא.
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מקדמת הסלולר פלסטיות ורקמות התחדשות בתוך vivo. אנו משתמשים SA-β-גל כדי לזהות תאים senescent בשריר השלד על פגיעה, אשר היא מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות. יתר על כן, אנו משתמשים IHC כדי לזהות Nanog, סמן של תאי גזע pluripotent, במודל של עכברים מהונדס. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבחון ולכמת הזדקנות ביולוגית הסלולר בהקשר של פלסטיות הסלולר המושרה ואת ויוו התכנות.

גילוי שריר הנוצרות על-ידי פגיעה הסלולר הזדקנות ביולוגית
זה לאחרונה הוכח כי פגיעה בשריר גורם הזדקנות ביולוגית הסלולר ארעי14. ב- 10 ימים לאחר פציעה (DPI), רוב myofibers פגום הם עוברים תהליך התחדשות עם גרעינים במיקום מרכזי, סימן היכר של רגנרציה myofibers, ואת הארכיטקטורה של השריר נוצרת מחדש. תאים דלקתיים infiltrating מופחתים באופן דרמטי תוך שמירה על גלוי באזורים מסוימים. 10 DPI מהווה נקודת זמן טוב לזהות תאים se...

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד על פגיעה תוך גרימת ויוו התכנות. שיטה זו מתאימה להעריך את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר במהלך התחדשות רקמות, התכנות ויוו.

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להעריך הן הזדקנות (senescence) והן תכנות מחדש (reprogramming) in vivo בשריר השלד בעקבות פגיעה ברקמה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות קריטיות בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון כיצד ניתן להגביר את הפלסטיות התאית כדי לקדם התחדשות של השריר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא אספקת שיטה מהימנה לזיהוי וכמות של תאים מזדקנים בסביבתם המקורית.לאחרונה נקשרה הזדקנות תאים (Cell senescence) לתהליכי תיקון והתחדשות של רקמות. הבנת המנגנוים שדרכם תורמת הזדקנות לתיקון הרקמה ולהתחדשותה תהיה ללא ספק בעלת השפעה על הרפואה הרגנרטיבית. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר חקרנו את ההשפעה הפוטנציאלית של נזק רקמתי על תכנות מחדש (reprogramming) in vivo בשריר שלד.כדי להתחיל בהליך זה, קבעו את נתיחי דגימות השריר ב-1%paraformaldehyde ו-0.2%glutaraldehyde ב-PBS למשך ארבע דקות. לאחר מכן, שטפו את הנתיחים עם PBS פעמיים, בכל פעם למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את הנתיחים עם PBS, pH 5.5 למשך 30 דקות.בשלב הבא, דגרו את החתכים עם תמיסת ה-X-gal בחשיכה בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות לפחות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים, ובכל פעם למשך 10 דקות. לאחר מכן, בצעו קיבוע משני לשקופיות באמצעות PBS המכיל 1% paraformaldehyde למשך 30 דקות.לבסוף, שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים. לאחר מכן, בצע

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב C. elegans

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה, לשחזור ופשוטה של ​​בידוד והתרבות של ובתאים myoblast מן שרירי השלד של מבוגרים וישישים. השרירים המשמשים כאן כוללים שרירי כף הרגל והרגל. גישה זו מאפשרת הבידוד של אוכלוסייה מועשרת של myoblasts העיקרי ללימודים תפקודיים.

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

אנו מתארים טכניקה ניסיוני הרומן נקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME), אשר מבוססת על ראיות כי רקמת שריר השלד מכיל תאים myogenic קיימא יכול להקל על התורם-תאית myogenesis כאשר מושתל לתוך שריר המארח.

שריר פולשנית הטבעה (MIME) - טכניקה ניסיוני הרומן כדי להקל על Myogenesis התורם-תאית

מדידה של הפונקציה כויץ מכרסמים שרירי השלד הוא כלי שימושי, יכול לשמש כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה, כמו גם היעילות של התערבות טיפולית. נתאר כאן את פולשני, אין ויוו ההערכה של השרירים dorsiflexor שיכול לחזור לאורך זמן העכבר באותו.

הערכה בלתי פולשני של תפקוד השרירים Dorsiflexor בעכברים

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

בפרוטוקול זה מתוארת שיטת ניתוח מבחנה וניתוח תפקודי לתאי גזע שריריים, המשמרת את רוב האינטראקציות שלהם עם הנישה האנדוגנית שלהם.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

שרירי השלד מורכבים ממספר סוגי תאים, כולל תאי גזע תושבים, שלכל אחד מהם תרומה מיוחדת להומאוסטזיס והתחדשות שרירים. כאן מתוארת התרבית הדו-ממדית של תאי גזע שריריים ונישת תאי השריר בסביבה ex vivo המשמרת רבים מהמאפיינים הפיזיולוגיים, in vivo וסביבתיים.

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

מטרת פרוטוקול זה היא לבסס מודל פיברוזיס שרירי הפנים. השוואת ההיסטולוגיה בין מעסה עכברים לשריר הקדמי טיביאליס לאחר פציעה קפואה אישרה פיברוזיס שריר המעסה. מודל זה יאפשר חקירה נוספת של המנגנון העומד בבסיס פיברוזיס שריר הפנים.

פציעת הקפאה בשריר המסה של עכבר להקמת מודל פיברוזיס שריר הלסת

למדו לזהות תאים זקנים ותאי גזע פלוריפוטנטיים בשריר השלד לאחר פציעה, באמצעות שיטת SA-Beta-Gal ו-Nanog. שיטה זו מאפשרת הערכה של תכנות מחדש בתוך הגוף ותורמת להבנת מנגנוני החידוש הרקמי.

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

גלה סרטונים נוספים