Name: כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: למד כיצד לכמת רמות טעינה של tRNA בחיידקי Escherichia coli בצמיחה שונה. שיטה זו מאפשרת השוואה כמותית מדויקת של רמות RNA בין מצבי צמיחה שונים באמצעות תאי spike-in.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים מרית Warrer על סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הטבע [1323-00343B], קרן המחקר הלאומי הדני [DNRF120].

<ol><li>Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li>
<li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%28%2B%29+and+Rel%28-%29+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
<li>Krüger, M. K., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li>
<li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li>
<li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li>
<li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li>
<li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global%2C+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302(2015).</li>
<li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li>
<li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+codon+bias%3A+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li>
<li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+%28Asn%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li>
<li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation%3A+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li>
<li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).</li>
<li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li>
<li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0926655062903456">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li>
<li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li>
<li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21460796">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li>
<li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+medium+for+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).</li>
<li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד בו זמנית את רמת הטעינה ספציפי e. coli tRNAs ולהשוות רמות היחסי של tRNAs בדגימות שונות. נקודות קריטיות של הפרוטוקול הם 1) להתמודד עם הדגימות בצורה כזאת, כי רמת טעינה סלולארית tRNA נשמרות, 2) לנרמל את סינתזת כמויות כך שניתן יהיה להשוות בצורה אמינה רמות היחסי tRNA בדגימות שונות, ו- 3) על מנת להבטיח את sp ecificity של הגששים שנבחר עבור tRNAs עניין. נקודות אלה מופנים בנפרד למטה.
tRNA טיהור
TRNAs כבר טהור של e. coli בצורה עדינה מ...

הבאות, אנו מציגים שיטה לכימות tRNAs ספציפיים, מדידת הטעינה שלהם רמות על ידי סופג בצפון '. השיטה מבוססת על טכניקה שפותחה על ידי. Varshney et al. 1. מאת קציר תאים לתוך חומצת חומץ טריכלור (TCA) ולשמור את הדגימות ב-0 מעלות צלזיוס במהלך הטיהור RNA, אסתר הקשר בין של tRNA, חומצת אמינו ביותר הוא שנשמרת2,3,4. Aminoacylated tRNAs ניתן להבדיל בין המקבילים nonacylated על ידי אלקטרופורזה בג'ל סופג בצפון, בשל ניידות ירידה של aminoacylated סינתזת הג'ל, הנגרמת על ידי חומצת אמינו מאוגד covalently5. בנוסף, אנו מציגים עבור נרמול tRNA כמויות על ידי תוספת של ספייק תאים overexpressingselC tRNA נדירות 4פרוטוקול.
tRNAs הם חלק המולקולות הנפוץ ביותר של התא חיידקי לבין תפקיד חיוני ביותר של מכונות תרגום. tRNAs לאגד חומצות אמינו ומעבירים אותם אל הריבוזומים התרגום. הכריכה של חומצות אמינו כדי tRNAs (aminoacylation או טעינה) בהנחייתם של aminoacyl tRNA synthetases. שפע יחסי של tRNAs טעון שונים חשוב להבטחת נאמנותם של סינתזת חלבונים, כי underrepresentation של cognate טעונה ש-trna עבור codon RNA שליח נתון (mRNA) מגבירה את הסבירות tRNA בקרבת מקום ל- cognate בטעות לספק שלו חומצת אמינו פוליפפטיד גוברת על הריבוזום6. החשיבות של tRNA טעונה באה לידי ביטוי נרחב התגובה של תא החיידק ירידה חמורה ברמות טעינה של tRNA; התגובה מחמירים. במהלך התגובה מחמירים הסינתזה של tRNAs, ribosomal RNAs mRNAs רוב הוא הוריד לטובת שעתוק של mRNAs ספציפיים הקשורים ההישרדות ביוסינטזה ומתח חומצת אמינו, קצב גדילת התאים היא יורדת באופן דרמטי7 . יתר על כן, עבודה על-ידי, ואחרים הראו כי e. coli פעיל מבזה הרוב המכריע של tRNA שלה בתגובה מדגיש כי להגביל תרגום4,8, רומז כי ייתכן ההתאמה של רמות tRNA חשוב להתמודדות עם לחצים כזה. לפיכך, אמין מדידות של רמות tRNA abundances וטעינה יהיה כלי חשוב להבנת מלא תגובות הלחץ חיידקי.
E. coli הוא נפוץ לבטא חלבון רקומביננטי, עקב הבדלים השימוש codon בין המינים, שיוצרת הביטוי הוא בעיה בפני9. זה אוכל מצויין הביטוי של tRNAs נוספים הדרושים כדי לתרגם את ה-mRNA רקומביננטי10. מדידות של tRNA טעינה רמות זנים כאלה יכול להנחות המאמצים לפתרון בעיות ולעזור למטב את ביטוי חלבון.
שיטה זו גם מאפשרת הגילוי של "mischarging"; מולקולת tRNA aminoacylated חומצה אמינו בלתי-cognate. Aminoacylation על ידי חומצות אמינו שונות עלולה לגרום של tRNA להעברת במהירויות שונות במקצת דרך לזיהוי ג'לים1,11. במקרים מסוימים, השיטה יכולה לשמש גם כדי להבחין בין דפוסי השינוי שונה על tRNAs אחרת זהה3.
עוד הקים הליך הביוכימי עבור החקירה של tRNA טעינה רמות הוא periodate חמצון. השיטה מסתמכת על התצפית כי aminoacylated tRNA מוגן מפני periodate חמצון ואינו tRNA לא טעונים. אחרי periodate חמצון טיפול לחידוש tRNA משמש להערכת רמת הטעינה הרנ א שנקטפו. עם זאת, לחידוש מספר tRNAs הוכח להיות מושפעות הטיפול ובכך לספק כמה דיוקים12. השיטה המוצגת כאן אמצעים טעינה ישירות מ- RNA מטוהרים, ובכך לא כולל שום הטיות של תגובות כימיות או אנזימטיות. מגבלה אחת של שיטה זו היא ובדיו tRNA אחד בלבד מזוהה בכל פעם, כך למרות הצפוני אותו כתם יכול להיות חשוף reprobed עבור tRNAs מרובות, זה במידת מה ההגדרה המפורטת לאסוף נתונים על tRNAs רבים.
דרך אמינה של נורמליזציה דוגמאות לשני חיוני בלימודי שבו המטרה היא להשוות בין רמות היחסי של מולקולה מדגמים שונים. כאן נסקור תהליך הנורמליזציה של רנ א שבו aliquot קטן של תאים e. coli overexpressing את סינתזת נדירselC נוסף של ספייק-in כל הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA. שיטה זו שימושית לא רק בעת בחינת tRNAs אך על כימות היחסי של כל המינים של RNA כאשר הגדרת הניסוי הוא כזה כי אין RNA אנדוגני ניתן לבטוח יהיה להציג ריכוז הסלולר זהה כל הדגימות. לדוגמה, הרמה של "משק", כמו ה-RNA ribosomal RNA משמשת לעתים קרובות כמו הפניה אנדוגני להשוות כמויות יחסיות של RNA אחר בין שונים דוגמאות13. אבל זה לא ממש עוזר אם ריכוז RNA הפניה הסלולר משתנה בין דגימות, יכול להיות המקרה ribosomal RNA אם הדגימה מתרחשת במהלך16,17 15,התגובה מתח או במהלך כניסתו נייחים שלב17. התוספת של ספייק תאים כדי הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA מספק דרך מלא ומדויק של נרמול עצמאית של ההתקנה הדגימה. דרך נוספת של סטנדרטיזציה היא התוספת של אחד או יותר בספייק RNAs כדי הדגימות ניסיוני לאחר טיהור RNA. עם זאת, שיטה זו לא בחשבון ההבדלים ב RNA שחזור בין הדגימות.
באמצעות תאים e. coli overexpress את ההפניה RNA כמו ספייק תאים (ראה איור 1) בניסוי ב e. coli הוא החיסרון שנוצר זה בנוסף של כמות קטנה של אקסוגני e. coli סה כ RNA ל דוגמאות. אנחנו תקן עבור תוספת זו על-ידי ניתוח מדגם המכיל רק ספייק תאים במקביל הדגימות ניסיוני (ראה הצפוני כתם במסלול איור 2, עם התווית "selC"). פרוטוקול הציג זה פותח עבור e. coli K-12 אך צפוי להיות ישימים עבור רוב המינים חיידקי.

<table><tbody><tr><td>אוריאה</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>טוהר >99%</td></tr> <tr><td>פוליאקרילאמיד</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>Bis (N,N'-מתילן-ביס-אקרילאמיד)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית (TCA)</td><td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריס</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה</td><td></td><td></td><td></td>הידרוכלורית</tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הרינג זרע</td><td>DNA סיגמא</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוליוויניל פירולידון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיקול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32 וגמא; ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos (בדיקות)</td><td>TAG קופנהגן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+ ממברנה</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroblotter</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טייפון FLA 7000 סורק</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תנור</td><td></td><td></td><td></td>הידרידיזציה</tr><tr><td>Geiger-M&uuml; ller tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זרחן הדמיית מסך</td><td></td> GE Healthcare <td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization צינור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרבות צלוחיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות</td><td></td><td></td><td></td>מיקרוצנטריפוגה</tr><tr><td>20 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

כימות של רמות של rnas העברה ב- escherichia coli השפע וטעינה

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

רנ א העברה (tRNA) היא חלק חיוני של מכונות translational ב מכל יצור. tRNAs לאגד, להעביר חומצות אמינו הריבוזום התרגום. רמות היחסי של tRNAs שונים, ואת היחס בין aminoacylated tRNA ל tRNA סה כ, המכונה רמת הטעינה, הם גורמים חשובים בקביעת את הדיוק ואת המהירות של תרגום. לכן, השפע ואת רמות טעינה של tRNAs הם משתנים חשובים כדי למדוד כשלמדתי סינתזה של חלבון, לדוגמה בתנאים מתח שונים. כאן, אנו מתארים שיטה קציר tRNA ומדידת ישירות את השפע היחסי והן לרמה טעינה המוחלטת של מינים tRNA ספציפי של Escherichia coli. סינתזת האיסוף-כך הקשר יציב בין סינתזת של חומצת אמינו שלה נשמר. ה-RNA ואז נענשים בג'ל, צפון סופג, שתוצאתה הפרדה tRNAs טעון, לא טעונים. ניתן להשוות את הרמות של tRNAs ספציפיים בדגימות שונות בשל התוספת של ספייק תאים עבור נרמול. לפני טיהור RNA, נוסיף 5% של תאים e. coli תאגידי ענק בינלאומיים tRNAselC נדירים כדי כל דגימה. כמות המינים tRNA עניין במדגם ואז מנורמל לסכום של tRNAselC במדגם זהה. תוספת של ספייק תאים לפני טיהור RNA יש היתרון על תוספת של מטוהרים ספייק-in RNAs זה הוא גם מהווה ההבדלים יעילות פירוק התא בין הדגימות.

באמצעות ההליך המתואר כאן, השפע וטעינה רמות של tRNAs שלושה נמדדו ב e. coli K-12 לפני ובמהלך חומצת אמינו הרעבה.
Auxotroph ארגינין זן NF9154 (חמישי leu שלו טוב thi mtl supE44) הוא גודל לפחות עשרה דורות במדיום מינימלי MOPS בתוספת גליצרול 0.4% 50 תראונין µg/mL, לאוצין, ארגינין, µg 5/mL היסטידין ב 37 מעלות צלזיוס רועדת 160 סיבובים לדקה. ארגינין הרעבה הוצג על-ידי סינון של התרבות, resuspension ט...

כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לכמת את השפע ורמות הטעינה של RNA העברה ב-Escherichia coli. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא כגון, כיצד רמות טעינת tRNA משתנות במצבי גידול שונים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שניתן להשוות כמותית את רמות הרנ"א גם בין מצבי גידול המשנים באופן דרסטי את הרכב הרנ"א בתאים.התחל את הניסוי הזה על ידי גידול תרביות E.coli ניסיוניות ועלייה חדה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. גדל את תרבית הספייק אין ב-37 מעלות צלזיוס, תוך טלטול ב-160 סל"ד. כאשר תרבית הספייק אין הגיעה ל-OD436 של כ-0.1, גרמו לביטוי של תא tRNA C על ידי הוספת IPTG.גדל את התרבות עד שהיא מגיעה ל- OD436 של כ- 0.5. לאחר מכן, העבירו את התרבית לקרח עד שכל הדגימות נאספו. לאחר מכן, יש לחמם מראש בקבוק תרבית אחד מכוסה של 100 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של 10% TCA לכל דגימה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.מדוד ורשום את ה-OD436 של תרביות הניסוי ישירות לפני קצירת התאים. לאחר מכן, העבירו ארבעה מיליליטר תרבית לבקבוק TCA שחומם מראש. מערבבים את הדגימה ביד תוך סיבוב הבקבוק למשך חמש שניות, מה שישבית מיד את כל הפעילויות האנזימטיות השומרות על רמות הטעינה של ה-tRNAs.לאחר איסוף כל הדגימות, הוסף 5% תאים עם ספייק אין לכל דגימה. הכן גם דגימת בקרה המורכבת רק מתאי ספייק אין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל במיצוי RNA, שפכו שמונה מיליליטר מכל דגימה, כולל בקרות לתוך צינור צנטריפוגה מקורר קרח.צנטריפוגה את הדגימות ב-9, 500 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט לחלוטין, השעו מחדש את הגלולה ב-0.3 מיליליטר נתרן אצטט קר, המכיל 10 מילילימולרי EDTA. העבירו כל דגימות לצינור מיקרו-צנטריפוגה קר של 1.5 מיליליטר והוסיפו 0.3 מיליליטר פנול מאוזן עם המאגר, המשמש להשעיה מחדש של הגלולה.לאחר מכן, מערבולת כל דגימה 10 פעמים למשך 15 שניות בכל פעם. עם לפחות דקה אחת באפס מעלות צלזיוס בין כל מערבולת, כדי לשמור על הדגימות קרות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-20,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.העבירו את החלק העליון או פני המים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר. הוסף 0.3 מיליליטר פנול קר לפני המים ומערבל את הדגימות ארבע פעמים 15 שניות כל אחת כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-20,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.העבירו את פני המים לצינור מיקרו-צנטריפוגה קר חדש של 1.5 מיליליטר והוסיפו 2.5 נפחים של אתנול 96% קר. לאחר מכן, דגרו על הצינורות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לזרז את ה-RNA. צנטריפוגה של הדגימות ב-20,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסיפו בזהירות מיליליטר אחד של אתנול קר 70% לכדור ה-RNA, והקפידו לא להפריע לו. הפוך את הצינור בעדינות פעם אחת, כדי לשטוף אותו באתנול. לבסוף, צנטריפוגה ב 20, 000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.הסר את הסופרנטנט לחלוטין, וייבש את הכדור באוויר עד להסרת האתנול לחלוטין. ב-20 מיקרוליטר של נתרן אצטט קר המכיל 1 מילי-מולרי EDTA, מערבולת נמרצת כדי להשהות מחדש את הגלולה. כדי להתחיל באלקטרופורזה, מערבבים ארבעה מיקרוליטר מכל דגימה עם שישה מיקרוליטרים של מאגר טעינה.טען את הדגימות כולל בקרות על ג'ל פוליאקרילאמיד 6.5 בעובי 0.4 מילימטר המכיל שמונה מאגר אוריל מולרי ו-0.1 מולארי נתרן אצטט. לאחר מכן, הפרד את ה-RNA על ידי הפעלת האלקטרופורזה ב-10 וולט לסנטימטר ג'ל בארבע מעלות צלזיוס למשך כ-20 שעות עד שהצבע הכחול ברומופנול מגיע לתחתית הג'ל. הפרד בזהירות את שתי לוחות הזכוכית כך שהג'ל יישאר על אחת מהן.השתמש באזור הג'ל מצבע הקסילן ציאנול ו-20 סנטימטרים למטה לכיוון צבע הברומופנול לספיגה. חותכים פיסת נייר סינון דקה לגודל אזור הספיגה הרצוי. הניחו את נייר הסינון על גבי החלק של הג'ל שישמש לספיגה.חותכים וזורקים את חלקי הג'ל שאינם מכוסים בנייר פילטר. לאחר מכן השתמש בנייר הסינון כדי להרים בזהירות את הג'ל הרחק מצלחת הזכוכית. הנח קרום ניילון טעון חיובי על גבי הג'ל, ושטף אותו במאגר העברה ב-20 וולט למשך 90 דקות.סיים על ידי קישור צולב של ה-RNA לממברנה באמצעות אור UV. לאחר מכן, הניחו את הממברנה הצולבת בצינור הכלאה והוסיפו שישה מיליליטר של תמיסת הכלאה. סובב את הצינור בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להכליא מראש את הממברנה.לאחר מכן, הוסף 30 בדיקת DNA אוליגו רדיואקטיבי טוחנת שיא מולארית, חמישה ראשוניים ומסומנים ב-P32. סובב כדי לדגור את הממברנה עם הגשושית בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה חד פעמית של 10 מיליליטר כדי להסיר את הבדיקה.לאחר מכן, יש לשטוף במהירות את הממברנה פעמיים בצינור ההכלאה, ב -15 מיליליטר תמיסת כביסה בטמפרטורת החדר. העבירו את הממברנה למיכל פלסטיק שטוח, כסו אותה בתמיסת הכביסה וסגרו את המכסה. דגרו את הממברנה על שייקר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.החלף את התמיסה והמשיך לכבס עד להשגת יחס אות לרעש מספק. השתמש בשפופרת גייגר מולר כדי לקבל את יחס האות לרעש, על ידי השוואת הקרינה מהאזור שבו הגשושית עברה הכלאה ל-tRNA, לקרינה מאזור ריק. לאחר מכן, עטפו את הממברנה היטב בניילון נצמד ואטמו אותה אטומה על ידי ריתוך.הנח את הממברנה הזו על מסך הדמיית זרחן. לאחר זמן חשיפה מתאים, סרוק את המסך באמצעות סורק לייזר ושמור את הקובץ בפורמט ג'ל. לאחר מכן, טען את קובץ הג'ל לתוכנת ההדמיה.צייר קו אנכי לאורך כל אחד מנתיבי הדגימה כך שהוא משתרע על רוב רוחב הנתיב תוך אי הכללת קצוות הרצועות שבהם האות יכול להיות לא אחיד. כדי להמחיש ספירות מכל נתיב, לחץ על ניתוח ולאחר מכן צור גרף. הגדר ידנית את שתי הפסגות המייצגות את ה-tRNA הטעון והלא טעון מכל נתיב.לאחר מכן, לחץ על ניתוח ולאחר מכן, דוח שטח כדי לקבל ספירות מכל שיא. לבסוף, רשום את השטח שמתחת לכל אחת משתי הפסגות. חשב את רמות ה-tRNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט.שיטה זו שימשה למדידת השפע של tRNAs שונים ו-E.Coli nf915 לפני ובמהלך הרעבת הארגינין שלנו. בחלקה הצפונית ההכלאה עם בדיקות tRNA שונות, יש הפרדה ברורה בין הרצועות המייצגות את המטען tRNA מהרצועות המייצגות את ה-tRNA הלא טעון. פרופיל הקרינה לאורך כל נתיב, התקבל מהכתמים הצפוניים באמצעות תוכנת הדמיה.אות הקרינה מכל נתיב כומת על ידי בידוד כל אחד מהכתם. גרף המייצג את כימות האות מנתיב בודד, מראה שתי פסגות. הפסגה השמאלית מגיעה מה-tRNA האמינואציל והימנית מה-tRNA המפוזר.השטח שמתחת לכל פסגה מיוצא לניתוח נוסף. כימות הרצועות מהכתם הצפוני, מראה כי השפע היחסי של כל מיני ה-tRNA שנבדקו ירד במהירות ובאופן משמעותי במהלך רעב חומצות אמינו. מצד שני, רמות טעינת ה-tRNA של הארגינין המקבל tRNA ירדו במהירות עם הסרת הארגינין ולאחר מכן עלו מעט במהלך תקופת הרעב.עם זאת, רמות הטעינה של ה-tRNA האחרים עלו מעט עם הרעב ואז ירדו כמעט לרמות שלפני הרעב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר RNA באופן שניתן לכמת את טעינת ה-tRNA ואת השפע וכיצד להשתמש בתאי ספייק אין לנורמליזציה. לאורך הליך זה, חשוב לזכור לשמור על ה-RNA קר וחומצי כדי למנוע הידרוליזה של ה-RNA.

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים שיטה לניתוח microarray לקבוע רמות aminoacylation היחסי של כל tRNAs...

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

מקור: סטנום, ט. ס. ואחרים. כימות השפע ורמות הטעינה של RNA מעביר באשרכיה קולי. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את השימוש באלקטרופורזה ג'ל ובלטינג צפוני לזיהוי והשוואת רמות הטעינה של RNA העברה ב-E. coli על ידי הפרדת צורות אמינואציליאטיות ודיאציליאטיות.

אלקטרופורזה ג'ל ו-Northern Blotting לזיהוי רמות טעינת tRNA ב-E. coli

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

. כאן, עוצמת הכניסה אקראי בתיווך transposon של רכיב ה-DNA ללא קידוד שימש כדי לפתור את מעמדה כרומוזומלית אופטימלית.

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

בשיטה זו, אנו מכמת את הזיקה המחייב של מאגד כריכת RNA (rbps) כדי קנצוני ואתרי כריכה שאינם קנצוני באמצעות שיטה פשוטה, לחיות, העיתונאי בתאי חיידקי. השיטת היסוד מבוססת על דיכוי של גן עיתונאי.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

פרוטוקול זה מתאר יישום של פלואורסצנטיות מולקולה אחת בהכלאה situ (smFISH) כדי למדוד את הקינטיות vivo של סינתזה mRNA והשפלה.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

טכנולוגיית MAPS פותחה כדי לבחון את היעד של RNA רגולטורי ספציפי ב vivo. sRNA של עניין מתויג עם APTAMER MS2 המאפשר טיהור משותף של שותפי RNA שלה וזיהוי שלהם על ידי רצף RNA. פרוטוקול שונה זה מתאים במיוחד לחיידקים גראם חיוביים.

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים להתיישבות בעכברים עם pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים, וכן שיטות לא פולשניות לאימות קולוניזציה והערכת התרחבות pks+ E. coli בצואה.

התיישבות עם עכברים pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים

למד כיצד לכמת רמות טעינה של tRNA בחיידקי Escherichia coli בצמיחה שונה. שיטה זו מאפשרת השוואה כמותית מדויקת של רמות RNA בין מצבי צמיחה שונים באמצעות תאי spike-in.

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

גלה סרטונים נוספים