Name: לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: למדו להשתמש בלייזר Microirradiation כדי לחקור תגובות תאיות לנזק DNA פשוט ומורכב בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמיקה מולקולרית של גורמי תיקון בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר אקירה Yasui ב אוניברסיטת Tohoku, יפן על פלסמיד ביטוי GFP-NTH1, ד ר ארוס Lazzerini Denchi המחקר סקריפס המכון, הויה שבקליפורניה עבור TRF2-YFP ו- EGFP-53BP11220-1711 ביטוי פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי חיל האוויר Office של המחקר המדעי (FA9550-04-1-0101), בקמן לייזר המכון inc. לקרן (M.W.B), את מלגת קרן פורד של האקדמיה הלאומית למדעים (ל B.A.S), ואת ה-NSF MCB-1615701 CRCC CRR-17-426665 (ל- Y ק.).

המחברים אין לחשוף.

יתרונות השימוש microirradiation לייזר למחקר DDR הם:
1. זה ריאלי לזירוז סוגים שונים, כמויות של ה-DNA נזק ממעברי סטרנד פשוטים מורכבים נזק לדנ א, כדי לזהות גורמים שונים לתיקון על ה-DNA נזק אתרים על-ידי התאמת הפרמטרים הקרנה לייזר. זה גם אפשרי לגרום נזק מספר פעמים, גרעין התא אותו, על מנת להעריך את ההשפעות טרנסג'נדרים (כמו איור 3).
2. חשוב, אירועים-נזק ואתרי משני האירועים המתרחשים במקומות אחרים בגרעין ניתן בקלות להבחין.
<p class=...

אין ויוו ה-DNA נזק איתות זה אינם מובנים היטב In vivo, ה-DNA הוא ומורכבת עם שינויים היסטוניים וגורמים אחרים כדי טופס כרומטין סיבים. ויסות הכרומטין היא בעלת חשיבות עליונה עבור ה-DNA חילוף החומרים. לדוגמה, הגרסה היסטון H2AX phosphorylated אטקסיה-telangiectasia מוטציה (ATM), אחרים kinases כפול הבאים-strand שובר אינדוקציה (DSB), ועל חשוב DSB נזק אות הגברה, כמו גם מתן אתר עגינה עבור השני גורמים. הפצת הבחירה מסלול איתות ותיקון הנזק מופיעים אנושות להיות מושפע הכרומטין מקומיים-נזק לאתרים1. מספר של כרומטין שיפוץ גורמים מלווים היסטון, היסטון שינוי אנזימים אכן גייסו לפגוע באתרים חשובים עבור תיקון דנ א יעיל, הדגשת החשיבות של כרומטין רגולציה ב- DDR ואת תיקון2 , 3 , 4. יתר על כן, נזק באתר קיבוץ באשכולות או שינוי מיקום נצפתה ב שמרים ו דרוזופילה5,6,7,8, מזכיר relocalization של ג'ין לוקוסים, תא subnuclear הקשורים עם ג'ין בתקנה9,10. מחקרים שנעשו לאחרונה העכבר, תאים אנושיים התגלה גם גיוס של אתרים DSB, אילו השפעות תיקון נאמנות ועל מסלול הבחירה11,12. זה מעלה את האפשרות כי DDR/תיקון גם בצורה אינטימית קשורה אדריכלות גרעיני כרומטין מיומנויות ארגון, כרומוזום דינאמיקה של גרעין התא. לפיכך, חיוני לפתח שיטות ברזולוציה גבוהה ללמוד DDR ולתקן תהליכים בהקשר של הסביבה גרעיני אנדוגני בתא חי כדי להבין קצר - ארוכת ההשלכות של נזק לדנ א.
תפקיד מכריע של PAR פולימראז (PARP) מודד במידה ואת סוג הנזק, ויסות חלבון הרכבה באתר נזק PARP1 הוא חיישן ניק DNA מופעל במהירות על ידי נזק לדנ א שמשחקת תפקיד קריטי תיקון דנ א13. PARP1 חשבו תחילה לפעול יחד עם הרנטגן לתקן לחצות משלימים 1 (XRCC1) כדי להקל על כריתה הבסיס לתיקון (בער), אך מחקרים אחרונים לחשוף את תפקידה השני שמסלולי התיקון ה-DNA, כולל DSB תיקון14. PARP1 שימושים nicotinamide אדנין dinucleotide (NAD+) כמו מצע ל ADP-ribosylate מספר היעד החלבונים מופעל, כולל את עצמו. אנזים זה ובני משפחה אחרים משכו תשומת לב רבה בשנים האחרונות כפי מעכבי PARP הופיעו גם מבטיח תרופות טיפוליות עבור סרטן. למרות מעכבי PARP בתחילה נמצאו יעילים גנטי לסרטן השד (BRCA)-מוטציה תאים סרטניים בשד, עכשיו יש שפע של עדויות על ההשפעות שלהם במונו - שילוב טיפולים אלטרנטיביים יחד עם ה-DNA נזק סוכנים/הקרנה נגד קשת רחבה של סרטן עם מוטציות לא מוגבל ל- BRCA15,16,17,18,19,20.
ברמה המולקולרית, הפעלת PARP הוצגה לשחק תפקידים חיוניים בארגון הכרומטין מקומיים באתרים נזק. תלויי-PAR גיוס של כרומטין השינוי אנזימים מקלה DSB תיקון ותיקון מכתיבה בחירות מסלול, מציעה את תפקיד חשוב פיגומים PAR השינוי באתרים נזק. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 לאחרונה להדגים את החרגת מחייב p53 חלבון 1 (53BP1) מפני נזק אתרים על ידי PAR 32, מתן הסבר חלופי עבור תלויי-53BP1 hyperactivation של endjoining שאינם הומולוגיים ( NHEJ) על ידי PARP מעכב, המדגיש את חשיבות PARP ב DSB תיקון מסלול הבחירה33,34. PARP1 גם ישירות PARylates, משפיע על הפעילות של DNA מרובים תיקון גורמים14.
באמצעות לייזר Microirradiation ככלי לימודים DDR/תיקון In Vivo לייזר microirradiation לייצר שינויים תת מיקרון על כרומוזומים בודדים היה תחילה תיאר בשנת 196935 , שנסקרו בפירוט 198136. כמה עשורים מאוחר יותר, לייזר microirradiation הוצגה כדי לגרום נזק לדנ א-אזור מוגדר submicrometer בתוך גרעין התא, ולא הוכח טכניקה יקר ללמוד גיוס או שינויים של גורמים שונים DNA נגעים vivo בתוך 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. שיטה זו מאפשרת זיהוי של גורמים אלו שיוצרות לא ברורים הקרנה-induced מוקדים (IRIF)-נזק לאתרים39,42. . זה גם ניתן לבחון את הדינמיקה ייתכן של שינויים מבניים כרומטין באתרים נזק והן בשאר חלקי הגרעין. השווינו בקפידה את DDRs המושרה על ידי מערכות לייזר שונים קלט כוחות כדי להעריך את הקשר בין סוג נזק לדנ א microirradiation תנאים32,43,44, 45. דפוסי גיוס aberrant של 53BP1 ושל telomeric חוזר מחייב פקטור 2 (TRF2) נצפו במחקרים קודמים לייזר נזק, אשר סיפקה את הבסיס על הדאגה מחזוריות הטבע "הלא-פיזיולוגיים" לנזק לייזר המושרה46 ,47,48,49. מצאנו כי אלו סתירות לכאורה יכול עכשיו להיות מוסברת על ידי PARP דיפרנציאלית איתות אשר בוחן את הכמות ואת המורכבות של נזק מושרה32. אנחנו אישר כי: 1) לייזר-microirradiated תאים (אפילו לאחר הקרנה גבוהה קלט-power) הם נעצרו ב לאטמוספרה באופן תלוי-בקרת מחסום נזק, מורדם (לפחות עד 48 שעות)32,50; ו- 2) תיקון גורם גיוס/שינויים בנאמנות מסכם את הדברים אלו נצפו עם טיפול קונבנציונאלי DNA סוכנים מזיק, אינדוקציה DSB endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. תוצאות אלה תומכים מאוד את הרלוונטיות פיזיולוגיים של הלומדים לייזר המושרה נזק הסלולר תגובות.

<table><tbody><tr><td>Ti:Sapphire NIR פועם לייזר פמטו-שנייה Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td><td>מירה 900</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA אובייקטיבי</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שלב סיבוב קומפקטי&nbsp;</td><td>בקר טמפרטורה Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>Warner</td><td></td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>מערכת חימום</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>מערכת דגירה בגז</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>מד כוח ואנרגיה לייזר (RoHS)</td> <td>שדה קוהרנטיMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD דיגיטלית ORCA-R2</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META מיקרוסקופים לסריקת לייזר</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ כלים מרושתים&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 תאי אפיתל כליה</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תאי HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>מדיום בלתי תלוי CO2&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>מתקדם MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>בתוספת L-גלוטמין, 4% FBS</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>תימידין&nbsp;</td><td>&nbsp; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>מדיה ללא סרום&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (מדיית סרום מופחתת Opti-MEM I)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-ציקולבוטנס פירימידין דימר (CPD) (עכבר)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (עכבר)</td> <td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (ארנב)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (ארנב)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-PAR פולימרים (עכבר)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (ארנב)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (עכבר)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>אנטי 6-4PP (עכבר)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (ארנב)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (לזיהוי קוהיסין)</td>נוצר במעבדת <td></td><td></td><td>יוקומורי (KY)</td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (ארנב)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (עכבר)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-אוקסיגואנין&nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-PARP1&nbsp; (ארנב)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>נוצר ב-KY lab</td><td></td><td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp; אנטי-hCAPG (ארנב)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (לזיהוי עיבוי)</td><td>נוצר ב KY lab</td><td></td><td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>חמור אנטי עכבר Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 קו תאים יציב&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>נוצר ב-KY lab</td><td></td><td>ref 49&nbsp;</td></tr><tr><td>קו תאים יציב GFP-NEIL2</td><td>שנוצר במעבדת</td><td></td> KY <td>ref 54</td></tr><tr><td>GFP-NTH1 קו תאים יציב</td><td>שנוצר במעבדת</td><td></td> KY <td>ref 32</td></tr><tr><td>GFP-SMC1 פלסמיד</td><td>שנוצר במעבדת</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>GFP-Ku פלסמיד</td><td>שנוצר במעבדת</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>Anti-MDC1 (ארנב)</td><td>&nbsp; נובוס ביולוגי</td><td>NB100&ndash; 395</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-gH2AX (ארנב)</td><td>&nbsp; Millipore</td><td>07&ndash; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) קו תאים יציב PtK2</td><td>שנוצר במעבדת</td><td></td> ברנס <td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP PtK2 קו תאים יציב</td><td>שנוצר במעבדת</td><td></td> ברנס <td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>מעכב PARG</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&ndash; מעכב PKcs&nbsp; NU7026&nbsp;</td><td>מעכב כספומט Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>KU55933</td><td>&nbsp; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>כמות תוכנת ניתוח חד-ממדית אחת גרסה 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>תוכנית ניתוח תמונות</td></tr><tr><td>תוכנית הגיליונות האלקטרוניים</td>של <td>אקסל</td><td>מיקרוסופט</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>חומר ניקוי</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco 10X ללא סידן ומגנזיום</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>14200166 לדלל ל-1X&nbsp;</td></tr></tbody></table>

לייזר microirradiation ללמוד in vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

נזק לדנ א מעוררת תגובות ספציפיות איתות ותיקון בתא, אשר חיוני להגנה של הגנום שלמות. לייזר microirradiation הפך כלי ניסויי חשוב לחקור את ה-DNA נזק התגובה (DDR) ויוו. היא מאפשרת ניתוח מתא בודד ברזולוציה גבוהה בזמן אמת של דינמיקה macromolecular בתגובה לייזר המושרה נזק מוגבל לאזור submicrometer בתוך גרעין התא. עם זאת, התנאים לייזר השונים שימשו ללא הערכה של הבדלים בין סוגי הנזק הנגרם. כתוצאה מכך, מהות הנזק הוא לעתים קרובות לא טוב מאופיין או נשלט, גורם חוסר עקביות לכאורה פרופילי גיוס או שינוי. להדגים כי תנאי הקרנה שונות (קרי, אורכי גל שונים וכן סמכויות קלט שונות (irradiances) של לייזר הפמטו-שנייה (fs)-סגול (ניר)) המושרה הרכבות חלבון ברורים של DDR ותיקון. זה משקף את סוג נזק לדנ א המיוצר. פרוטוקול זה מתאר איך טיטור של עוצמת הקלט הלייזר מאפשר אינדוקציה של כמויות שונות המורכבות של נזק לדנ א, אשר ניתן לנטר בקלות על ידי זיהוי של נזקים crosslinking, בסיס, פוליפוני דיפרנציאלית (ADP-ריבוז) (PAR) איתות, ו תיקון מסלול ספציפי הרכבות גורם נזק אתרים. ברגע נקבעים התנאים נזק, זה אפשרי לחקור את ההשפעות של נזק שונות המורכבות והאיתות נזק דיפרנציאלית, כמו גם דלדול של factor(s) נגד הזרם על כל גורם בעל עניין.

באמצעות תאים PtK2 stably להביע את EGFP-53BP11220-1711 או TRF2-YFP, לייזר כוח קלט טיטור בוצע כדי לקבוע את המצב האופטימלי עבור שלהם גיוס (איור 1)32.
באתרים נזק גבוה קלט-כוח לייזר, משמעותי התקבצות של שיקגו (crosslinking נזק שנוצר בדרך כלל על ידי אולטרה סגול (UV) נזק) כמו גם glycosylase DNA GFP-NTH1 במיוחד מזהה נזק הבסיס נצפו. בנוסף, אותות XRCC1 ו- CtIP גבוה נצפו, המשקף עלייה במספר מעברי סטרנד ולאחר הוכחת נזק לדנ א מורכב הוא המושרה ב...

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש במיקרו-הקרנה בלייזר כדי להשראת סוגים שונים של נזקי DNA, כולל שברים פשוטים בגדיל ונזקים מורכבים, במטרה לחקור את סיגנל נזקי ה-DNA ואת הרכבת גורמי התיקון in vivo. בשנות ה-60 וה-70, מיקדו קרן לייזר דרך מיקרוסקופ, שניתן לראות מאחוריי, והצלחנו לגרום לנזק באזור קטן של כרומוסומה. התא התחלק, שרד, ולא יכולנו להבין מדוע.ובכן, 40 שנה מאוחר יותר, אנו משתמשים כעת בשיטה זו כדי לחקור באופן סלקטיבי תיקון DNA, וזה מה שתראו היום. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA, כגון כיצד מזוהל נזק ל-DNA וכיצד הוא מעובד, וכיצד אות הנזק מופץ בתא. מיקרו-הקרנה בלייזר מאפשרת ניתוח של תא בודד ברזולוציה גבוהה ובזמן אמת של דינמיקה מקרו-מולקולרית בתגובה לנזק ל-DNA המוגבל לאזור של מספר מיקרומטרים בתוך גרעין התא.עם זאת, נעשה שימוש בתנאי לייזר שונים ללא הבנה של ההבדלים בסוגי הנזקים המושרים, מה שגרם לחוסר עקביות בתגובות התאיות, בגיוס גורמים ובמודיפיקציות. כדי לבטא חלבונים מתויגים בפלואורסצנציה בתאי Hela, ביום הראשון, זרעו 6-8 × 10⁴ תאים ב-0.5 milliliters של מצע גידול בבאר אחת של פלטה בעלת 24 בארות. לאחר מכן, הניחו את הפלטה באינקובטור לתרביות רקמה.ביום השני, בצעו טרנספקציית DNA בתיווך ליפוזומים על ידי דילול של 0.3 מיקרוגרם של DNA של פלסמיד ביטוי לממיפרים המקודד לגורם תיקון DNA מתויג פלואורסצנטית לתוך 25 מיקרוליטר של מצע גידול נטול סרום. כאן, אנו משתמשים בדומיין המכוון לאתר הנזק של 53BP1 המחובר ל-GFP עבור נזקי שבירה של גדיל כפול, או ב-DNA glycosylase NTH1 המחובר ל-GFP עבור נזקי בסיס. במבחנה אחרת בנפח של 1.5 מיליליטר, דללו מיקרוליטר אחד של ריאגנט לטרנספקציית DNA מבוסס ליפוזומים לתוך 25 מיקרוליטר של מצע גידול נטול סרום, ולאחר מכן ערבבו את תכולת שתי המבחנות, ה-DNA המדולל והריאגנט לטרנספקציה, יחד והדגרימו את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ליצירת קומפלקסים של DNA-ליפיד.שטפו את התאים פעם אחת עם 0.5 milliliters של מצע גידול, לאחר מכן הסירו את המצע והוסיפו לתאים 0.5 milliliters של מצע גידול טרי. הוסיפו לתאים את קומפלקסי ה-DNA-lipid וערבבו בעדינות על ידי נדנוד של הפלטה מספר פעמים. לאחר מכן החזירו את התאים לאינקובטור.לאחר ארבע עד שש שעות, הסר את מצע התרבית מהתאים והוסף 300 µL של 0.5% Trypsin-EDTA. הסר את התמיסה, ולאחר מכן הוסף 200 µL של Trypsin-EDTA והדגר את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד ארבע דקות. לאחר וידוא שהתאים ניתקו, הוסף 800 µL של מצע תרבית והשב את התאים לסוספנזיה באמצעות פיפוט עדין לפירוק גושי התאים.העבירו את תרחיף התאים לצלחית תרבית של 35 מילימטרים עם כיסוי זכוכית משובץ ברשת, והוסיפו מצע תרבית עד לנפח סופי של 2 מיליליטרים. לאחר 48 שעות, התאים יגיעו לרמת התמזגות (confluency) של 30 עד 60% עם ביטוי של חלבון פלואורסצנטי, ויהיו מוכנים להשראת נזק באמצעות לייזר. הדליקו את לייזר ה-NIR ואפשרו למערכת הלייזר להתחמם למשך שעה אחת לפני השימוש.הניחו צלחת תאים על במה מחוממת ל-37 °C בתא המאפשר בקרה של פחמן דו-חמצני ולחות. לצורך אנליזה של תאים חיים עם חלבונים מסומנים פלואורסצנטית, השתמשו בעדשת שיקוע שמן בהגדלה גבוהה ובשילוב מסנני פלואורסצנציה מתאים, בהתאם לסימון. חפשו תאים בעלי ביטוי דומה של חלבון פלואורסצנטי.הימנעו מתאים בעלי ביטוי חלש או חזק מדי, וזאת כדי להפחית את השונות בין התאים במדידות הפלואורסצנציה. עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית, השתמשו בעדשת שמן 100x בעלת מפתח מספרי (numerical aperture) של 1.3 ובפונקציית ה-bleach של התוכנה כדי לסמן מסלולים ליניאריים בתוך גרעין התא. כוון את אחוז העברת הלייזר ל-5% מבלי לשנות הגדרות אחרות.לאחר מכן, מקמו תא במרכז השדה. לחצו על אזור העניין (region of interest), ובעזרת העכבר, שרטטו בגרעין קו או מלבן בגודל של כ-50 על ארבעה פיקסלים. הימנעו מלגעת במעטפת הגרעין או בגנועים.לאחר מכן, לחצו על כפתור ה-bleach כדי לגרום לנזק ל-DNA. כאן, ההבדל בין שיא הגיוס של GFP-53BP1 לזה של GFP-NTH1 ניכר. כדי לבצע ניתוח פלואורסצנציה כמותי של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, השתמשו בהגדלה של 1x, ובלייזר ארגון עבור GFP FITC.הגדירו רזולוציה של 512 x 512 פיקסלים, מהירות סריקה של חמש, ומספר 1 לסריקה מהירה או 2 ומעלה לממוצע על פני מספר סריקות לשיפור יחס אות לרעש. לאחר מכן, צלמו את התמונות. שרטטו את ה-ROI להבהלה עבור השראת נזק, לאחר מכן בחרו בתפריט המשנה של Time Series שהורחשה, הגדירו את המספר ל-20 ואת השהיית המחזור ל-30 שניות.בחר ב-bleach פעם אחת לאחר הסריקה הראשונה, ולאחר מכן לחץ על start B. במקרה זה, התמונה הראשונה נרכשת מיד לפני השראת הנזק, ולאחריה רכישה של 19 תמונות נוספות במרווחי זמן של 30 שניות. כאן ניתן לראות כי GFP-NTH1 מגויס במהירות ובאופן חולף לאתרי הנזק, בעוד ש-GFP-53BP1 מצטבר לאט ונשאר באתרי הנזק. חלק מגורמי התיקון עשויים להיות מגויסים לאתרי הנזק באופן תלוי בשלב במחזור התא.כדי לזהות תאים בשלב G1 לצורך השראת נזק, יש לזהות תאי מטאפאזה בעלי צורה מעוגלת ומורמים מעט, תחת מיקרוסקופ הפוך, באמצעות עדשת אובייקטיב 10x ועדשות אוקולר 10x. יש לצלם תמונות כדי לתעד את מיקומם של תאי המטאפאזה על זכוכית הכיסוי המסומנת ברשת. לאחר שלוש עד ארבע שעות, יש לוודא כי חלוקת התאים הובילה לשני תאי בת המוכנים להשראת נזק במיקום המתועד.להכנת תאי פאזה SG2, השתמשו בפרוטוקול חסימת תימיד כפולה. אששו את יעילות הסנכרון באמצעות פרופיל DNA ו/או זיהוי של Rad51 באתרי הנזק. בנזק לייזר בעוצמת קלט גבוהה, ניתן היה להבחין בבירור יותר בהצטברות של נזקי CPD UV ושל GFP-NTH1 DNA glycosylase המזהה באופן ספציפי נזק לבסיס, בהשוואה לעוצמת קלט נמוכה.בנוסף, נצפו רמות גבוהות יותר של XRCC1 ו-CtIP, המבטאות את המספר המוגבר של שברים בחוט אחד או שניים של ה-DNA, ובכך מעידות על כך שנגרם נזק מורכב ל-DNA. כפי שהודגם כאן, שינוי בהספק הכניסה של הלייזר מוביל לשינויים באותות הנזק. PARP1 מתווך פולי-ADP-ריבוזילציה (PAR) של חלבוני מטרה באתרים הפגועים, תהליך שמוגבר באופן משמעותי על ידי לייזר בעל הספק כניסה גבוה, אך רק באופן חלש על ידי לייזר בעל הספק נמוך.53BP1 מגויס לאתרי נזק בעלי הספק קלט נמוך, אך לא לאתרי נזק בעלי הספק קלט גבוה. באופן מעניין, הגיוס לאתרי נזק בעלי הספק קלט נמוך עוכב על ידי נוכחותו של נזק שני בעל הספק קלט גבוה באותה גרעין תא. העכבה הופחתה על ידי מעכב PARP.לעומת זאת, מעכב PARP המפרק את PAR, הגביר את אות ה-PAR, ודיכא ביעילות את גיוס 53BP1 אפילו באתרי נזק עם הספק כניסה נמוך. הדבר מעיד על כך שסיגנל ה-PARP, ולא אופי הנזק כשלעצמו, הוא שקובע את גיוס 53BP1. זוהי דוגמה שבה טיטרציית לייזר חשפה הפעלה דיפרנציאלית של PARP1 המודדת את הכמות והמורכבות של נזקי ה-DNA, ושולטת בנגישות לאתר הנזק.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בכ-חמישה ימים, כולל הכנת התאים, הגדרת מערכת הלייזר, השראת נזק ל-DNA, דימוג של תאים חיים או תאים שעברו עיכוב אימונולוגי (immunosilent), וניתוח הנתונים. התהליך עשוי להיארך יותר במקרה של סנכרון תאים או ניתוח עלויות זמן. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי כיול הספק הכניסה של הלייזר עלול להשתנות עם הזמן, גם באותה מערכת לייזר, ובמיוחד לאחר כיול מחדש של המערכת; לכן, חשוב לבדוק באופן תקופתי את דפוס הגיוס של גורמי התיקון.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע ולהשוות תוצאות משיטות אחרות לגרימת נזק ל-DNA, כגון ניתוח הקרנה, חומרים כימיים או ביטוי של אנדונוקלאזים, וזאת על מנת לאשר שהתוצאות אינן נובעות מארטפקטים ספציפיים ללייזר. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום תיקון ה-DNA לחקור את התגובה לנזקי DNA ביחס לכרומטין גרעיני, ולזהות גורמים ומסלולים חדשים של נזק ל-DNA, זיהוי, עיבוד ואיתות.

laser-microirradiation-to-study-vivo-cellular-responses-to-simple

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית לזיהוי יעיל של תאי S-phase למחקרי מיקרוסקופיה במורד הזרם, כגון מדידת גיוס חלבונים לתיקון דנ"א באמצעות הקרנת מיקרו-קרינה בלייזר.

הקרנת מיקרו לייזר לחקר גיוס DNA במהלך שלב S

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

ניתן להשיג נזק ממוקד ל-DNA על ידי קשירת גורם מזיק ל-DNA לאוליגונוקלאוטיד היוצר טריפלקס (TFO). באמצעות TFOs ששונו, ניתן לחקור אסוציאציות חלבון ספציפיות לנזק ל-DNA ושינוי טופולוגיית DNA בתאים אנושיים על ידי שימוש במבחני משקעים חיסוניים של כרומטין שונה ומבחני סלילת על של DNA המתוארים כאן.

כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

לשיטות הקיימות לשינוי צמחים יש ישימות מוגבלת. הטכנולוגיה החדשנית שמקורה בפפטיד המוצעת כאן מבטיחה הן פשטות והן יעילות בהחדרת חלבון או גנים אקסוגניים לתאים התוך-תאיים הרצויים של צמחים שלמים.

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאים אנושיים לניתוח גורמי התחלת תרגום הקושרים את מכסה ה-5' של mRNA בתנאי חמצן פיזיולוגיים. שיטה זו משתמשת באנלוגי כובע m7GTP המקושר לאגרוז ומתאימה לחקירת גורמי קשירת כובע ושותפיהם האינטראקטיביים.

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

למדו להשתמש בלייזר Microirradiation כדי לחקור תגובות תאיות לנזק DNA פשוט ומורכב בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמיקה מולקולרית של גורמי תיקון בתאים חיים.

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

גלה סרטונים נוספים