פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

המטרה הכוללת של הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים היא לצלם תמונות תלת מימדיות בזמן אמת ברזולוציה גבוהה של אוכלוסיות תאים נודדים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון מיפוי מסלולי נדידה של אוכלוסיות תאים שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני מיקרוסקופיה קונפוקלית מסורתית הוא שללייזרים מרובי פוטונים יש חדירה עמוקה יותר לרקמות וירידה בפוטוטוקסיות.

זה מגביר את השימושיות ברקמות עבות יותר ומאפשר תקופות ארוכות יותר של רכישת תמונה. כדי להתכונן לאיסוף עוברים בין השעות 15:00 ל-21:00 הרכיבו מיכלי רבייה ומלאו אותם באוסמוזה הפוכה, או מי RO.

העבירו עד שלוש נקבות ושלושה זכרים לצדדים מנוגדים של המיכל המחולק. למחרת בבוקר, הסר את המחיצה זמן קצר לאחר שהאורות נדלקים בוויווריום. אפשר הזדווגות ללא הפרעה למשך 20 דקות או עד שייווצר מספר מספיק של עוברים.

העוברים יהיו בתחתית מיכל הרבייה. כאשר נצפים ביצים, הרם את המיכל הפנימי המחורר החוצה יחד עם הדגים, והנח אותם במהירות למיכל חיצוני נקי ומוצק מלא במי RO. השתמש במסך איסוף ביצים כדי לאסוף ביצים מהמיכל החיצוני ולהעביר את הביצים לצלחות פטרי המכילות 30 מיליליטר של מדיום עוברי 1X.

דגרו על הביצים שנאספו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. עבור עוברים טרנסגניים, 24 שעות לאחר ההפריה או HPF, הסר את הביציות המתות והעריך את השלב ההתפתחותי של העוברים. בעזרת מלקחיים, הסר את הכוריונים משלושה עד ארבעה עוברים המבטאים GFP.

תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי מנתח עם מסנן עירור מעבר פס סטנדרטי של 460 עד 490 ננומטר, מסנן עוברים חיוביים ל-GFP. העבירו את העוברים הללו לצלחת פטרי נפרדת המכילה 30 מיליליטר של מדיום עוברי טרי 1X. לאחר 20 HPF, הנח את העוברים החיוביים ל-GFP שהוקרנו ועברו דה-כוריון בתמיסת PTU של 0.003% כדי לעכב פיגמנטציה.

הימנע מהתחלת טיפול מוקדם יותר מכיוון שהוא יכול להשפיע לרעה על הפסגה העצבית והתפתחות הנוירו-אפיתל. הוסף 0.4 גרם אבקת LowMelt Agarose ל-20 מ"ל של מדיום עוברי 1x. חממו את התערובת במשך דקה עד שתיים, או עד שהתמיסה צלולה וכל החלקיקים נמסים.

יש לשים כ-1 מ"ל מתמיסת אגרוז לצינורות צנטריפוגה טריים של 1.5 מ"ל לאחסון. כדי להגדיר את תא האמבטיה הפתוח, הניחו כמות קטנה של שומן ואקום גבוה על בסיס תא האמבטיה הפתוח. הנח כיסוי זכוכית עגול, החליק על הבסיס והברג את החלק העליון של תא האמבטיה הפתוח על הבסיס עד שהוא מהודק.

פיפטה כ-500-700 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז 2% לתוך תא האמבטיה הפתוח עד למילוי הבסיס כ-3/4 שניות. המתן 30 שניות כדי לאפשר לאגרוז להתקרר מעט מבלי להתפלמר לחלוטין ולאחר מכן להעביר עובר בודד למרכז הבסיס. תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי, השתמש בקצה מיקרו פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי לכוון את העובר ולמקם אותו ליד החלק התחתון של האגרוז כך שהוא לא יצוף כאשר מוסיפים את המדיום העוברי.

שלב קריטי הוא לוודא שהעובר ממוקם נכון באגרוז. בניסויים אלה, אנו מכוונים את העובר לרוחב, אך ניתן גם למקם את העובר כך שיתמקד באזורים הגביים והגחוניים. עקוב אחר העובר ומקם אותו מחדש עד שהאגרוז מתייצב.

לאחר מכן השתמש בפיפטה העברה כדי למלא לחלוטין את החדר הפתוח המורכב במדיום עוברי זמן-lapse. לאחר הנחת כל המערך על במת המיקרוסקופ, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במטרה חמש פעמים כדי לאתר את העובר. לאחר מכן הרם ידנית את הבמה למיקום הגבוה ביותר והשתמש במיקוד העדין כדי למקם את העובר באמצע טווח המיקרוסקופ.

הורד ידנית את השלב ושנה את יעד חמשת הזמנים ליעד הטבילה במים של 25 פעמים. הרם בזהירות את הבמה כדי להחזיר את העובר לפוקוס. בתוכנה, לחץ על מצב XYTZ לקבלת תמונות מרובות בזמן או במרווחי T במישור XY על פני עומק Z.השתמש בתצוגת האפיפלואורסצנציה או השדה הבהיר כדי למצוא את עומק המיקוד באזור העניין שיתחם את מחסנית ה-z.

עבור ניסויים אלה, הקצה הצדדי של העין הוא תחילתה של ערימת ה-z. כאשר ממוקדים כאן, בתוכנה לחץ על כפתור ההתחלה. לאחר התמקדות עד לקו האמצע של העובר, שהוא קצה ערימת ה-z, לחץ על כפתור הסיום.

שלב קריטי הוא לוודא ששלב Z מקיף את תחום העניין. במקרה שלנו, אנו רוצים ללכוד את רוחב העין מהקצוות הצדדיים לקצה המדיאלי. לחץ על התפריט להתאמת זמן הרכישה ותדירות ההדמיה.

להתאוששות נאותה של הפלואור4 והישרדות העובר, אפשר יחס של לפחות אחד לשלושה בין רכישת מחסנית z כאשר כוח הלייזר מופעל לבין זמן ההתאוששות כאשר מתח הלייזר כבוי. עם הזמן המתאים להתאוששות העוברים, הגדר את הזמן בין ערימות z בחלון המיועד. לאחר מכן הגדר את משך הזמן הכולל לניסוי בחלון המתאים.

כעת, הפעל את הגדרת התמונה החיה כדי לבצע התאמות אחרונות להגדרות הלייזר. התאם את פסי המחוון של שידור לייזר, רווח והיסט בתוך התוכנה כדי לייעל את תמונת הקרינה. כמו כן, התאם את כיוון העובר לפי הצורך בהתאם לאורך הניסוי, הצמיחה הצפויה של העובר וכו'.

ודא שאזור העניין נשאר בתוך המסגרת לאורך כל הניסוי. במהלך רכישת זמן-lapse, כבה את מקור האור האפיפלואורסצנטי, כסה את ה-stage בקופסת הבטיחות בלייזר המתאימה להגנה מפני אור רקע, ולאחר מכן לחץ על התחל. גש לתא האמבטיה הפתוח דרך דלתות ההזזה בקופסת הבטיחות בלייזר כדי למלא אותו מחדש במדיום עוברי זמן-lapse כל 8-12 שעות.

לאחר רכישת ההדמיה, פתח את הקבצים בתוכנת עיבוד התמונה, סמן את סדרת התמונות הנכונה. בתוכנה, בחר בתפריט התהליך, לחץ על דה-קונבולוציה תלת מימדית והחל כדי לפרק כל מחסנית z. ייבא קבצי tif בודדים לתוכנת עיבוד וידאו, ולאחר מכן בחר את כל קבצי ה-tif וגרור אותם לעורך הווידאו.

התאימו את האורך של כל תמונה בסרטון ל-0.1 שניות. לבסוף, ייצא את הסרטון כקובץ mov או mp4. ניתן לראות כאן על ידי הדמיה פלואורסצנטית מרובת פוטונים את דפוסי הנדידה של תאי פסגה עצבית גולגולתית המולידים את מבני הפנים הגולגולתיים ואת המקטע הקדמי של העין בקווי דג הזברה הטרנסגניים sox10:EGFP ו-foxd3:GFP.

Sox 10 תאי פסגה עצבית חיוביים בין 12 ל -30 hpf נודדים מקצה הצינור העצבי לאזור הפנים הגולגולתי. התאים מהפרוסנצפלון והמזנספלון נודדים בגב ובגחון לעין המתפתחת כדי לאכלס את המזנצין הפרי-עיני. כפי שמצוין כאן, התאים החיוביים sox10 יוצרים את תהליך האף הקדמי.

תאי פסגה עצבית מהמעוין נודדים בגחון ומולידים את קשתות הלוע. הדמיית זמן-lapse של תאי פסגה עצבית חיוביים של foxd3 בין 30 ל-60 hpf מראה שתאים אלה נדדו בין הכוס האופטית לאקטודרם פני השטח ודרך סדק העין המסומן על ידי החץ והתלכד סביב העדשה המסומנת על ידי הכוכבית היוצרת את סטרומה הקשתית. לאחר שליטה, טכניקה זו מתחילתה ועד סופה יכולה להיעשות תוך ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לבחור עוברים עם כמות גבוהה של פלואורסצנטיות. הגדרת התוכנה בהתחלה יכולה להיות מאתגרת, אך לאחר קביעת הפרמטרים, שינויים נוספים הם בדרך כלל מינימליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוסקופ זמן-lapse מרובה פוטונים כדי לדמות תאים נודדים בעובר.