יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא ליצור ספריית החדרת טרנספוזונים בצפיפות גבוהה ב-Escherichia coli או Shigella flexneri באמצעות צימוד חיידקים. טכניקה זו מאפשרת יצירת מאות אלפי מוטציות חיידקיות ייחודיות על ידי החדרה גנומית אקראית של טרנספוזון Tn10. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהעברת הפלזמה במחסן הטרנספוזון נעשית באמצעות צימוד חיידקים במקום שיטות אחרות פחות יעילות, כגון אלקטרופורציה.

בנוסף, הטרנספוזון Tn10 עצמו מוחדר לגנום עם פחות הטיה מאשר טרנספוזונים אחרים. בטכניקה סטרילית, הוסף מיליליטר אחד של תרבית לילה של הזן התורם לתוך צינור אפנדורף סטרילי. יש לסמן את הצינור למשל ב-D, לתורם.

עשו את אותו הדבר עבור הזן המקבל, והסירו מיליליטר אחד של תרבית לילה של הזן המקבל לתוך צינור אפנדורף סטרילי. שוב, למשל, מסומן ב-R, עבור הנמען. צנטריפוגה את שני הצינורות למשך דקה אחת ב 14, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר.

ניתן לעשות זאת בצנטריפוגה על ספסל. בזמן שהצנטריפוגה פועלת, הכינו את המסננים לצימוד. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח מסנן ניטרוצלולוזה על צלחת אגר LB המסומנת ללא אנטיביוטיקה.

לחלופין, במקום מסנן ניטרוצלולוזה, ניתן להשתמש בנייר סופג. הנח כל מסנן על צלחת אגר LB נפרדת על מנת למזער את הזיהום. ודא שכל מסנן מונח על צלחת אגר LB המסומנת כראוי.

הכינו שלוש צלחות, כל אחת מכילה פילטר. אחד לזן התורם, אחד לזן הנמען ואחד לספרייה. לאחר סיום הצנטריפוגה, הסר את תרביות הלילה.

הסר את כל מצעי הגידול המכילים אנטיביוטיקה מצינור האפנדורף והשליך. הקפד לא לשבש או להפריע לפלטת תאי החיידקים, אך נסה להסיר את כל מצעי הגידול. הקפידו לעבוד בצורה אספטית ולהחליף טיפים בין כל דגימה.

לכל שפופרת אפנדורף, הוסף 110 מיקרוליטר של מדיה LB טרייה ללא אנטיביוטיקה ופיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות את התרבית. הקפידו לעבוד בצורה אספטית. על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח שלא יישארו גושי תאים.

שלב זה נעשה כדי לרכז את תרבית החיידקים ולהסיר את כל האנטיביוטיקה שנותרה מתרבית הלילה. בעזרת פיפטה, הניחו 50 מיקרוליטר מתרבית התורם המרוכזת על המסנן שכותרתו תורם. הוסף לאט את 50 המיקרוליטר למסנן בצורה טיפה.

עשה את אותו הדבר עבור הזן המקבל המוסיף 50 מיקרוליטר מהתרבית המושהית, התרבות המושהית המרוכזת על מסנן הנמען בצורה חכמה. כדי שההצמדה תתרחש, גם הזן המקבל וגם הזן התורם מתווספים לאותו נייר סינון כך שהם נמצאים במגע פיזי קרוב. על מנת לעשות זאת, הוסף 50 מיקרוליטר הן של זן התורם והן של זן הנמען לאותו מסנן בספריית הצלחת המסומנת בלוח.

הנח את צלחות האגר המכילות את המסננים ב-37 מעלות למשך שש שעות. תהליך ההצמדה מתרחש במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. במהלך הצימוד, הפלסמין pJA1 עובר לזן המקבל.

לאחר הצימוד, החיידקים מנותקים מהפילטר על ידי מערבולת ומושרים עם IPTG מילי-מולרי אחד. IPTG משרה את הטרנספוזאז והטרנספוזון המכיל את הגן לעמידות לקנמיצין מוחדר באופן אקראי לגנום של הזן המקבל. חיידקים מצופים על צלחות אגר LB המכילות קנמיצין ואנטיביוטיקה אחרת לבחירת הזן המקבל המכיל את הטרנספוזון.

הזן המקבל הוא Lambda pir שלילי, כך שהפלסמין pJA1 הולך לאיבוד. לאחר שש שעות של צמיחה ב-37 מעלות צלזיוס, ההצמדה הושלמה. הסר את הצלחות המכילות את המסננים מהחממה.

השתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר את המסנן המכיל את בקרת התורם השלילי מצלחת האגר LB. הקש על הצינור כדי להביא את נייר הסינון לתחתית הבקבוקון החרוטי וודא שהמסנן שקוע במלואו במדיה LB. שפופרת זו מכילה שני מיליליטר של מדיה LB עם IPTG וריכוז סופי של מילימול אחד.

מערבל את הצינור למשך דקה אחת כדי לנתק את החיידקים ממסנן הניטרוצלולוזה. מדיית ה-LB צריכה להיות עכורה עם תאי חיידקים. חזור על פעולה זו גם עבור פקד הנמען וגם עבור הספריה.

לאחר שהמסננים המכילים את תאי החיידקים עברו מערבולת יסודית כדי לנתק את החיידקים מהפילטר, תאי החיידקים מצופים על מדיה נבחרת. בשלב זה, חיידקים מצופים לתוך צלחות אגר LB המכילות קנמיצין ואנטיביוטיקה אחרת כגון חומצה נאלידיקסית. קנמיצין משמש לבחירת תאים נמענים שיש להם את הטרנספוזון המכיל את סמן העמידות לקנאמיצין המשולב בהצלחה בגנום.

תאים נמענים שלא שולב בהם הסמן בגנום נבחרים נגד. אנטיביוטיקה אחרת כגון חומצה נאלידיקסית משמשת לבחירה נגד הזן התורם. הזן התורם המשמש כאן רגיש לחומצה נאלידיקסית, בעוד שהזן המקבל עמיד לחומצה נאלידיקסית.

באמצעות אנטיביוטיקה שנייה זו, ניתן להסיר את הזן התורם. בשלב זה, יש לצבוע מספר דילולים כדי לקבוע דילול של הספרייה שמניב מושבות רבות במרווחים מספיקים. לאחר ספירה ורישום של מספר המושבות בכל הלוחות המכילים את ספריית הטרנספוזון, ייתכן שחלק מהמשתמשים ירצו לאגד או לשלב את הספרייה לצינור אחד.

ניתן לעשות זאת באמצעות מפזר סטרילי. הוסף מיליליטר אחד של מדיית LB ללוחית האגר LB המכילה את ספריית הטרנספוזון. לאחר הוספת המדיה לצלחת, השתמש במפזר הסטרילי כדי לגרד ולנתק את החיידקים מהצלחת.

לעתים קרובות לא ניתן להוציא את כל החיידקים מהצלחת. הסר את תרחיף החיידקים והניח בשפל חרוטי של 50 מיל או 15 מיל. חזור על כך עבור כל הצלחות.

לאחר גירוד כל הצלחות, מערבב את תרחיף החיידקים המאוגד למשך דקה שלמה כדי לפרק את כל גושי התאים. זו מהווה כעת את הספרייה המאוחדת. לאחר צמיחה ב-37 מעלות למשך 18 שעות, לא אמור להיות צמיחה על לוחות הביקורת של התורם או המקבל.

הלוחות המכילים את ספריית המוטאנטים מכילים באופן אידיאלי מושבות רבות במגוון גדלים. גדלים שונים של מושבות הצביעו על שיבוטים בעלי כושר משתנה והם סימן טוב שהפרוטוקול עבד. יצירת ספריית מוטגנזה צפופה של טרנספוזונים בחיידקים עשויה להועיל ליישומים רבים במורד הזרם, החל מגילויים של גנים אלימים ופתוגנים של חיידקים ועד לחקר גנים חיוניים ועד לזיהוי רשתות אינטראקציה גנטיות.

כל היישומים במורד הזרם מסתמכים על בניית ספריית הכנסת טרנספוזונים צפופה. השיטה המוצגת כאן מספקת הליך פשוט, מהיר וזול ליצירת ספריית טרנספוזונים צפופה מאוד בזנים אנטרובקטריאליים כגון E coli או Shigella flexneri.