Name: לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: למדו כיצד לכמת כימוטקסיס מונוציטים אנושיים במבחנה בזמן אמת ולעקוב אחרי נדידת לימפוציטים באורגניזם חי. הפרוטוקולים משתמשים בתאי THP-1 מסומנים ובמעקב פלואורסצנטי רב-ערוצי לחקר מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית ברנרד שוורץ ל' עבור הרופא מדענים האוניברסיטה רוקפלר, הקרן לפיתוח טיפולית רוברטסון באוניברסיטה רוקפלר, ואת מרכז ע ש סאקלר וההתערבות ומחקר תזונה- אוניברסיטת רוקפלר.

כל ההליכים אושרו על-ידי אוניברסיטת רוקפלר &#39; s אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש. כל החיות שוכנו בתנאים מסוימים ללא הפתוגן.
 1-ב חוץ גופית כימוטקסיס <ol><li>תרבות THP-1 תאים 6 בשנת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI 1640) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומצה piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 מ מ) (להשלים מדיה), שמירה על הצפיפות בין 0.5-1.0 x 10 6 תאים למ"ל.</li>
	צלחת <li>תרבית תאים 35 מ מ, תווית 3.5 x 10 תאים 5 THP-1 לכל תנאי עם acetoxymethyl calcein (calcein-אם; 2.5 מיקרומטר) או אחרים מתאימים הפלורסנט בתקשורת מלאה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות 
	הערה: צבעי חייב להיות קרום התא-חדיר ותואמת לחיות תאים תיוג.</li>
	<li>חם מראש קורא צלחת כדי 37 מעלות צלזיוס. 
	הערה: בנוסף בקרת טמפרטורה, פונקציונליות התחתון-קריאה נדרש גם. ראה שלב 1.10.2 עבור אלטרנטיבה קורא צלחת על כימות של נדידת תאים.</li>
	<li>בעוד תאים הם תיוג, להכין את צלחת assay והרכבים נמוך.
	צלחת <ol><li>שימוש בתרבות רקמה 24-. טוב, בתנאי אחד לכל טוב. לבצע כל תנאי דולר.</li>
		<li>750 להוסיף µL של האנק &#39; s Buffered תמיסת מלח (HBSS) באגירה מלאה עם 25 מ מ HEPES ו- 0.1% שור אלבומין (BSA) לצלחת 24-. טוב. זה משמש התנאי שליטה הבזליים.
		<ol><li>שימוש אחרים בארות תנאים השוואה, תמיד שמירה לנפח הכללי בתא התחתון-750 µL. 
			הערה: בדוגמה זו, האדם מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) משמש הפקד חיובי עבור כימוטקסיס 7.
			<ol><li>להרכיב התערובת מגיב על-ידי שילוב HBSS עם 25 מ מ HEPES, BSA (0.1%) ו MCP-1 (75 ng/mL). להשתמש בסרום שור למבוגרים (2.7% v / v) עם MCP-1 כפקד חיוביים נוספים של. 
				הערה: ריכוז כימוקין כימוקין יהיה תלוי על ציר chemotactic במחקר. Lyophilized MCP-1 resuspended מים מזוקקים עם BSA (0.1%) כדי להפוך פתרון מניות עם ריכוז סופי של 50 μg/mL. זה יכול להיות מדולל במים לפתרון עבודה של 10 μg/mL. להוסיף 5.6 μL של פתרון זה לתא התחתון.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>בתום ההרכב של התאים התחתון, במקום הוספה נקבובי כל טוב, ולהבטיח הכרטיסיות של הקדמי ליישר עם החריצים של הצלחת- 
		הערה: בחר את גודל הנקבוביות המתאים עבור מוסיף. עבור ומונוציטים ו לימפוציטים, גודל הנקבוביות של 3 μm מבצע טוב. כמה סוגי תאים ו/או מערכות כימוקין עשויים לדרוש משטח מצופה מטריקס עבור העברה אופטימלית. לדוגמה, למדידת THP-1 כימוטקסיס מונוציט לכיוון MCP-1, fibronectin או מוסיף מצופים קולגן מומלצים. צלחת קורא עבור כימות, הוסף חייבת להיות ציפוי impermeant-אור, כגון פוליאתילן terephthalate, כדי למנוע גילוי של אי-העברת תאים העליונה הקאמרית 8.</li>
	</ol></li> <li>לאחר המקננת תאים למשך 30 דקות עם calcein-AM, להעביר תא ההשעיה צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה תאים ב- 1000 g x עבור 2 דק לבדוק חזותית תאים כדי לאשר ספיגת של calcein-אם ( איור 1).</li>
	<li>הסר בזהירות את תגובת שיקוע באמצעות ליניקת אבק. רחץ תאים עם תוויות ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאים ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. לספור תאים, לכוונן את עוצמת הקול כך התאים נמצאים ריכוז סופי של 1.0-1.5 x 10 6 תאים למ"ל.</li>
	<li>250 לוותר על μL של התליה תא לתוך תותב (העליון קאמרית).</li>
	<li>לאחר כל צ'יימברס העליון היו מלאים, בעדינות להרים את הצלחת לבדוק את החלק התחתון לנוכחות של בועות אוויר שעלולות לפגוע ההעברה וזיהוי. כדי להסיר בועה, נסה תחילה הסרת ואז מיצוב מחדש את תותב. אם לא מוצלח, שימוש במחט 27 G לנקב את הבועה ולאחר מכן מקם מחדש את תותב.</li>
	<li>למקם את הצלחת לקורא צלחת מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס.
	<ol><li>רכוש קריאות קרינה פלואורסצנטית מלמטה במרווחים 1-3 דקות. בעת השימוש calcein-AM, הגדר קרינה פלואורסצנטית אורכי גל עירור, פליטה-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. בהתאם למערכת כימוקין וסוג התא, כימוטקסיס מתרחשת בדרך כלל יותר מ 1-4 h ( איור 2 א).</li>
		<li>כחלופה מדידות רציף באמצעות קורא-צלחת, תמונה הבארות באמצעות הפוכה פלורסנט במיקרוסקופ ( איור 2B) מסוגל עירור וזיהוי של אור-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. השתמש הגדלה נמוכה כדי ללכוד את רוב החלק התחתון של הקדמי. לכמת תאים על-ידי עיבוד התמונות עם ImageJ או תוכנה דומה 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. המאמצים העברה של מאתר לימפוציטים <ol><li>הכנה תאי התורם <ol><li>Anesthetize בשבוע 8-12-C57BL/6J הישן תורם זכר עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של. לאשר עומק ההרדמה המתאימה על ידי הבוהן-קמצוץ.</li>
		<li>הנח את העכבר במצב פרקדן. עושים חתך קו האמצע עם איזמל ואתר הטחול בחלל הצפק השמאלי העליון. לסלק כל הטחול, למקם את המדיה מלאה (RPMI בתוספת 10% FBS עד 25 מ מ HEPES; 1 mL/טחול) על קרח. המתת חסד התורם מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש.</li>
		<li>לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה (1 מ"ל /spleen) באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-</li>
		<li>להוסיף 4 כרכים של אמוניום כלוריד האשלגן (ACK) פירוק מאגר ואת תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי lyse אריתרוציטים.</li>
		<li>Centrifuge התאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע. אם אריתרוציטים נשארים בגדר, resuspend במאגר פירוק ACK, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend התאים בתקשורת מלאה-ריכוז של 2-5 x 10 7 תאים למ"ל, ואז מסננים התליה תא דרך רשת ניילון 40 µm כדי להסיר שאריות תאים.</li>
		<li>תווית 1 x 10 7 תאים/נמען עכבר עם תואם הפלורסנט חיים תאים, זה יוסיף להישמר על קיבוע עוקבות, כגון 5-chloromethylfluorescein diacetate (ריכוז סופי 2 μM) 10 . דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות 
		הערה: כדי לעקוב אחר אוכלוסיית תא אחד או יותר, השתמש אחרים צבעי פלורסנט עם אוכלוסיות תאים נוספים. For example, חלק של תאי התורם יכול להיות מסומן באמצעות בנזואיל 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) אמינו) tetramethylrhodamine (ריכוז סופי 2 μM) 11-</li>
		<li>להוסיף 4 כרכים HBSS בתוספת 25 מ מ HEPES, ולאחר מכן צנטריפוגה ב g 1,000 x עבור 2 דקות ו להשליך תגובת שיקוע. Resuspend צנפה ב HBSS בתוספת HEPES 25 מ"מ עד ריכוז סופי של עונה 1 פרק 10 8 תאים/מ ל....
		<ol><li>אם משתמש אחד או יותר הפלורסנט, לשמור על אוכלוסיות תאים מופרדים עד מייד לפני הזרקת.</li>
			<li>העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים של כל צבע פתרון מקבע (1 מ"ל) פיצויים cytometry זרימה עוקבות.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>העברה של לימפוציטים <ol><li>עזים ומתנגד בשבוע 8-12-בת C57BL/6J זכר הנמען עכברים עם איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. חלות וטרינרי משחה חיה &#39; s עיניים כדי למנוע ייבוש.</li>
		<li>בקצרה מערבולת תורם תאי (1 s), העברת 1 מ"ל הזרקת מזרק עם G 27, 0.5 ב המחט, שילוב אוכלוסיות תאים עם תוויות באופן שונה, אם הדבר ישים.
		<ol><li>העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים מעורב פתרון מקבע (1 מ"ל) עבור ניתוחים cytometry זרימה עוקבות.</li>
		</ol></li> <li>מקום חיות לתורם בשכיבה. הפעילו לחץ מתון סימטרית על העור הגבי לעין, גורם של גלגל העין לבלוט מעט.</li>
		<li>לכוון את המחט medially, להזריק 100 µL של התורם תא השעיה רטרו-orbitally לתוך עכבר לכל הנמענים. גם יכול להיות מוזרק התאים דרך הווריד זנב של.</li>
		<li>בהדרגה לשלוף את המחט הזרקה, הנח העכבר לבד בתוך כלוב ההתאוששות. צג חיה עד זה שהכרתו; שהחלמת באופן מלא פעם לשוב החיה דיור חברתי.</li>
	</ol></li> <li>איסוף וניתוח <ol><li>לאחר 1 h, עזים ומתנגד הנמען עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. הקציר הטחול (או רקמות אחרות עניין) (שלב 2.1.2.) של כל הנמענים העכבר ומקום לתוך המדיה מלאה (mL/נמען 1). המתת חסד מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש. 
		הערה: מרווחי לפני הקציר רקמות יגדל הצטברות רקמת דרך לפחות 24 ח'</li>
		<li>לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-</li>
		<li>להוסיף 4 כרכים של פירוק ACK מאגר, דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. Centrifuge התליה תא ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		מאגר <li>תאים resuspend מכתים (תמיסת מלח באגירה פוספט בתוספת 1% FBS). לספור תאים ולהתאים את ריכוז הסופי של 3 x 10 7 תאים/מ ל.... להעביר 100 µL תא השעיה 96-ובכן סביב הצלחת התחתונה.</li>
		<li>הכתם תאים עבור סמני הרצוי (ראה טבלה של החומרים) לניתוח על ידי cytometry זרימה. מוסיפים נוגדנים fluorophore מצומדת (ראה טבלה של החומרים) נגד הסמנים הרצויים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך. להוסיף 100 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend בגדר ב 200 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend בגדר ב 125 µL מכתים מאגר ולרכוש דוגמאות שימוש cytometer זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים. 
		הערה: הצבע הירוק הוא נרגש על ידי 488 ננומטר לייזר, הפליטה ומתגלה עם מסננים ודיקרואיק זוהר 505 ו- 530/30. הצבע הכתום נרגש 561 nm ו הפליטה מזוהה באמצעות מסנן ודיקרואיק זוהר 582/15.
		<ol><li>שימוש הציל תאים מכל 2.1.8.2 כדי לפצות על כל הפלורסנט. 
			הערה: באמצעות פיצוי מבוסס-חרוז עם fluorophores תואמים את עירור ואת ספקטרום הפליטה של צבעים תיוג תגרום פיצוי שיוצרת.</li>
			<li>השתמש תאי קלט ששמרת משלב 2.2.2.1 במדויק לקבוע את היחס שבין באופן שונה עם התווית תאי קלט אם משתמש אחד או יותר שכותרתו האוכלוסייה ( איור 3). לחשב רקמות ספציפיות ההעברה המבוססים על היחס של תווית לתאים ללא תווית ( איור 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/protocols/4464.pdf">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2186747">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li>
<li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li>
<li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li>
<li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking%3A+chemokines+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף

כימות של נדידת תאים חיסוניים יכול להתבצע באמצעות פשוטה, מהירה מבחני גם בתוך vitro וגם ויוו. נדגים את כימוטקסיס במבחנה של ומונוציטים האדם בתגובה שיפוע MCP-1 ו הגדלת מאת סרום. In vivo, splenocytes מאתר התורם באופן שונה עם תווית, בעקבות העברת המאמצת, ששוחזרו מחיות הנמען.
שימוש בקורא צלחת יש את היתרון של דגימה מספר נקודות זמן (לעתים קרובות כמו כל 30 s) אוטומציה של כימות של העברת תאי. זה obviates הצורך לבחור נקודה פעם והערכת הימנעות שיטות יותר שדורשת ספירה ידנית ...

חסינות חסון דורש התיאום הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית מורכב של מספר עצום של סוגי תאים על מנת להגיב כראוי על פציעה, זיהום, ליצור self-tolerance. מספר הקולטנים כימוקין עשרות וליגנדים המקביל שלהם התגלו, המנגנונים המולקולריים מתן מאופיין על ידי אילו תאים מסוים ויכולה להיות מכוונת לתוך רקמה ספציפית בזמן מסוים. לפיכך, לומד כימוטקסיס והעברה היא מרכיב הכרחי של מחקר באימונולוגיה. אכן, וזמינותו שתואר במבחנה לאחרונה שימשה ככלי מיון לזיהוי קופקטור chemotactic שמאיץ כימוטקסיס של תאי-T לכיוון נוגדנים 19 ו- 21 C-C3. מטרת בשיטות המתוארות כאן הם להתיר הערכות כמותיות של תאים חיסוניים כימוטקסיס במבחנה , בתוך vivo.
וזמינותו קאמרית בוידן (נדידת תאים, הפלישה) היא שיטה זולה, הדירים מהירה להערכת תא העברה4,5. ב וזמינותו סטנדרטי, התא העליון הוא נזרע עם תאים, מופרדת באמצעות הוספה נקבובי מ. התא התחתון, שאליו העברת התאים. בזמן הרצוי, תאים היגרו בצד התחתון של הקדמי יכול להיות קבוע, עבור כימות מוכתמת מיקרוסקופ אור. אולם, מדידות כאלה להגביל איסוף נתונים נקודת סיום יחיד, שמונע את איסוף נתונים דינאמי, באפשרותך לדרוש אופטימיזציה מקיפה כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלי לניתוח. . הנה, מספר עיבודים מתוארים כי היתר בזמן אמת, כמותיים, מרובבת מדידות של כימוטקסיס במבחנה.
ללימודים ויוו , משמש נקודת סיום פונקציונלית, כלומר הצטברות תאים בתא רקמות נתון ספציפי. תאי התורם מראש שכותרתו יוכנסו חיות נמען באמצעות העברת המאמצת. אלה בתאי התורם לאחר מכן ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות הנמען. הציג גם היא אסטרטגיה משותפת תיוג המאפשר קביעת סחר לסוגי תאים שונים בתוך חיה נמען בודד. שיטה זו מבטלת את הווריאציה בין בעלי חיים הזרקת תאים, ואת חשבונות עבור הפיזיולוגיות השתנות בין בעלי חיים.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>עירור: 485 ננומטר, פליטה: תא 520 ננומטר</td></tr><tr><td> צלחת תרבות</td><td>קורנינג</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 באר</td><td>קורנינג</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>פלואורובלוק פיברונקטין הכנס</td><td>קורנינג</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר למבוגרים</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS עם סידן ומגנזיום; ללא פנול אדום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות SpectraMax M2e</td> מכשירים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr><tr><td>אולימפוס IX71 מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזותזיה</td><td>הנרי שיין בריאות בעלי חיים</td><td>11695-6776-2</td><td>הרדמה איזופלואורן</td></tr><tr><td>מסננת תאים 40um ניילון</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK מאגר ליזינג</td><td>איכותי ביולוגי</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker כתום CMTMR צבע</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>עירור: 541 ננומטר, פליטה: 565 ננומטר</td></tr><tr><td>CellTracker ירוק CMFDA צבע</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>C2925</td><td>עירור: 485 ננומטר, פליטה: 520 ננומטר</td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק</td><td>מזרק BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>מזרק TB 1 מ"ל מזרק</td><td>BD 309625</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קו תאים THP-1 ATCC</td><td></td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>סגול מבריק 421 נגד עכבר CD3 נוגדן</td><td></td><td>100228</td><td>עירור: 405 ננומטר, פליטה: 421 ננומטר</td></tr><tr><td>סגול מבריק 605 נגד עכבר CD19 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>עירור: 405 ננומטר, פליטה: 603 ננומטר</td></tr><tr><td>צלחת תחתונה עגולה 96 בארות</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>זרימה ציטומטר</td></tr></tbody></table>

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר in vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

כימוטקסיס הוא העברה לאורך כימי מסוים מעבר צבע1. נוגדנים הם ציטוקינים chemotactic לקדם סחר הסלולר עם ירידה לפרטים אנטומיים, זמני2. כימוטקסיס הוא פונקציה קריטית של לימפוציטים, תאים חיסוניים אחרים זה יכול להיות באופן כמותי מוערך ב חוץ גופית. כתב יד זה מתאר שיטות המתירים הערכת כימוטקסיס, גם במבחנה וגם ויוו, עבור סוגי תאים מגוונים כולל שורות תאים ותאים מקורית. ה במבחנה, עיצוב מבוסס על צלחת מאפשר השוואת בו-זמנית בתוך מספר תנאים בזמן אמת, ואת יכולה להסתיים תוך 1-4 ח' במבחנה assay תנאים ניתן לטפל להציג אגוניסטים ו antagonists, כמו גם להבדיל כימוטקסיס chemokinesis, וזו תנועה אקראית. עבור ויוו הערכות סחר, תאים חיסוניים יכול להיות עם צבעי פלורסנט מרובים תוויות, המשמש להעברת המאמצת. תיוג דיפרנציאלית של תאים מאפשר לאוכלוסיות לתא מעורב להיות מוחדרים החיה אותו, ובכך להקטין את השונות, להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים עבור ניסוי מופעל כראוי. הגירה לתוך רקמת הלימפה מתרחשת בתוך פחות משעה ולאחר מספר תאי רקמות ניתן לטעום. Cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות מאפשר ניתוח מהיר ולא כמותית של דפוסי הנדידה סוגי תאים מרובים.

בעת שימוש calcein-אם צבע, בדיקה ויזואלית של תאים יאשר תווית ספיגת (איור 1). קריאות פלורסנט אוטומטיות יעקבו הגירה כמו תאי המעבר אל החלק התחתון של הקדמי לאורך זמן. נתונים אלו מראים בבירור אינדוקציה של נדידת תאים לכיוון MCP-1, כמו גם על הגדלת של תגובה זו על ידי סרום (איור 2 א). בהתאם על כוחו של הגירוי נודדות, יש פער לפחות 15 דקות לפני עלייה אות. האות פלורסנט ייתכן שיא ולאחר מכן בהדרגה ירידה. זה מייצג ירידה נטו מספר התאים הקפדה על הח...

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

המטרות הכוללות של בדיקות אלו הן לכמת כימותקסיס של מונוציטים in vitro בזמן אמת ולעקוב אחר נדידת לימפוציטים in vivo. השיטה in vitro יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון מהן ההשפעות של גורמי סרום על כימותקסיס של תאי מערכת החיסון. היתרון המרכזי של הטכניקה in vitro הוא שהיא מאפשרת מדידות כמותיות ומולטיפלקס בזמן אמת.השיטה ה-in vivo יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה בנוגע לאופן שבו סוגי תאים ספציפיים נודדים בתוך בעל חיים מקבל. הטכניקה ה-in vivo שימושית במיוחד להערכה כמותית של נדידתם של סוגי תאים מרובים בתוך אותו בעל חיים. לפני תחילת הניסוי, סמנו תאי THP-1 בצבע פלואורסצנטי בתוך צלחת תרבית תאים של 35 מילימטר במדיום מלא בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.בזמן שהתאים נמצאים באינקובציה, הוסיפו 750 µL של HBSS המנוטרל עם 25 mM HEPES ו-0.1% BSA לבארות הביקורת השלילית והחיובית של פלטת 24 בארות. הוסיפו את הריכוז המתאים של MCP-1 במים בתוספת BSA לבארות הניסוי ולבארות הביקורת החיובית. מקמו אינסרטים נקבוביים בכל בארה, תוך הקפדה על כך שלשוניות האינסרטים יתאימו לחריצים שבפלטה.חשוב להסיר בועות אוויר מהבארות התחתונות לאחר הנחת התבתים (inserts), שכן בועות אלו יפריעו למדידות הפלואורסצנציה. בתום הדגירה, העבירו את התאים המסומנים לשפופרת קונוסית של 15 milliliter לצורך איסו

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

סרטון זה מדגים חקירה ניסויית של גלגול לימפוציטים על פני מודל אנדותל מחסום דם-מוח (BBB). חד-שכבה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMECs) נוצרת במבחנה, ותאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) המכילים לימפוציטים מתווספים לשכבה החד-שכבתית. לאחר מכן התאים מודגרים כדי לאפשר גלגול לימפוציטים, והתאים הנודדים מכומתים באמצעות ציטומטריית זרימה.

חקר גלגול לימפוציטים על פני חד-שכבת תא אנדותל מיקרו-וסקולרי

אנו מתארים פרוטוקול למדוד גלגול מאת ומונוציטים מעבר monolayers אנדותל אנושית ועם בגרות עוקבות שלהם לתאי קצף. זה מספק שיטה תכליתי כדי להעריך את מאפייני atherogenic ומונוציטים מבודד מאנשים עם מחלות שונות תנאים וכדי להעריך גורמים בדם אשר עשוי לשפר את הנטייה הזאת.

כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול משולב המודד מונוציט subpopulation סחר תחת זרימה במבחנה באמצעות סמני פני שטח מסוים, מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את השלבים רציפים גיוס גם לגבי פרופיל אחרים יחוברו ליקוציט באמצעות סמנים אחרים משטח מסוים.

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

. הנה, נדגים את שיטות ויוו כימות של ליקוציט יציאה מן תמימה, מודלק, והעור מאתר ממאיר. אנו לבצע השוואת עפות בשני דגמים: transdermal FITC יישום, בחיי עיר photoconversion. יתר על כן, נדגים את התועלת של photoconversion עבור מעקב אחר ליקוציט היציאה של גידולים עורית.

לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לכמת את פעילות כימוטקטיק של דם מונוציטים בדגמי העכבר, כדי להעריך את ההשפעות של התערבויות תזונתיות, תרופתי וגנטי על מונוציט דם ולאפיין את מונוציטים בדם נגזר מקרופאגים ב מודלים לעכבר באמצעות חלבון מונוציט-כימוסטנט-1 (MCP-1)-העמיסו במרתף ממברנה ממברנות ג'ל הנגזר.

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

כאן אנו מתארים שיטות באמצעות שעות הזמן, מיקרוסקופ משלב ניגודיות לעכבר התמונה מקרופאגים הצפק בתוך כימוטקטקטיקה המשלים C5a הדרגתי. ניתן להרחיב את הפרוטוקולים לתאים חיסוניים אחרים.

פקיעה זמן הדמיה של העכבר מקרופאג כימוטקסיס

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

למדו כיצד לכמת כימוטקסיס מונוציטים אנושיים במבחנה בזמן אמת ולעקוב אחרי נדידת לימפוציטים באורגניזם חי. הפרוטוקולים משתמשים בתאי THP-1 מסומנים ובמעקב פלואורסצנטי רב-ערוצי לחקר מערכת החיסון.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

גלה סרטונים נוספים