לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

המטרות הכוללות של בדיקות אלה הן לכמת כימוטקסיס מונוציטים במבחנה בזמן אמת ולעקוב אחר נדידת לימפוציטים in vivo. שיטת המבחנה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון מהן ההשפעות של גורמי סרום על כימוטקסיס של תאי חיסון. היתרון העיקרי של טכניקת המבחנה הוא בכך שהיא מאפשרת מדידות כמותיות ומולטיפלקס בזמן אמת.

שיטת in vivo יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה לגבי האופן שבו סוגי תאים ספציפיים נודדים בתוך בעל חיים מקבל. טכניקת in vivo שימושית במיוחד להערכה כמותית של נדידת סוגי תאים מרובים בתוך אותה חיה. לפני תחילת הניסוי, סמנו תאי THP-1 בצבע פלואורסצנטי בצלחת תרבית תאים בגודל 35 מילימטר בתווך שלם ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

בזמן שהתאים דוגרים, הוסף 750 מיקרוליטר של HBSS עם 25 מילי-מולרי HEPES ו-0.1% BSA לבארות הבקרה החיוביות של צלחת 24 בארות. הוסף את הריכוז המתאים של MCP-1 במים בתוספת BSA לבארות הבקרה הניסיוניות והחיוביות. והניחו תוספות נקבוביות לכל באר, תוך הקפדה על כך שהלשוניות של התוספות יתיישרו עם חריצי הצלחת.

זה קריטי להסיר בועות מהבארות התחתונות לאחר הנחת התוספות, שכן בועות יפריעו למדידות הקרינה. בתום הדגירה, העבירו את התאים המסומנים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לאיסוףם על ידי צנטריפוגה. ובדוק חזותית את הגלולה המתקבלת כדי לאשר את ספיגת הצבע.

לאחר מכן, שואבים בזהירות את הסופרנטנט ושוטפים את התאים במדיום RPMI-1640 נטול סרום בתוספת HEPES של 25 מילי-מולרי באותם תנאי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה במדיום טרי ללא סרום עם HEPES לספירה. והתאם את עוצמת הקול לריכוז סופי של אחד עד 1.5 כפול 10 לששת התאים למיליליטר.

הוסף 250 מיקרוליטר תאים לתא העליון של כל באר והנח את הצלחת בקורא צלחות של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן רכוש קריאות פלואורסצנטיות של התאים התחתונים במרווחים של דקה עד שלוש דקות באורכי גל הקרינה והפליטה המתאימים לצבע. כדי להכין את תאי התורם להעברתם לאימוץ, ראשית, קצרו את כל הטחול מעכבר C57 שחור בן שמונה עד 12 שבועות לתוך מסנן רשת ניילון בגודל 40 מיקרומטר בצלחת תרבית תאים המכילה מדיום שלם על קרח.

בעזרת קצה בוכנת מזרק, משרים בעדינות את הטחול דרך הרשת. כאשר הושג תרחיף תא בודד, העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והוסיפו ארבעה נפחים של מאגר אמוניום כלוריד אשלגן ליזה כדי לרוקן את כדוריות הדם האדומות. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה והשעו מחדש את הכדור בתווך שלם בריכוז של שניים עד חמישה פעמים 10 עד התאים השביעיים למיליליטר.

מסננים את התאים דרך רשת ניילון חדשה של 40 מיקרומטר כדי להסיר את פסולת התא. ותייגו פעם אחת 10 לשבעת התאים לכל עכבר נמען בצבע פלואורסצנטי תואם תאים חיים שיישמר לאחר הקיבוע למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים בארבעה כרכים של HBSS בתוספת HEPES.

ולהשעות מחדש את הגלולה ב-HBSS טרי בתוספת HEPES ל-10 פעמים 10 עד שמינית תאים לריכוז מיליליטר. לאחר מכן, מערבל בקצרה את תאי התורם והעמיס אותם למזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 27 בגודל 0.5 אינץ'. הניחו את העכברים השחורים C57 בני שמונה עד 12 שבועות במצב שכיבה והפעילו לחץ זנבי קל על העור הגבי לעין של החיה הראשונה, מה שגורם לגלגל העין לבלוט מעט.

כוון את המחט באופן מדיאלי להזרקה רטרו-אורביטלית של 100 מיקרוליטר של תאים תורמים. לאחר מכן, משוך בהדרגה את המחט והנח את העכבר בכלוב התאוששות אישי עם ניטור עד להחלמה מלאה. זה קריטי שבעלי החיים יעברו הרדמה מתאימה ושהליך ההזרקה תורגל היטב כדי להבטיח העברת תאים עקבית בין החיות ובין הניסויים.

עד 24 שעות לאחר ההעברה לאימוץ, קצרו את הטחול למיליליטר אחד של מדיום שלם לכל מקבל. וליצור תרחיף תאי דם בודדים נטול תאי דם אדומים כפי שהודגם זה עתה. לאחר הספירה, התאם את תרחיף התאים לשלוש פעמים 10 לריכוז שבעת התאים למיליליטר במאגר הצביעה.

והעבירו 100 מיקרוליטר תאים לבארות בודדות של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות. צבעו את התאים עבור הסמנים המעניינים על פי פרוטוקולי הניתוח הציטומטרי הסטנדרטיים של הזרימה. לאחר 20 דקות על קרח מוגן מאור, שטפו את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר צביעה והשעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעה טרי לצנטריפוגה שנייה.

לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-125 מיקרוליטר של מאגר צביעה טרי ונתחו את דגימות התאים על ציטומטר זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. קריאות פלואורסצנטיות אוטומטיות למעקב אחר נדידה מדגימות בבירור אינדוקציה של נדידת תאים לעבר MCP-1 המוגברת בנוכחות סרום. בהתאם לעוצמת הגירוי הנודד, יש פיגור של לפחות 15 דקות לפני עלייה באות הפלואורסצנטי שעשוי להגיע לשיא ולרדת בהדרגה כאשר התאים עוברים לתמיסה לתוך החדר התחתון מהצד התחתון של התוסף בקצב מהיר יותר מזה של התאים הנודדים מהתא העליון.

אם יותר מאוכלוסיית תאים אחת המסומנת באופן פלואורסצנטי מועברת באופן מאומץ, חשוב לכמת את החלק היחסי של אוכלוסיות התאים בתוך חומר הקלט כדי להסביר כל שונות בערבוב אוכלוסיות התאים. לדוגמה, בניסוי זה, היחס בין תאים פלואורסצנטיים ירוקים וכתומים היה 0.97 לאחד. הסחר כומת כמספר התאים המסומנים ששוחזרו חלקי המספר הכולל של התאים ששוחזרו.

בעוד שיש שונות ניכרת במספר התאים המשוחזרים בין בעלי חיים, עבור כל בעל חיים נתון היחס בין תאים פלואורסצנטיים ירוקים לכתומים הוא בדרך כלל שווה בערך. לאחר השליטה, ניתן להשלים את טכניקת המבחנה תוך ארבע שעות, וניתן להשלים את טכניקת in vivo תוך שש שעות אם מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מיצירת בועות בתאי הניסוי ולשאוף לעקביות במהלך ההזרקה הרטרו-אורביטלית של התאים המועברים באימוץ.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור כימוטקסיס במבחנה וב-vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ולפקח על בדיקת כימוטקסיס במבחנה בזמן אמת ולבודד לימפוציטים מקומיים לצורך העברתם לאימוץ ולמעקב אחר נדידתם in vivo. תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.